不同硒源和濃度對飼用苧麻幼苗生理生化特性的影響

朱娟娟，喻春明，陳繼康，陳 平，熊和平

（1.北方民族大學，生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021；2.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

苧麻（Boehmeria niveaL.）是蕁麻科苧麻屬的多年生植物，主要用作紡織原料，是我國特有的主要纖維作物之一[1]，但其纖維部分僅占整株植物的15%，剩下85%的副產(chǎn)物很少被利用，從而造成資源的巨大浪費。為了使苧麻得到充分的利用，前人對其飼用營養(yǎng)成分進行全面分析后，指出苧麻葉片含有較高的粗蛋白[2-3]和非常適宜的氨基酸[4]。李宗道等[5]研究表明，苧麻葉營養(yǎng)豐富，其粗蛋白含量是稻谷的2倍、玉米的3倍；含鈣量為玉米的200倍；還含有8種人、畜需要的氨基酸，其中賴氨酸1.35%、蘇氨酸1.12%、異亮氨酸1.15%、苯丙氨酸1.39%、谷氨酸2.83%、蛋氨酸1.37%，類胡蘿卜素和核黃素含量非常豐富，且葉片中纖維量含量相對較少。此外，我國南方夏季濕熱天氣并不適宜苜蓿的生長發(fā)育，而苧麻生長發(fā)育良好，生物量高。曾日秋等[6]報道鮮飼苧麻產(chǎn)量能夠達到3.19×105kg·hm-2，朱濤濤[7]發(fā)現(xiàn)當苧麻高度達到65 cm時進行刈割，其生物產(chǎn)量約為9×104kg·hm-2。因此，基于牲畜飼料成本的上升和提高高蛋白飼料生產(chǎn)的需求，特別是在傳統(tǒng)飼料作物不能很好地用于畜牧業(yè)發(fā)展的地區(qū)，苧麻成為替代傳統(tǒng)飼料作物的優(yōu)選作物，不僅營養(yǎng)豐富，而且適合所有農(nóng)場動物食用，對牛[8]、羊[9]、豬[10]、馬和家禽[11]的飼喂研究，均表明苧麻是一種良好的綠色飼料營養(yǎng)資源[12]。

硒是動物必需的微量元素，具有抗氧化、增強免疫、抗炎、化學防御、抗病毒、抗癌、解毒重金屬等多種生物功能[13-14]，被認為是動物體抗氧化系統(tǒng)的主要參與者[15]。飼草中硒元素能夠維持種畜肥力和家禽精液質(zhì)量[16]，提高新生仔豬血清抗氧化能力，提高肝臟總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽的含量，并降低血清丙二醛含量[17]，故飼草中含有充足的硒元素，對畜禽的生長發(fā)育至關(guān)重要。飼料植物能夠?qū)o機硒（亞硒酸鹽或硒酸鹽）轉(zhuǎn)化為有機硒。雖然硒在地殼中的豐度較低（＜0.05 mg·kg-1）[18]，但通過土壤施用或葉面噴施硒肥可以顯著提高植物組織硒濃度[19]；同時，外源硒對植物生長具有積極作用[20]，能夠增加植物葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量[21]，提高植物耐受性潛力[22]，飼料作物中硒的生物強化是防治畜禽硒缺乏癥的良好策略之一，同時也解決了與其經(jīng)濟可行性和社會可接受性相關(guān)的潛在問題。前人大量研究了外源硒對水稻[23]、小麥[24]、玉米[25]、果樹[26]、苜蓿[27]、燕麥[28]等作物生理生化特性的影響，但對飼用苧麻生理生化特性的報道甚少。目前隨著對苧麻飼用化研究的深入，揭示苧麻生理生化特性對外源硒的響應具有重要意義。因此，本文以飼用苧麻“中飼苧1號”為試驗材料，通過盆栽試驗，研究不同硒源和濃度下苧麻生物量、光合色素含量、超氧陰離子含量和產(chǎn)生速率、抗氧化酶活性、丙二醛含量以及可溶性蛋白含量的變化，揭示不同價態(tài)硒和濃度對苧麻生理生化特性的調(diào)控機理，旨在為提高苧麻飼用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苧麻品種為“中飼苧1號”，由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所提供。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，硒肥為硒酸鈉（Se6+）和亞硒酸鈉（Se4+），參照其他研究中硒濃度的設(shè)置[29]，并考慮到苧麻對重金屬元素的耐受性[30]，共設(shè)計4個硒肥量，分別為硒 0、0.9、1.8、2.7 mg·kg-1干土，每處理重復3次，每個重復6株幼苗。供試土壤為中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所長沙望城試驗基地0～30 cm的紅壤土。試驗前土壤自然風干，過篩去雜后根據(jù)施硒量，將硒肥溶解于蒸餾水中均勻噴灑于土壤中并混勻，待平衡一周后裝盆，每盆（直徑36 cm，高28 cm）盛干土20 kg，施入7.5 g復合肥，隨后移栽苧麻扦插苗，處理30 d后收苗，一份迅速放入液氮罐中帶回，保存于-80℃冰箱用于生理生化指標的測定；另一份帶至實驗室烘箱高溫殺青（105℃，30 min），在70℃下烘干至恒重，測定苧麻各器官生物量和含硒量。

