氨基柱高效液相色譜法檢測大豆提取物中的磷脂酰膽堿

王 瑞， 段旭林， 張琦弦， 呂遠(yuǎn)平， 何 強(qiáng)， 遲原龍

(四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065)

0 引 言

磷脂作為一種復(fù)合脂，是指含有磷酸的脂類。其作為一種從動(dòng)植物組織中提取得到的混合物，主要由磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines, PC）、磷脂酰肌 醇 （phosphatidyl inositol, PI） 、 磷 脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidyl ethanolamine, PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）、鞘磷脂（sphingomyelin,SM）[1]等成分構(gòu)成。其中，磷脂酰膽堿具有提高記憶力[2]、降低血清膽固醇[3]、抗氧化[4]等多種功效，在食品、畜牧業(yè)、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[5-8]有著較為廣泛的應(yīng)用。

目前，磷脂酰膽堿的檢測方法有高效液相色譜法[9]、鉬藍(lán)比色法[10]、薄層色譜法[11]、核磁共振法[12]等。鉬藍(lán)比色法檢測的是總磷脂含量，薄層色譜法進(jìn)行的是半定量分析且干擾因素較多，核磁共振法會(huì)對磷脂分子造成破壞，檢測成本高，存在一定的局限性。與這些方法相比，高效液相色譜法同時(shí)兼具操作簡單、不會(huì)破壞磷脂分子等優(yōu)點(diǎn)，近年來在檢測磷脂酰膽堿方面應(yīng)用得較為廣泛。而磷脂酰膽堿作為一種極性脂，十八烷基鍵合硅膠色譜柱（C18）等反相色譜柱對其保留、分離能力較弱。在目前相關(guān)研究中，所用的分離色譜柱主要集中在硅膠柱，硅膠柱的極性很強(qiáng)，是一種正相色譜柱，流動(dòng)相多采用正己烷-異丙醇-水/酸等三元體系，較為繁瑣[13-15]。氨基柱是一種以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合了氨丙基的色譜柱。與硅膠柱相比，氨基柱的極性更弱，可同時(shí)適用于正相和反相溶劑，且可基于極性吸附和弱陰離子交換兩種作用對分離物質(zhì)達(dá)到保留作用。本實(shí)驗(yàn)采用氨基色譜柱在反相條件下對大豆提取物中的磷脂酰膽堿進(jìn)行檢測，以極性較強(qiáng)的乙腈-水二元體系作為流動(dòng)相，旨在提供一種簡單、快速的磷脂酰膽堿檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（市購）；乙腈（色譜級，美國Sigma公司）；丙酮（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；乙醇（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）；磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品（P7443，純度≥99%，美國Sigma公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SHISEIDO CAPCELL PAK UG80 氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；FA2204C電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；TGL-16型冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水=80∶20（V/V）；檢測波長：206 nm；流量：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：30 ℃；以峰面積為指標(biāo)進(jìn)行定量分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品9.68 mg，用無水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為96.80 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液。準(zhǔn)確吸取磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)母液 4，8，12，16，20 mL，用無水乙醇進(jìn)行梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為7.744，15.488，23.232，30.976，38.720 mg/L 的磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)工作液。置冰箱中–20 ℃儲藏備用。

1.3.3 大豆提取物的制備

將大豆洗凈干燥后，粉碎，100目過篩，得到大豆粉。準(zhǔn)確稱取大豆粉60.08 g，加入3倍體積丙酮脫脂，得到脫脂大豆粉。按料液比為8∶1（mL/g）加入無水乙醇超聲提取1 h，離心分離上清液。將上清液于40 ℃進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并用4 ℃的丙酮沉降。將得到的沉淀物真空干燥后，即得到粉末狀的大豆提取物。

1.3.4 提取物待測溶液的制備

準(zhǔn)確稱取大豆提取物10 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，置冰箱中–20 ℃儲藏備用。

1.3.5 大豆提取物中磷脂酰膽堿含量的計(jì)算

按照下式計(jì)算大豆提取物中磷脂酰膽堿的含量：

式中：C?大豆提取物中磷脂酰膽堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

ρ——經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得的提取物樣品溶液中磷脂酰膽堿的濃度，mg/mL；

