全自動(dòng)快速溶劑提取聯(lián)合GC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定農(nóng)作物土壤中5種炭疽病常用農(nóng)藥

陳 陽(yáng)

(河南省南陽(yáng)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，河南 南陽(yáng) 473000)

0 引 言

炭疽病是由半知菌亞門真菌侵染所引起，尤其是十字花科農(nóng)作物，如柑橘、辣椒、草莓、黃瓜等種植時(shí)常見的一種病害[1-6]。炭疽病主要影響農(nóng)作物的果實(shí)、果梗和葉片，在高溫高濕的條件下最適宜該病害的發(fā)病和侵染，該病害危害范圍廣、侵染時(shí)期長(zhǎng)，且不易防治、潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物落果、落葉、枯梢等，導(dǎo)致樹勢(shì)衰弱、大幅減產(chǎn)，導(dǎo)致種植戶虧損等。在農(nóng)作物種植時(shí)，種植戶為預(yù)防炭疽病的發(fā)病，常使用抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇等農(nóng)藥殺菌劑。上述農(nóng)藥殺菌劑在噴灑、施用時(shí)，僅約20%起到殺菌作用，大部分隨著生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)，如水系統(tǒng)、空氣系統(tǒng)等沉降到農(nóng)作物種植土壤中，造成土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致耕地面積減少、人類生存環(huán)境污染等。因此，監(jiān)測(cè)農(nóng)作物土壤中抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇等農(nóng)藥殺菌劑的殘留量，有助于提高農(nóng)作物合理種植、保護(hù)土壤環(huán)境等。

吳偉等研究了SPE聯(lián)合GC-MS/MS法大棚蔬菜土壤中嘧菌酯、肟菌酯、霜霉威等的檢測(cè)方法[7-11]。固相萃取法前處理步驟冗長(zhǎng)，處理過(guò)程中易造成待測(cè)農(nóng)藥殺菌劑的損失，檢測(cè)準(zhǔn)確度偏低。實(shí)驗(yàn)建立全自動(dòng)快速溶劑提取聯(lián)合GC-MS/MS法[12-16]同時(shí)測(cè)定農(nóng)作物土壤中炭疽病常用農(nóng)藥抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇微量殘留的分析方法，實(shí)驗(yàn)表明，此方法檢測(cè)準(zhǔn)確度高、步驟簡(jiǎn)單，適用于農(nóng)作物土壤中極微量農(nóng)藥殺菌劑殘留的監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

氣相色譜質(zhì)譜：島津2010 Plus氣相色譜結(jié)合TQ8040型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀:（日本島津科技公司）；電子天平：梅特勒AB135-S型（瑞士梅特勒科技公司）；色譜質(zhì)譜專用色譜柱：Rtx-5MS型石英毛細(xì)管柱（Size：30 m×0.25 mm，0.25 μm, 日本島津公司）；N-EVAP 64型氮?dú)獯蹈蓛x：（美國(guó) Organomation 科技公司）；Dionex ASE 350加速溶劑萃取儀:（美國(guó)賽默飛世爾公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇(濃度均為100 ug/mL)，均購(gòu)自杭州吉順生物科技公司；乙酸乙酯、丙酮：色譜純（美國(guó)默克試劑公司）。

1.2 儀器參數(shù)

氣相色譜：進(jìn)樣口溫度220 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。色譜柱：Rtx-5MS（Size：30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：氦氣（純度：99.999%）；柱流量：1.6 mL/min；升溫程序如下：初始溫度 45 ℃，以 18 ℃/min 的升溫速率升至 135 ℃，保持 2 min；以13 ℃/min 升至 210 ℃ 保持 3 min；最終以 22 ℃/min 的速率升至 240 ℃，保持 4 min。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源：電子轟擊源（EI）；轟擊能量：70 eV；離子源溫度: 270 ℃；傳輸線溫度: 270 ℃；碰撞氣：氬氣（純度：99.999%）；溶劑延遲時(shí)間：4 min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.3 樣品制備