1.3 測定指標與方法

苧麻植株生物量采用稱重法測定；超氧陰離子產(chǎn)生速率采用羥胺氧化法測定，其標準曲線為y=0.1149x-0.002，R2=0.9961（x表示NaNO2濃度，y表示OD值）；葉綠素和類胡蘿卜素含量采用分光光度法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）光化學還原法測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫紫外分光光度法測定；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）活性均采用南京建成生物有限公司酶聯(lián)試劑盒測定。硒含量采用氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法（GB 5009.93-2010）測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗采用SAS 12.1進行方差分析，結(jié)果以平均值±標準誤表示，不同處理間差異比較采用最小顯著差別（LSD）法進行多重比較，利用Excel 2013和Sigma Plot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒源和濃度對苧麻植株各器官硒含量和生物量的影響

由表1可知，土壤施硒能夠顯著（P＜0.05）提高苧麻硒含量和硒積累總量，隨著施硒量的增加苧麻葉片和莖稈中硒含量及硒積累總量也隨之增加，但不同濃度Se4+處理間莖稈硒含量和硒積累總量無顯著性差異（P＞0.05），而Se6+處理中苧麻葉片和莖稈中硒含量及硒積累總量極顯著（P＜0.001）高于對照。0.9 mg·kg-1施硒量下，Se6+處理中苧麻葉片和莖稈硒含量及硒積累總量極顯著（P＜0.001）高于Se4+處理，而1.8和2.7 mg·kg-1Se6+處理中因苧麻植株全部死亡，無法獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，則表明相同濃度下硒酸鈉（Se6+）比亞硒酸鈉（Se4+）的生物有效性強，更易造成植株傷害。同時，Se4+處理中苧麻葉片和莖稈生物量與對照均無顯著性差異（P＞0.05），但2.7 mg·kg-1Se4+處理中地上部分總生物量顯著低于對照。0.9 mg·kg-1Se6+處理中苧麻各器官生物量顯著低于CK和相同濃度Se4+處理，說明0.9 mg·kg-1Se6+對植株已經(jīng)造成傷害。

表1 不同硒源和濃度對苧麻各器官硒含量、生物量和硒積累總量的影響

2.2 不同硒源和濃度對苧麻葉片光合色素的影響

由圖1可知，0.9 mg·kg-1Se6+處理中苧麻葉片光合色素的合成受到抑制，整個生育期顯著低于其他處理。不同Se4+處理在前期對苧麻葉片光合色素無顯著影響，而處理30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+處理中苧麻葉片葉綠素a（圖1a）、葉綠素b（圖1b）和總?cè)~綠素含量（圖1c）顯著高于對照，但不同Se4+處理間無顯著性差異。與對照相比，苧麻葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素（圖1d）含量在0.9 mg·kg-1Se4+處理中分別增加21.8%、64.4%、28.5%和18.9%，在1.8 mg·kg-1Se4+處理中分別增加13.6%、47.0%、18.9%和17.0%，在2.7 mg·kg-1Se4+處理中分別增加16.4%、31.7%、18.9%和15.0%，但在0.9 mg·kg-1Se6+處理中分別降低33.5%、36.7%、34.0%和24.0%。

由圖1e可知，施用硒后，苧麻葉片葉綠素a與葉綠素b的比值（Chl a/b）均有所升高，且0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處理顯著高于對照，而隨著苧麻生育期的推進，硒處理與對照間無顯著性差異。當施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+處理的Chl a/b值顯著低于對照，而其他處理與對照間無顯著性差異。由圖1 f可知，整個生育期亞硒酸鈉處理中葉綠素與類胡蘿卜素的比值（Chl/Car）與對照間無顯著性差異，而0.9 mg·kg-1Se6+處理中Chl/Car值顯著低于其他處理。

圖1 不同硒源和濃度對苧麻葉片光合色素及其相互比值的影響

2.3 不同硒源和濃度對苧麻葉片中超氧陰離子含量和產(chǎn)生速率的影響

由圖2可知，隨著生育時期的推進，對照和亞硒酸鈉（Se4+）處理中苧麻葉片超氧陰離子含量變化幅度非常小，保持在60～100 nmol·g-1之間；而0.9 mg·kg-1Se6+處理中苧麻葉片超氧陰離子含量極顯著（P＜0.001）高于其他處理，達到300 nmol·g-1以上，但在生育末期其含量降低了78.7%，與其他處理間無顯著性差異。同時，苧麻植株葉片中超氧陰離子產(chǎn)生速率與其含量變化基本相同。由此可見，0.9 mg·kg-1Se6+處理導致細胞內(nèi)生物自由基代謝平衡被破壞，造成超氧陰離子自由基的大量積累，對植株造成傷害，故苧麻植株生物量顯著下降。

