川芎紅花藥對“異病同治”缺血性腦卒中和失眠中的 機(jī)制分析

劉夢，張文靜，呂穆杰，郭閆葵

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 山東濟(jì)南 250355 2 山東省濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院 山東濟(jì)南 250000

缺血性腦卒中是因腦血管阻塞或血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，約占卒中患者總數(shù)的 75%～85%[1]。失眠是指由于人體睡眠-覺醒系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致睡眠不足或睡眠不連貫，并伴有心煩、多夢等癥狀，對失眠有憂慮或恐懼心理可形成惡性循環(huán)， 從而使癥狀持續(xù)存在[2]。失眠是腦卒中后常見的并發(fā)癥，腦卒中后失眠發(fā)病率75%～95%，缺血性腦卒中患者發(fā)病率更高[3]。同時，失眠也會增加缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，失眠會導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮性增高、下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活，使再梗死的危險(xiǎn)系數(shù)加大[4]。因此，發(fā)揮中醫(yī)中藥治療毒副作用小、無藥物依賴等的特點(diǎn)和優(yōu)勢，尋求新的治療方法改善患者的癥狀，對疾病的預(yù)后和減少復(fù)發(fā)意義重大。

川芎辛溫香燥，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品， 稱其“主中風(fēng)入腦頭痛，寒痹……”。紅花性味辛溫，為治瘀血阻滯之要藥，常與川芎相須為用。臨床上，川芎紅花常用于治療中風(fēng)病，用以活血化瘀，化痰通絡(luò)。周建偉等以活血化瘀為主的基本方 （芍藥、川芎、紅花、當(dāng)歸、生地、丹參）治療老年失眠22例， 有效率優(yōu)于對照組[5]。說明川芎紅花在治療缺血性腦卒中與失眠均有一定療效。藥理研究顯示，紅花中富含多種黃酮類、生物堿類物質(zhì)，可通過上調(diào)一氧化氮合成酶活性、清除腦自由基，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用[6]。川芎可通過抑制NF-κB 信號通路減少腦缺血后梗死面積，降低OGD膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7]。但川芎紅花治療缺血性腦卒中與失眠合病的內(nèi)在分子作用機(jī)制未見報(bào)道，應(yīng)進(jìn)入深入研究。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論探討中藥異病同治的研究也逐漸出現(xiàn)，從整體系統(tǒng)的角度闡釋了藥物異病同治的分子機(jī)制。因川芎紅花藥對對干預(yù)兩種疾病“異病同治”的內(nèi)在分子作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過“異病同治”角度來闡述川芎紅花治療缺血性腦卒中以及失眠的分子作用機(jī)制，為后續(xù)臨床以及實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

資料與方法

1 川芎-紅花有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺 https://tcmsp-e.com/）中檢索川芎、紅花，設(shè)定篩選條件為生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障穿透性BBB≥-0.3得到有效化學(xué)成分及對應(yīng)靶點(diǎn)；查找有效成分sdf結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）得到對應(yīng)靶點(diǎn)。將兩種方法得到的有效成分靶點(diǎn)信息整合，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對篩選的靶點(diǎn)進(jìn)行名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 疾病的相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測

通 過DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、DisGeneT（http://www.disgenet.org/web/DisGeneT/menu/ho）、OMIM（https://omim.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，分別以關(guān)鍵詞“Cerebral ischemic stoke”、“insomnia”檢索缺血性腦卒中以及失眠的相關(guān)基因，并將得到的基因整合去重得到疾病靶點(diǎn)。

3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），將藥物預(yù)測的靶點(diǎn)與兩種疾病預(yù)測的靶點(diǎn)取交集，獲得川芎-紅花異病同治缺血性腦卒中和失眠的共同作用靶點(diǎn)。把藥物的有效成分與共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

4 共同靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將篩選得到的共同靶點(diǎn)上傳到 String在線基因數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種選擇為人類，保存結(jié)果中的tsv文件。將文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，并利用MCODE插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 GO功能及KEGG生物通路富集分析

將潛在靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫（（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1），限定物種為人，篩選P＜0.01，分別進(jìn)行GO功能及KEGG生物通路分析，將得到的結(jié)果通過微生信在線數(shù)據(jù)分析平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/?p=5）進(jìn)行可視化。