1.3.1 樣品溶液

土壤預(yù)處理：隨機(jī)采集農(nóng)作物土壤1000 g左右，將石塊、植物根、莖殘留等雜物去除干凈，在25 ～35 ℃自然風(fēng)干，反復(fù)碾碎使其全部通過(guò)2 mm篩網(wǎng)，過(guò)篩后的土壤樣品置干凈的容器中，蓋好備用。

稱取10.0 g預(yù)處理的土壤樣品，再加硅藻土約10 g，兩者混合均勻后置快速溶劑萃取池中，按以下設(shè)定的ASE程序進(jìn)行提取:萃取溫度：70 ℃，加熱時(shí)間：10 min；提取溶劑：丙酮：乙酸乙酯（V∶V=1∶1）；萃取壓力：10 kPa, 提取時(shí)間：8 min，沖洗體積：60%，循環(huán)次數(shù)：5次，氮?dú)獯祾撸? min。提取液置 45 ℃氮吹儀濃縮至近干，殘?jiān)? mL丙酮溶解，渦旋后，過(guò)0.22 μm濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

取100 μg/mL的抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，用丙酮配制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用丙酮稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.05 ，0.1 ，0.5 ，1.0 ，2.0 ，5.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，搖勻，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先選擇全掃描模式（Q3SCAN）對(duì) 10 μg/mL的抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，找到各農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的母離子和保留時(shí)間。再以產(chǎn)物離子掃描模式（PRODUCT SCAN）對(duì)母離子進(jìn)行掃描，得到相應(yīng)的特征離子。選擇響應(yīng)較高的離子對(duì)作為定量離子，另選2組離子定性。根據(jù)出峰時(shí)間分組檢測(cè)，保留時(shí)間相近的化合物被安排在同一組掃描檢測(cè)。打開“MRM_Optimization_Tool”優(yōu)化工具，輸入碰撞電壓范圍和電壓間隔，自動(dòng)優(yōu)化，最終確立各組分的最佳CE電壓和豐度比值。由此創(chuàng)建多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)方法。確定后的參數(shù)見表1，典型譜圖見圖1。

表1 質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)

圖1 5種農(nóng)藥殘留的色譜質(zhì)譜圖

2.2 前處理方法的選擇

土壤基質(zhì)成分較為復(fù)雜（通常含有大量的無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)鹽，如硅酸鹽、金屬氧化物等），而土壤中農(nóng)藥殘留的含量又比較低，選擇一種高效的萃取方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度至關(guān)重要。索氏提取法是一種經(jīng)典萃取方法，一般采用無(wú)水乙醚和石油醚提取農(nóng)藥；由于其萃取耗時(shí)太長(zhǎng)（一般6～8 h）和使用溶劑量大，現(xiàn)在已很少采用。超聲提取法操作簡(jiǎn)便，但超聲過(guò)程易造成待測(cè)農(nóng)藥的損失，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度偏低。加速溶劑萃取法是近年來(lái)用的較廣的一種自動(dòng)萃取技術(shù)，該方法萃取時(shí)間短，僅使用少量的溶劑就能得到較高的回收效率。實(shí)驗(yàn)研究了超聲萃取和加速溶劑萃取對(duì)農(nóng)藥殘留的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加速溶劑萃取法所得農(nóng)藥殘留回收率優(yōu)于超聲萃取法。結(jié)果見表2。

表2 前處理方法比較結(jié)果

2.3 萃取條件的優(yōu)化

萃取溫度：合適的溫度可加速目標(biāo)分析物快速被萃取到有機(jī)溶劑中，保證目標(biāo)物的萃取效率最大化。本文保持其他萃取條件不變，考察60～90 ℃的萃取溫度對(duì)農(nóng)藥殘留回收效率的影響。實(shí)驗(yàn)以5種待測(cè)農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.1 mg/kg的測(cè)試樣品為研究對(duì)象，分別考察 60，70，80，90 ℃ 時(shí)萃取效果。研究表明：隨著溫度的升高，農(nóng)藥回收率相繼增加；溫度為70 ℃和80 ℃時(shí)，回收率變化不是很大，溫度90 ℃時(shí)回收率有所下降。因此，選擇70 ℃作為最終萃取溫度。溫度影響見表3。