圖2 不同硒濃度和價態(tài)硒元素對苧麻葉片中超氧陰離子含量及其產(chǎn)生速率的影響

2.4 不同硒源和濃度對苧麻葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3a～c可知，整個生育期苧麻葉片SOD活性保持在800～1000 U·g-1之間，但各處理間均無顯著性差異。POD活性保持在500～3600 U·g-1·min-1之間，其中0.9 mg·kg-1Se6+處理顯著高于其他處理，達到1700～3600 U·g-1·min-1，表明植株葉片中H2O2含量較高，為了緩解H2O2的傷害，導致POD含量增加從而催化H2O2歧化成無毒害的H2O和O2。CAT活性保持在3.0～22.5 U·g-1·min-1之間，但不同處理時間的硒對其影響有所不同。施硒30 d后，硒處理中葉片CAT活性均顯著高于對照，而不同硒處理間相比較，2.7 mg·kg-1Se4+處理中活性最高，1.8 mg·kg-1Se4+處理中活性最低。

由圖3d可知，隨著生育期的推進，苧麻葉片GSH-ST活性逐漸降低。施硒10 d后，0.9 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處 理 中GSH-ST活性顯著低于對照；施硒20 d后，亞硒酸鈉各濃度處理中GSH-ST活性顯著低于對照；但到施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se6+處理中GSH-ST活性顯著高于對照，是其的3倍，而亞硒酸鈉各濃度處理與對照間均無顯著性差異。

圖3 不同硒源和濃度對苧麻植株葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3e可知，整個生育期，0.9 mg·kg-1Se6+處理中GSH-PX活性顯著高于其他處理，施硒30 d后，分別比CK、0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+和2.7 mg·kg-1Se4+提高51.0%、46.2%、42.0%和85.7%。

由圖3f可知，隨著生育期的推進，苧麻葉片GR活性逐漸增加，整個生育期，硒元素能夠提高苧麻葉片GR活性。施硒30 d后，0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處理中GR活性顯著高于其他處理。與對照相比，0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處 理中GR活性分別提高37.6%、132.5%、21.5%和224.7%。

2.5 不同硒源和濃度對苧麻葉片膜質(zhì)過氧化作用的影響

丙二醛（MDA）是膜質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，是植物細胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。MDA含量高，說明植物細胞膜質(zhì)過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。由圖4可知，施用硒處理10 d后，不同處理間MDA含量無顯著性變化；處理20 d后，0.9 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處理中葉片MDA含量均顯著低于對照；處理30 d后，硒處理中葉片MDA含量均低于對照，且0.9 mg·kg-1Se6+處理與CK間存在顯著性差異。與對照相比，0.9 mg·kg-1Se4+、1.8 mg·kg-1Se4+、2.7 mg·kg-1Se4+和0.9 mg·kg-1Se6+處理葉片MDA含量分別降低16.5%、10.4%、2.7%和34.6%。

圖4 不同硒源和濃度對苧麻葉片丙二醛（MDA）含量的影響

2.6 不同硒源和濃度對苧麻葉片可溶性蛋白的影響

由圖5可知，施用硒處理10 d后，僅0.9 mg·kg-1Se6+處理中葉片可溶性蛋白含量顯著高于對照，而其他處理間無顯著性差異。隨后硒處理與對照間均無顯著性差異，但當處理30 d后，0.9 mg·kg-1和1.8 mg·kg-1Se4+處理中葉片可溶性蛋白含量顯著高于對照，而0.9 mg·kg-1Se6+處理中可溶性蛋白含量顯著低于對照，但2.7 mg·kg-1Se4+處理與對照間無顯著性差異。說明硒元素能夠一定程度的提高苧麻葉片可溶性蛋白含量和細胞的保水能力，但相同施用量的條件下，Se4+的效果優(yōu)于Se6+。

