野生藤茶資源的鑒別及指紋圖譜評價

張朝陽,馬世龍,秦邦,向班貴,胡百順*,陳永波,劉瑤,陳娥

野生藤茶資源的鑒別及指紋圖譜評價

張朝陽1,馬世龍1,秦邦1,向班貴2,胡百順1*,陳永波1,劉瑤1,陳娥1

1. 恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 湖北 恩施 445000 2. 恩施州鳳鳴藤茶有限公司, 湖北 恩施 445000

為建立藤茶資源植物形態(tài)、顯微、薄層色譜鑒別方法，評價篩選出推薦資源，本研究以收集栽種的13個野生藤茶資源為研究對象，通過比對植物形態(tài)特征、粉末顯微特征、薄層色譜特征斑點、指紋圖譜相似度進行鑒別，同時利用指紋圖譜比對的10個共有峰，進行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析。結(jié)果表明：13個野生資源均為顯齒蛇葡萄（），但不同資源間植物形態(tài)、薄層色譜、指紋圖譜有所差異；顯齒蛇葡萄快速分類檢索包含了蛇葡萄屬植物分類要點；各資源粉末顯微特征差異較?。桓髻Y源薄層色譜相應(yīng)位置斑點基本一致，但顏色深淺有所不同；主成分分析共提取3個主成分，方差累計貢獻率91.583%，同時建立資源評價模型=0.577791+0.219762+0.118273；聚類分析將13個資源聚為4類，類群III評分最高，類群IV評分最低。評價篩選出貴州江口、江西定南、廣西三江野生藤茶資源作為推薦資源。

野生藤茶; 植物形態(tài); 指紋圖譜

藤茶，是由葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[(Hand.-Mazz.)W. T. Wang]嫩莖葉制成的代用茶，俗稱莓茶、藤婆茶、龍須茶、神仙草等，在我國長江流域以南的多個省區(qū)廣有分布。藤茶在《全國中草藥匯編》、《救荒本草》、《中華本草》等中醫(yī)古籍中多有記載，并于2013年被國家衛(wèi)計委批準(zhǔn)成為新食品原料，是一種典型的藥食兩用植物資源，素有“三兩黃金一兩茶”的美譽，現(xiàn)已成為湖北恩施、湖南張家界等地特色產(chǎn)業(yè)。

目前，藤茶相關(guān)研究主要集中在抗氧化活性、二氫楊梅素測定、藥理作用等方面[1-7]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、指紋圖譜等方面也有所報道。石依姍[8]、李瑛琦[9]、劉俊奇[10]等對藤茶進行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，初步建立了藤茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，劉建新[11]、曾祥燕[12]等對藤茶進行了植物形態(tài)、粉末顯微、薄層色譜等生藥學(xué)鑒別，汪秋蘭[13]、范莉[14]、蘇素嬌[15]等對藤茶進行了指紋圖譜研究并建立了相關(guān)評價模式。

藤茶評價研究多以異地或本地收集樣品為研究對象，未發(fā)現(xiàn)異地野生資源本地栽種評價的相關(guān)研究。本研究將收集的各省份野生藤茶資源引進栽種后對資源進行評價，避免了先評價產(chǎn)品后引進資源最終不適宜本地推廣栽種的弊端，同時利用生藥學(xué)手段對野生藤茶資源進行植物形態(tài)、顯微、薄層色譜、指紋圖譜鑒別，利用主成分分析和聚類分析對指紋圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析評價，最終篩選出推薦資源，以期對藤茶特色產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

恩施州農(nóng)科院2018-2020年從湖南張家界、貴州江口、湖北恩施、重慶酉陽、福建長汀等地收集13個野生藤茶資源，當(dāng)年扦插于湖北省來鳳縣大河鎮(zhèn)兩河口村藤茶基地資源圃，編號T1-T13，按照《藤茶生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》[16]標(biāo)準(zhǔn)化種植管理，2021年7月采摘嫩葉，采摘后24 h內(nèi)蒸汽殺青2 min，50 ℃烘干，粉碎、過40目篩，密封避光保存，樣品信息見表1。

表 1 野生藤茶資源樣品信息

二氫楊梅素（源葉生物，Y25A6K1）；楊梅素（源葉生物，YM0311YA13）；楊梅苷（源葉生物，DO1031EA14）；花旗松素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，D2014038）。