6 分子對接

iGEMDOCK 是一個集成環(huán)境，它集成了大量修改和增強(qiáng)的內(nèi)部工具蛋白質(zhì)配體圖譜、藥理相互作用和化合物簇。藥理相互作用對于活性化合物的結(jié)合往往是必不可少的，并涉及生物機(jī)制。藥理相互作用可以減少基于能量的評分函數(shù)的不良影響，以提高 VS 的命中率[8]。其能量打分函數(shù)通過蛋白質(zhì)-化合物相互作用的靜電、氫鍵和范德華力打分，化合物分子與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，結(jié)合性越高[9]。首先導(dǎo)入從PDB數(shù)據(jù)庫（https: //www.rcsb.org/）中搜索的蛋白結(jié)構(gòu)，其次下載核心成分的mol格式文件，選擇標(biāo)準(zhǔn)對接模式進(jìn)行對接。

結(jié) 果

1 川芎-紅花有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索川芎共有189種化學(xué)成分，紅花共189種化學(xué)成分，經(jīng)篩選OB≥30%， DL≥0.18，BBB≥-0.3后得到川芎6種主要成分，紅花12種主要成分，見表1。通過swisstargetprediction數(shù)據(jù)庫及TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點(diǎn)，經(jīng)由Uniprot數(shù)據(jù)庫校對后，獲得紅花靶點(diǎn)388個，川芎靶點(diǎn)359個，合并后共有靶點(diǎn)537個。其中八氫番茄紅素、六氫番茄紅素?zé)o相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 川芎-紅花主要活性成分

2 疾病的相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測

檢索到缺血性腦卒中靶點(diǎn)共982個，失眠靶點(diǎn)共1169個。

3 共同靶點(diǎn)靶點(diǎn)預(yù)測

將川芎-紅花預(yù)測得到的537個靶點(diǎn)與疾病預(yù)測的靶點(diǎn)導(dǎo)入venny2.1.0得到共同靶點(diǎn)72個，見圖1。這些靶點(diǎn)為川芎-紅花異病同治缺血性腦卒中及失眠的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 川芎-紅花治療缺血性腦卒中及失眠的潛在靶點(diǎn)韋恩圖

4 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

把有效成分與潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)共有92個節(jié)點(diǎn)，382條邊，經(jīng)拓?fù)浞治龊蟮贸龀煞值淖畲蠖戎禐?8，度值＞15的成分有黃芩素（baicalein）、β-谷甾 醇（beta-sitosterol）、豆 甾 醇（Stigmasterol）、木 脂素（Lignan）、紅花素（Carthamidin）、川芎萘呋內(nèi)酯（Wallichilide），推測這些成分可能是藥物治療疾病的核心成分。

圖2 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

5 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將從string下載好的文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2得到共同靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)有72個節(jié)點(diǎn)，586條邊，聚類分析后共得到5個子網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)得分最高創(chuàng)建潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，共得到21個核心靶點(diǎn)，見圖4，再根據(jù)接近中心性（ClosenessCentrality）和度值（Degree）排序，排名較前的蛋白有AKT1、FOS、CASP3、APP，推測這些蛋白是川芎紅花干預(yù)卒中及失眠的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 共同靶點(diǎn)PPI作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 潛在靶點(diǎn)PPI作用網(wǎng)絡(luò)

6 KEGG分析

潛在靶點(diǎn)共涉及199條通路，根據(jù)p值由小到大進(jìn)行排序選取與人類相關(guān)的前20條通路并進(jìn)行可視化，具體信息見表2、圖5。與疾病相關(guān)的主要通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、環(huán)腺苷酸信號通路、鈣信號通路、膽堿能突觸等信號通路，并將主要信號通路可視化，見圖6-圖9。