V ——提取物樣品溶液的體積，mL；

M——提取物的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相比例的確定

探究了流動(dòng)相比例對磷脂酰膽堿保留時(shí)間的影響。如圖1所示，當(dāng)流量為1.0 mL/min時(shí)，以乙腈∶水=85∶15（V/V）為流動(dòng)相，磷脂酰膽堿的保留時(shí)間為 4.852 min；乙腈∶水=80∶20（V/V）為流動(dòng)相，磷脂酰膽堿的保留時(shí)間為 4.410 min；乙腈∶水=75∶25（V/V）為流動(dòng)相時(shí)，磷脂酰膽堿的保留時(shí)間為4.068 min。結(jié)果表明，降低乙腈的比例會(huì)使磷脂酰膽堿保留時(shí)間提前，但過低的乙腈比例會(huì)導(dǎo)致磷脂酰膽堿與其他物質(zhì)分離不開，同時(shí)考慮到氨基柱的水相比例不宜太高，最終確定流動(dòng)相比例為乙腈∶水=80∶20（V/V）。

圖1 不同流動(dòng)相比例下磷脂酰膽堿的色譜圖

2.1.2 流速的選擇

考察了流速對磷脂酰膽堿保留時(shí)間的影響。如圖2所示，在流量為1 mL/min條件下，磷脂酰膽堿的保留時(shí)間為 4.410 min；流量為 0.8 mL/min 條件下，磷脂酰膽堿的保留時(shí)間為5.292 min。流速越大，磷脂酰膽堿出峰時(shí)間越早，考慮到分離效果與溶劑消耗，最終確定流量為0.8 mL/min。目前文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂酰膽堿保留時(shí)間集中在9～40 min 之間[14, 16-17]，本實(shí)驗(yàn)條件下磷脂酰膽堿的保留時(shí)間更短，檢測更加快速。

圖2 不同流速下磷脂酰膽堿的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢出限的確定

依次取上述不同濃度的磷脂酰膽堿系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣進(jìn)行檢測。以磷脂酰膽堿的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。結(jié)果表明，磷脂酰膽堿的濃度與峰面積在7.744～38.720 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=49.587x+196.34，相關(guān)系數(shù)r2=0.9996。以3倍信噪比（S/N）作為檢出限確定標(biāo)準(zhǔn)，最終確定檢出限為1.54 mg/L。

圖3 磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按1.3.1中的條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測得峰面積并計(jì)算RSD值，檢測儀器的精密度。結(jié)果如表1所示，RSD為0.65%，表明儀器精密度良好，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 進(jìn)樣，檢測并記錄峰面積，檢測樣品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果如表2所示。RSD為0.79%，表明該樣品溶液在0～12 h 內(nèi)較為穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

采用外標(biāo)法檢測回收率。選擇已知濃度的提取物樣品溶液，向其中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成低、中、高三種濃度加標(biāo)回收樣品。按50 μL進(jìn)樣量進(jìn)樣，平行測定3次，根據(jù)結(jié)果計(jì)算磷脂酰膽堿的回收率及其RSD值。結(jié)果如表3所示，在低、中、高三種濃度下加標(biāo)回收率在98.37%～103.62%之間，平均加標(biāo)回收率為100.39%，RSD為1.67%，表明該方法準(zhǔn)確，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品檢測

按照1.3.4中的方法平行配置6份樣品溶液，以50 μL進(jìn)樣量進(jìn)樣，檢測峰面積并代入線性回歸方程中計(jì)算磷脂酰膽堿含量，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，按本實(shí)驗(yàn)方法提取的大豆粗提物中磷脂酰膽堿含量為16.31%。

表4 樣品檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)建立了一種基于氨基色譜柱，利用高效液相色譜檢測大豆提取物中磷脂酰膽堿的方法。經(jīng)該方法檢測，無水乙醇提取的大豆提取物中磷脂酰膽堿的含量為16.31%。經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法加標(biāo)回收率在98.37%～103.62%之間，準(zhǔn)確度較高，且具有較高的精密度和良好的穩(wěn)定性。目前，大多數(shù)磷脂酰膽堿的高效液相色譜檢測方法的流動(dòng)相采用三元體系，較為繁瑣，保留時(shí)間也較長。本實(shí)驗(yàn)以乙腈-水二元體系作為流動(dòng)相，操作簡單便捷；磷脂酰膽堿的保留時(shí)間在6 min內(nèi)，縮短了磷脂酰膽堿的保留時(shí)間，檢測效率高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可豐富卵磷脂中磷脂酰膽堿的檢測方法，為磷脂酰膽堿的高效檢測提供參考。