1.2 儀器設(shè)備

UltiMate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；EX31生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；SQP分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；BGZ-240恒溫干燥箱（上海博訊儀器有限公司）；SB-5200超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；PCDX-W-10超純水器（成都品成科技有限公司）；G型硅膠板（青島海洋化工有限公司）；C18色譜柱（Kromasil，4.6 mm×250 mm/5 μm）。

1.3 試驗方法

顯微、薄層色譜鑒別：參照《中國藥典》[17]執(zhí)行。

指紋圖譜：參照汪秋蘭等[13]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步處理后，采用SPSS 22.0軟件進行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析，指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012進行相似度評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物形態(tài)鑒別

石依姍等[18]通過文獻考證和資源調(diào)查，確認(rèn)藤茶植物基原為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄。本研究根據(jù)《中國植物志》[19]葡萄科蛇葡萄屬植物形態(tài)特征，建立顯齒蛇葡萄快速鑒別分類檢索。

1葉為單葉，葉片不裂或不同程度3-5裂，但不深裂至基部成全裂片…… 尖齒蛇葡萄、藍果蛇葡萄等

1葉為掌狀復(fù)葉或羽狀復(fù)葉………………………………………………………………………………… 2

2葉為3-7掌狀復(fù)葉………………………………………………………… 三裂蛇葡萄、烏頭葉蛇葡萄等

2葉為羽狀復(fù)葉……………………………………………………………………………………………… 3

3小枝、葉柄和花序軸被長柔毛或短柔毛…………………………………… 廣東蛇葡萄、毛枝蛇葡萄等

3小枝、葉柄和花序均無毛………………………………………………………………………………… 4

4葉干時兩面不同色，上深下淺，小葉邊緣全緣或有細鋸齒………………… 羽葉蛇葡萄、粉葉蛇葡萄

4葉干時兩面同色，小葉邊緣有明顯粗鋸齒……………………………………………………………… 5

5卷須3分枝；小葉片較大，長4-12 cm，寬2-6 cm………………………………………… 大葉蛇葡萄

5卷須2叉分枝；小葉片較小，長2-5 cm，寬1-2.5 cm…………………………………… 顯齒蛇葡萄

由此可知，顯齒蛇葡萄形態(tài)特征為：羽狀復(fù)葉，小枝、葉柄和花序均無毛，葉干時兩面同色、小葉邊緣有明顯粗鋸齒，卷須2叉分枝，小葉片較小，長2～5 cm、寬1～2.5 cm。觀察記錄收集的13個野生藤茶資源植物形態(tài)特征并與顯齒蛇葡萄快速分類檢索進行比對，兩者基本相符，但不同資源間小葉片大小、數(shù)目、邊緣鋸齒數(shù)等有所不同，說明收集的13個野生藤茶資源均為顯齒蛇葡萄，但資源間形態(tài)特征有所差異，引進栽種的顯齒蛇葡萄見圖1。

圖1 顯齒蛇葡萄

2.2 顯微鑒別

圖 2 藤茶粉末顯微圖

注：A. 草酸鈣針晶；B. 螺紋導(dǎo)管；C. 梯紋導(dǎo)管；D. 柵欄組織碎片

Note: A. acicular crystal; B. threaded conduit; C. ladder catheter; D. palisade tissue fragment

利用水合氯醛透化法制作臨時裝片，發(fā)現(xiàn)各資源粉末顯微特征差異較小，如圖2所示：粉末呈綠色、棕色不等；草酸鈣針晶多見，長40～80 μm，成束或散在；草酸鈣簇晶多見，直徑15～30 μm；螺紋導(dǎo)管多見，梯紋導(dǎo)管可見；單細胞非腺毛可見，長30～65 μm；纖維可見，壁平直或彎曲，具隔；柵欄組織碎片可見；氣孔可見，為不定式；淀粉?？梢?、多為單粒。