圖5 潛在作用靶點(diǎn)的KEGG通路

圖6 神經(jīng)活性配體-受體相互作用

圖9 膽堿能突觸

表2 川芎-紅花治療缺血性腦卒中及失眠潛在作用靶點(diǎn)的KEGG通路

7 GO 分析

潛在靶點(diǎn)涉及的生物過程（BP）1314條，分子功能（MF）115條，細(xì)胞組分（CC）99條，根據(jù)富集值排序，選取前10個條目，其主要參與的生物過程有腎上腺素-去甲腎上腺素對心率的正調(diào)節(jié)作用、腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞信號、腎上腺素-去甲腎上腺素對血壓的正向調(diào)節(jié)作用等，主要分子功能有α1 -腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、腎上腺素受體活性、G蛋白偶聯(lián)的神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，主要細(xì)胞組分有多巴胺能突觸、軸膜、突觸前膜的整體成分、樹突骨架等。具體見圖10。

圖10 川芎紅花干預(yù)缺血性腦卒中及失眠的潛在靶點(diǎn)GO分析

8 分子對接

采用iGEMDOCK V2.1軟件將川芎紅花的核心成分黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、木脂素、紅花素、川芎萘呋內(nèi)酯，與篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、FOS、CASP3、APP進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果見表3，其中結(jié)合性最強(qiáng)的是APP與lignan，見圖11。

表3 成分與靶點(diǎn)對接結(jié)果

圖11 APP與lignan分子對接圖

討 論

圖7 環(huán)腺苷酸信號通路

圖8 鈣信號通路

缺血性腦卒中和失眠是兩種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。現(xiàn)代研究表明，腦缺血后會引起Ca2+內(nèi)流、神經(jīng)炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)，并激活TLR4/NF-κB信號通路、MAPK信號通路等，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生與神經(jīng)細(xì)胞凋亡，破壞血腦屏障，加重缺血性損傷[10-11]。失眠的病理機(jī)制較為復(fù)雜，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時，會調(diào)節(jié)下丘腦生物鐘節(jié)律、神經(jīng)遞質(zhì)、褪黑素以及細(xì)胞炎癥因子的生成，有多種因素共同參與，任何環(huán)節(jié)的異常均會引起失眠的發(fā)生[12]。根據(jù)兩種疾病的潛在機(jī)制聯(lián)系，為兩種疾病的交叉治療提供新方法，有助于深入理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病及尋找更有效的治療。

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)川芎紅花的主要作用成分大部分在本次研究中有所體現(xiàn)，但羥基紅花黃色素A、川芎嗪、6-羥基山奈酚因不符合篩選條件而未納入研究，說明此法仍有不充足和完善的地方，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及文獻(xiàn)整理加以補(bǔ)充。在篩選得到的主要成分中，黃芩素可顯著抑制NF-κB、i NOS、COX-2的表達(dá)及磷酸化，減少神經(jīng)炎性因子的釋放，改善氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。β-谷甾醇可通過血腦屏障，影響GABA神經(jīng)突觸通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子，并進(jìn)入線粒體，提高線粒體跨膜電位和ATP量，從而減少神經(jīng)元的凋亡[14]。除此之外，β-谷甾醇可抑制NF- κ B p65、p38 和 ERK的磷酸化，減少小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)元[15]。]木脂素可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群分泌神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽，通過腸腦軸增加腦循環(huán)中一氧化氮的水平，調(diào)節(jié)血管張力、血管舒張和血流[16]。豆甾醇能減少自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，從而表現(xiàn)出良好的抗氧化損傷作用。還可抑制 NF-κB通路，降低 NO 水平和 COX-2 表達(dá)并減少其介導(dǎo)的神經(jīng)損傷，減少促凋亡基因、caspase-3 和增加抗凋亡基因來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[17]。通過對主要化學(xué)成分的分析可發(fā)現(xiàn)成分可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減少神經(jīng)炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激達(dá)到干預(yù)疾病的目的。