表3 萃取溫度影響比較

萃取時(shí)間：萃取時(shí)間也對(duì)萃取結(jié)果有很大的影響。萃取時(shí)間不夠，目標(biāo)物的萃取效率偏低；萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響檢測(cè)效率。實(shí)驗(yàn)以5種待測(cè)農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.1 mg/kg的測(cè)試樣品為研究對(duì)象，分別考察萃取時(shí)間為 6，7，8，9 min對(duì)農(nóng)藥萃取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取時(shí)間為8 min時(shí)回收率最高，8 min后萃取效率變化不大。為提高分析檢測(cè)效率，選擇萃取時(shí)間為8 min。時(shí)間影響見表4。

表4 萃取時(shí)間影響比較

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限

按照1.2項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置檢測(cè)方法，待各條件穩(wěn)定就緒后，進(jìn)樣1.3.2項(xiàng)下配制的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各1 μL；以各農(nóng)藥定量離子色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)（y），對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制工作曲線，得到相應(yīng)的曲線方程和相關(guān)系數(shù)；再以3倍信號(hào)噪聲比值 (S/N)所對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為各農(nóng)藥的檢出限。具體結(jié)果見表5。

表5 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度測(cè)試

按照1.2設(shè)置儀器參數(shù)，在儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，以不含以上5種農(nóng)藥殘留的空白土壤樣品做基質(zhì)，在0.05～5.0 μg/mL 線性范圍內(nèi)進(jìn)行低 (0.01 mg/kg)、中 (0.1 mg/kg)、高 (1.0 mg/kg)三個(gè)濃度點(diǎn)的加標(biāo)測(cè)試。按1.3的樣品處理步驟處理樣品并進(jìn)樣測(cè)試，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和理論加入量計(jì)算回收率。另外，每個(gè)濃度點(diǎn)的樣品平行進(jìn)樣6次，考察6次進(jìn)樣儀器的精密度測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 回收率與精密度結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)考察

以不含以上5種農(nóng)藥殘留的空白土壤樣品做基質(zhì)，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，使其在樣品中的最終濃度分別為0.1 mg/kg，按照1.3.1的處理方式對(duì)樣品進(jìn)行處理，同法配制6份溶液；按1.2儀器參數(shù)設(shè)置氣相色譜和質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣上述重復(fù)性溶液各1 μL，計(jì)算重復(fù)性測(cè)試結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示：抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇5種農(nóng)藥重復(fù)性結(jié)果的RSD分別為3.2%、2.7%、3.8、4.1%和2.9%。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)試

實(shí)驗(yàn)抽取柑橘、黃瓜、草莓三種不同作物的種植土壤，按照以上建立的優(yōu)化方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：柑橘和草莓種植土壤分別檢出抑霉唑（0.004 mg/kg）和咪鮮胺（0.005 mg/kg），均在檢出限以內(nèi)。樣品的特征離子圖見圖2。

圖2 實(shí)際樣品測(cè)試特征離子圖

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)以農(nóng)作物土壤為研究對(duì)象，建立了采用全自動(dòng)快速溶劑萃取提取土壤中炭疽病常用農(nóng)藥抑霉唑、咪鮮胺、醚菌酯、吡唑醚菌酯和己唑醇，GCMS/MS法定性、定量檢測(cè)的分析方法。與其他學(xué)者研究的SPE前處理方法進(jìn)行了研究比較，證明全自動(dòng)快速溶劑萃取法具有前處理速度快、提取效果好等優(yōu)點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)化了方法的質(zhì)譜條件、前處理?xiàng)l件，并考察了方法的線性、加標(biāo)回收等，證明了此方法自動(dòng)化程度高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、溶劑用量少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法適用于農(nóng)作物土壤中痕量炭疽病用藥殘留的監(jiān)測(cè)，為指導(dǎo)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)投入品使用和保護(hù)農(nóng)作物土壤環(huán)境提供技術(shù)參考。