2.3 薄層色譜鑒別

參考曾祥燕等[12]色譜條件并根據(jù)實際情況進行優(yōu)化：取樣品粉末1 g，加甲醇10 mL，搖勻，密封避光冷浸12 h，濾過，取續(xù)濾液稀釋2倍即為供試品溶液。另取楊梅苷、二氫楊梅素、花旗松素對照品，分別加甲醇制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。按照《中國藥典》[17]規(guī)定，用點樣毛細管吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一G型硅膠薄層板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸（5:4:1，體積比）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%三氯化鐵乙醇溶液，日光燈下檢視。結(jié)果表明，藤茶供試品色譜主要斑點分離度較好，無明顯重合，供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)位置上均顯示相同顏色斑點，易混品色譜在相應(yīng)位置無斑點顯現(xiàn)，說明薄層色譜條件良好；各供試品色譜相應(yīng)位置斑點基本一致，顏色深淺有所不同，T3、T5供試品色譜在二氫楊梅素相應(yīng)位置斑點明顯淡于其他供試品色譜，說明13個供試品為同一植物資源，但各資源間黃酮類物質(zhì)含量有所不同，詳見圖3。

圖 3 藤茶薄層色譜圖

注：1-3. 對照品楊梅苷、二氫楊梅素、花旗松素；4-16. 供試品T1-T13；17-18. 同科易混品

Note: 1-3. myricitroside, dihydromyricetin, taxifolin; 4-16. test samples T1-T13; 17-18. samples of the same family

2.4 指紋圖譜

參照汪秋蘭等[13]的方法測定指紋圖譜，將13個野生藤茶資源的指紋圖譜轉(zhuǎn)成CDF格式，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012，以T1為參照圖譜，經(jīng)多點校正、全譜峰匹配，共確定10個共有峰，與對照品色譜圖比對，由圖4可知：3號峰為二氫楊梅素、5號峰為花旗松素、7號峰為楊梅苷、8號峰為楊梅素，且供試品二氫楊梅素峰面積、峰高遠遠大于其他色譜峰。

圖4 藤茶指紋圖譜

注：S1. 供試品；S2. 對照品；3. 二氫楊梅素；5. 花旗松素；7. 楊梅苷；8. 楊梅素

Note: S1. test sample; S2. reference substance; 3. dihydromyricetin; 5. taxifolin; 7. myricitroside; 8. myricetin

2.4.1 相似度評價以全譜峰匹配的10個共有峰生成對照圖譜，計算相似度，發(fā)現(xiàn)13個野生藤茶資源的相似度在0.995～1.000之間，說明各資源間具有較好的相似度，成分組成基本一致，各資源指紋圖譜見圖5?？紤]到各資源二氫楊梅素峰面積均遠高于其他色譜峰，二氫楊梅素峰面積可掩蓋各資源其他色譜峰之間的差異性，因此以屏蔽二氫楊梅素峰后的9個共有峰生成對照圖譜，計算相似度，發(fā)現(xiàn)13個野生藤茶資源的相似度在0.746～0.999之間，且除T3、T5相似度分別為0.746、0.800外，其他資源相似度均在0.988以上，說明除T3、T5外，其他各資源無論是全譜峰還是屏蔽二氫楊梅素后的色譜峰均具有較好的相似度，T3、T5屏蔽二氫楊梅素后的色譜峰與其他資源間有較大差異。

圖 5 藤茶資源疊加色譜圖

2.4.2 描述性分析將13個藤茶資源指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入Excel 2003，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)，由表2可知，10個色譜峰峰面積變異系數(shù)在25.04%～47.79%之間，變異系數(shù)均大于20%，說明藤茶資源各共有成分含量差異較大。

表 2 藤茶資源指紋圖譜共有峰描述性分析

2.4.3 相關(guān)性分析將13個藤茶資源指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進行相關(guān)性分析，由表3可知，峰3與峰4、峰3與峰5、峰3與峰6、峰3與峰9、峰4與峰5、峰4與峰6、峰4與峰9、峰5與峰6、峰5與峰9、峰6與峰9、峰7與峰10呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）；峰3與峰7、峰3與峰10、峰4與峰7、峰4與峰10、峰5與峰7、峰5與峰10呈極顯著負相關(guān)（＜0.01）；峰1與峰8、峰6與峰7、峰6與峰10、峰7與峰9、峰9與峰10呈顯著負相關(guān)（＜0.05）。

表 3 藤茶資源指紋圖譜共有峰相關(guān)性分析

注：*在0.05水平顯著相關(guān)；**在0.01水平極顯著相關(guān)。

Note: *significant correlation at＜0.05; **extremely significant correlation at＜0.01.