本研究通過靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)提取AKT1、FOS、CASP3、APP共4個關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1能夠活化NF-κB炎癥信號通路，激活NF-κB二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)炎癥因子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致失眠的發(fā)生[18]。生物鐘基因可激活A(yù)KT信號通路調(diào)節(jié)受損的神經(jīng)細(xì)胞，同時AKT信號通路可磷酸化Clock基因，改變和Bmal1的結(jié)合，調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律[19]。C-FOS可調(diào)控氧化應(yīng)激和線粒體功能、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)缺血性卒中過程，并推測C-FOS可調(diào)控失眠大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程來調(diào)節(jié)快速動眼睡眠[20-21]。Casp-3 是內(nèi)源性和外源性凋亡途徑的匯合點(diǎn)，是凋亡的主要執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)途徑，降低腦組織中Casp-3的表達(dá)可減少缺血后腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[22]。此外，在大鼠睡眠剝奪后，會激活Casp-3，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦損傷和神經(jīng)功能障礙[23]。APP可控制GABA能突觸傳遞，對神經(jīng)元、軸突形成、樹突分支和樹突棘起營養(yǎng)作用。還可通過調(diào)節(jié)L型鈣通道調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，抑制鈣振蕩，在控制神經(jīng)元興奮性中起關(guān)鍵作用[24]。本研究表明，川芎紅花藥對主要通過調(diào)節(jié)炎癥因子、影響晝夜節(jié)律、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)來發(fā)揮治療缺血性腦卒中以及失眠的作用。

通過KEGG分析，神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路在生理學(xué)上與神經(jīng)功能的關(guān)系最為密切。cAMP通路可由5-HT1AR介導(dǎo)，調(diào)控PKA基因參與睡眠和晝夜節(jié)律調(diào)控，延長慢波睡眠和總睡眠時間，縮短入睡潛伏期，有明顯的促睡眠效應(yīng)[25]。腦缺血后會激活處于神經(jīng)元突觸位置的γ-氨基丁酸B受體（GABAB），降低細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度，妨礙神經(jīng)元突觸部位的囊泡聚集，對神經(jīng)元的內(nèi)生長狀態(tài)產(chǎn)生不利影響[26]。腦缺血時，氧化應(yīng)激損傷等原因可以增加Ca2+內(nèi)流，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，導(dǎo)致Ca2+級聯(lián)反應(yīng)， 加重缺血腦組織區(qū)細(xì)胞線粒體膜損傷，引發(fā)腦神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡。此外，胞內(nèi)Ca2+可以與Ca M結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺和去甲腎上腺素的釋放來引起缺血腦組織的血管發(fā)生強(qiáng)烈收縮，從而加重腦缺血、缺氧的程度，造成惡性循環(huán)[27]。且研究發(fā)現(xiàn)，L-型鈣通道阻斷劑可通過影響Ca2+信號通路中的下游分子蛋白激酶C和鈣調(diào)蛋白II來促進(jìn)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的催眠[28]。 基于膽堿能神經(jīng)調(diào)節(jié)和抑制全身炎癥反應(yīng)的功能提出膽堿能抗炎通路，由迷走神經(jīng)，乙酰膽堿和乙酰膽堿受體組成，可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)NF- κ B 信號通路、JAK/STAT信號通路、AMPK信號通路以及PI3K/AKT信號通路調(diào)控炎癥因子釋放，發(fā)揮抗炎作用，減輕腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的炎癥損傷[29]。這些結(jié)果可能會為增強(qiáng)缺血性腦卒中以及失眠的大腦修復(fù)提供新的治療策略。同時，GO分析的結(jié)果也提示這些信號通路或途徑是川芎紅花“異病同治”潛在作用機(jī)制。綜上所述，川芎紅花主要通過神經(jīng)活性配體-受體相互作用、環(huán)腺苷酸信號通路、鈣信號通路、膽堿能突觸等信號通路來減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，參與晝夜節(jié)律調(diào)控、調(diào)控炎癥因子釋放，發(fā)揮異病同治缺血性腦卒中、失眠的作用。

綜上，川芎、紅花可能通過多成分，多靶點(diǎn)，多通路改善缺血性腦卒中以及失眠。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接相結(jié)合的技術(shù)手段探討其改善缺血性腦卒中以及失眠的作用機(jī)制為后續(xù)深入驗(yàn)證川芎、紅花改善缺血性腦卒中以及失眠的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。但由于中藥成分復(fù)雜，數(shù)據(jù)庫中僅納入已知的成分研究，新的化學(xué)成分及分子機(jī)制未完全納入，存在一定局限性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)及計(jì)算機(jī)模擬分析的研究技術(shù)，因此對于川芎-紅花藥對的劑量、給藥時間等因素對藥效的影響，以及各項(xiàng)數(shù)據(jù)庫的納入范圍、計(jì)算方法等對于數(shù)據(jù)預(yù)測的影響，后續(xù)工作將結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以證實(shí)。