2.4.4 主成分分析將藤茶資源指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進行主成分分析，根據(jù)特征值大于1的原則，共提取出3個主成分，由表4可知，3個主成分特征值分別為5.778、2.198、1.183，主成分方差貢獻率分別為57.779%、21.976%、11.827%，累計貢獻率91.583%，大于85%，可解釋藤茶成分的大部分信息，因此選擇前3個主成分對藤茶進行綜合評價。

根據(jù)載荷系數(shù)絕對值大于0.8的原則，由表4可知，對主成分1影響較大的峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰9、峰10，其中峰3、峰4、峰5、峰6、峰9具有較大正載荷量，峰7、峰10具有較大負載荷量；對主成分2影響較大的是峰1，具有較大負載荷量；對主成分3影響較大的是峰2，具有較大正載荷量。

表 4 主成分向量載荷系數(shù)、特征值和方差貢獻率

利用SPSS 22.0軟件對色譜峰峰面積進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)合表5中主成分特征向量可得主成分回歸方程：

1=0.0411+0.0272+0.1703+0.1584+0.1595+0.1476-0.1567-0.0048+0.1459-0.15710

2=-0.4041-0.2032+0.0393+0.1004+0.0965+0.0966+0.1717+0.3538+0.1839+0.18110

3=0.0811+0.7332-0.0863-0.0854+0.1155-0.0016+0.0467+0.5208-0.0409-0.01010

以各主成分對應(yīng)的方差貢獻率為權(quán)重，得出藤茶資源綜合評價模型表達式為：=0.577791+0.219762+0.118273

由評價模型計算出藤茶資源各主成分得分、綜合得分、排名，由表6可知，13個藤茶資源綜合得分及排名依次為T1、T4、T8、T2、T12、T7、T9、T13、T10、T11、T6、T5、T3。

表 5 主成分特征向量

表 6 藤茶資源綜合得分及排名

2.4.5 聚類分析將藤茶資源指紋圖譜共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，標(biāo)準(zhǔn)化處理后進行聚類分析，聚類方法采用瓦爾德法，聚類區(qū)間為平方歐式距離，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)歐式距離為4時，可將13個藤茶資源聚為4大類群，類群I有4個藤茶資源，分別為T8、T9、T11、T13，類群II有4個藤茶資源，分別為T6、T7、T10、T12，類群III有3個藤茶資源，分別為T1、T2、T4，類群IV有2個藤茶資源，分別為T3、T5。

對各類群藤茶資源色譜峰峰面積計算平均值和變異系數(shù)，由表7可知，類群I中藤茶資源各峰面積居中，但峰1、峰2峰面積高于其他類群，峰7、峰10峰面積低于其他類群；類群II中藤茶資源各峰面積居中，但峰2、峰8峰面積低于其他類群；類群III中藤茶資源峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰9峰面積高于其他類群，峰1峰面積低于其他類群；類群IV中藤茶資源峰7、峰10峰面積高于其他類群，峰3、峰4、峰5、峰6、峰9峰面積低于其他類群。同時由各類群共有峰峰面積變異系數(shù)可知，除類群I中峰1、峰8，類群II中峰10，類群III中峰6、峰8，類群IV中峰1、峰3、峰5、峰6外，其余共有峰峰面積變異系數(shù)均小于20%，其中類群IV中有4個色譜峰峰面積變異系數(shù)大于20%，主要是由于類群IV只有T3、T5兩個樣本，樣本數(shù)量少導(dǎo)致的，所以聚類分析劃分的四個類群基本合理。

圖 6 藤茶資源聚類分析圖

表 7 不同類群藤茶資源色譜峰特征

3 討 論

野外資源調(diào)查時，往往需要比較明顯的形態(tài)特征作為參考依據(jù)來確定植物種類[20]，本研究建立了顯齒蛇葡萄快速分類檢索，可大大提高野外鑒別顯齒蛇葡萄的效率。

顯齒蛇葡萄富含黃酮類物質(zhì)，被譽為植物界的“黃酮之王”，張學(xué)英[21]發(fā)現(xiàn)藤茶中總黃酮含量高達300～400 g/kg，二氫楊梅素含量占總黃酮含量的70～80%，從本研究薄層色譜圖可明顯觀察到供試品二氫楊梅素斑點顏色遠遠深于其他斑點，藤茶資源T3、T5二氫楊梅素斑點顏色淺于其他資源，結(jié)合指紋圖譜共有峰主成分分析，二氫楊梅素含量最高的資源T1綜合排名第1，二氫楊梅素含量較低的資源T3、T5綜合排名最后，表明二氫楊梅素含量是決定藤茶品質(zhì)的重要指標(biāo)，這與其他相關(guān)研究具有較好的一致性。

指紋圖譜能比較全面地反應(yīng)研究對象物質(zhì)組成及各物質(zhì)間量化關(guān)系，本研究指紋圖譜相似度評價發(fā)現(xiàn)，10個共有峰相似度在0.995～1.000之間，屏蔽二氫楊梅素峰后的相似度在0.746～0.999之間，且除T3、T5相似度分別為0.746、0.800外，其他資源相似度均在0.988以上，同時共有峰峰面積變異系數(shù)表明10個色譜峰峰面積變異系數(shù)均大于20%，說明不同藤茶資源物質(zhì)組成基本一致，但共有成分含量差異較大，這與范莉等[14]、蘇素嬌等[15]的研究基本一致。

對藤茶資源指紋圖譜的10個共有峰進行主成分分析和聚類分析，共提取出3個主成分，方差累計貢獻率91.583%，根據(jù)特征向量和方差貢獻率構(gòu)建評價模型：=0.577791+0.219762+0.118273，模型得分由高到低依次為T1、T4、T8、T2、T12、T7、T9、T13、T10、T11、T6、T5、T3；聚類分析將藤茶資源聚為4類，類群I和類群II均為武陵山區(qū)野生藤茶資源，類群I資源峰1、峰2峰面積高于其他類群，峰7、峰10峰面積低于其他類群，類群II資源峰2、峰8峰面積低于其他類群，類群III資源峰3、峰4、峰5、峰6、峰8、峰9峰面積高于其他類群，峰1峰面積低于其他類群，整體評分最高，故作為推薦資源，即貴州江口、江西定南、廣西三江野生藤茶資源，類群IV為東南沿海野生藤茶資源，峰7、峰10峰面積高于其他類群，峰3、峰4、峰5、峰6、峰9峰面積低于其他類群，整體評分最低，可能是由于產(chǎn)地環(huán)境與武陵山區(qū)差異較大引起的[22]。

4 結(jié) 論

本研究建立了顯齒蛇葡萄快速分類檢索、3個對照品的薄層色譜鑒別方法，同時進行了指紋圖譜相似度評價、相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析，確定1個影響品質(zhì)的重要指標(biāo)，篩選出3個推薦資源。在后續(xù)研究中，將進一步進行區(qū)域放大試驗，考察資源產(chǎn)量、產(chǎn)品品質(zhì)、抗病蟲害能力等因素，最終篩選出適宜推廣栽種的藤茶資源。

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Identification and Evaluation of Fingerprint for the WildResources

ZHANG Chao-yang1, MA Shi-long1,QIN Bang1, XIANG Ban-gui2, HU Bai-shun1*, CHEN Yong-bo1, LIU Yao1, CHEN E1

1.,445000,2.,,445000,

In order to establish the identification methods of plant morphology, microscopy, and thin layer chromatography (TLC) forresources, evaluate and screen the recommended resources, this study took thirteen wildresources collected and planted as the research object, identified them by comparing plant morphological characteristics, powder microscopic characteristics, TLC characteristic spots and fingerprint similarity. At the same time, ten common peaks of fingerprint comparison were used for correlation analysis, principal component analysis and cluster analysis. The results showed that the thirteen resources were all, but there were differences in plant morphology, TLC and fingerprint among different resources; The rapid classification and retrieval ofincluded the key points ofclassification; The difference in the microscopic characteristics of powder among resources was little; The spots at the corresponding positions of TLC of each resource were basically the same, but the color depth was different; Three principal components were extracted by principal component analysis, the cumulative contribution rate of variance was 91.583%, and the resource evaluation model was established at the same time:=0.577791+0.219762+0.118273; Cluster analysis clustered thirteen resources into 4 categories, with the highest score of group III and the lowest score of group IV. The wildresources of Jiangkou, Dingnan, and Sanjiang were selected as recommended resources.

wild; plant morphology; fingerprint

S567

A

1000-2324(2022)02-0188-09

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.02.003

2021-11-24

中組部西部之光訪問學(xué)者計劃;恩施州科技計劃項目(XYJ2021000052);恩施州農(nóng)科院青創(chuàng)項目(2020-009)

張朝陽(1989-),男,碩士,助理研究員,研究方向:藤茶生產(chǎn)、加工、品質(zhì)評價. E-mail:316631555@qq.com

Author for correspondence. E-mail:279814350@qq.com