圖5 不同硒源和濃度對苧麻植株葉片可溶性蛋白含量的影響

3 討論

植物中硒元素主要來自土壤，而土壤中硒元素按價態(tài)可劃分為Se2-、Se0、Se4+和Se6+4種形態(tài)，但Se0和Se2-與有機物結(jié)合都不溶于水，很難直接被植物吸收利用，則Se4+和Se6+是作物吸收硒元素的主要形式，其中Se4+主要以亞硒酸鹽形式存在，Se6+主要以硒酸鹽形式存在[31]。然而，植物對亞硒酸鹽和硒酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運存在著相當大的差異，亞硒酸鹽主要以被動運輸方式通過磷酸或硅酸轉(zhuǎn)運蛋白作用進入植物體內(nèi)，隨后在根系中合成有機硒，再運輸至地上組織，其主要積累的部位是根部；而硒酸鈉主要以主動運輸方式通過硫酸轉(zhuǎn)運蛋白作用進入植物體內(nèi)，隨后迅速運輸至地上組織，再在葉片中合成有機硒，其主要積累的部位是葉片[32]，故解釋了本研究中0.9 mg·kg-1Se6+處理苧麻地上部硒含量和硒積累總量遠遠高于0.9 mg·kg-1Se4+處理，且不同濃度Se4+處理間苧麻硒含量和硒積累總量無顯著性差異。Kahakachchi等[33]研究表明，亞硒酸鈉處理的芥菜莖葉組織中亞硒酸鹽占4.3%，有機硒占86.6%，硒酸鹽沒有被檢測到；而硒酸鹽處理的芥菜莖葉組織中硒酸鹽占82.8%，有機硒占15.3%，說明亞硒酸鹽在植物中容易還原為有機化合物，而硒酸鹽更易造成植物傷害，這解釋了本研究中1.8 mg·kg-1和2.7 mg·kg-1Se6+處理中苧麻植株全部死亡，而0.9 mg·kg-1Se6+處理中苧麻生物量顯著低于對照和Se4+處理。

葉綠素含量是決定植物光合能力的最重要因素之一，與生長環(huán)境密切相關(guān)；類胡蘿卜素在光能吸收與傳遞及光系統(tǒng)保護中起著重要的作用；葉綠素a/b值（Chl a/b）或葉綠素/類胡蘿卜素值（Chl/Car）變化均反映逆境條件下植物的生理狀態(tài)和耐受性[34-35]。硒是谷胱甘肽過氧化物酶的必需組分，也參與輔酶A和輔酶Q的合成，在電子傳遞中起重要的作用，線粒體呼吸速率和葉綠體電子傳遞速率都與硒的存在與否及其含量有顯著相關(guān)性，在一定濃度范圍（＜0.10 mg·L-1）內(nèi)，硒元素可以增強線粒體呼吸速率和葉綠體電子傳遞速率，超出閾值（≥1 mg·L-1）時則導致其速率降低[36]。硒對植物來說是一把雙刃劍，在低濃度時是一種抗氧化劑，而在高濃度時是一種促氧化劑。Hawrylak-Nowak等[37]報道低濃度硒對黃瓜植株葉片光合色素含量無顯著性影響，而高濃度硒顯著降低其光合色素含量。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)硒元素能夠提高苧麻植物葉片類胡蘿卜素的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，硒酸鈉對苧麻葉片光合色素含量的影響程度顯著高于亞硒酸鈉，即使低濃度（0.9 mg·kg-1）也能夠造成苧麻葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低，造成苧麻的耐受力較差，導致Chl/Car值最低和Chl a/b值最高；而亞硒酸鈉對苧麻前期葉片光合色素無顯著性影響。這可能因為植物對亞硒酸鈉的主要積累部位是根系，則運輸至葉片時硒濃度大大降低；而植物對硒酸鈉的主要積累部位是葉片，則容易對葉片產(chǎn)生毒害，抑制光合色素的合成。隨著生育期的推進，亞硒酸鈉處理中苧麻葉片光合色素含量高于對照，說明Se4+能通過降低植株葉片光合色素的分解，增加其耐受性從而緩解植物的衰老。

在環(huán)境脅迫下，細胞內(nèi)生物自由基代謝平衡被破壞，造成超氧陰離子積累，進而引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，使得細胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能劣變，新陳代謝發(fā)生紊亂[39]。本研究中亞硒酸鈉在整個處理時期均未顯著增加苧麻葉片超氧陰離子含量和產(chǎn)生速率，而硒酸鈉在處理后10 d顯著增加了苧麻葉片超氧陰離子含量和產(chǎn)生速率。有研究認為，硒的高毒性主要源于其作為氧化劑的作用，導致產(chǎn)生活性氧，對農(nóng)作物有毒[40]，故1.8和2.7 mg·kg-1硒酸鈉處理中，苧麻植株全部死亡，而0.9 mg·kg-1Se6+處理中苧麻生物量顯著降低。植物抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化及膜質(zhì)過氧化作用能反映植物對逆境的響應，SOD、POD和CAT等組成的抗氧化系統(tǒng)是植物的重要保護機制，當植物遭受逆境脅迫時，植物體內(nèi)SOD、CAT和POD活性迅速升高，有效清除活性氧自由基，保護細胞免受活性氧的傷害。SOD是植物抗氧化的第一道防線，將多余的超氧陰離子歧化為H2O2和O2，隨后在CAT和POD的催化下使產(chǎn)生的H2O2歧化成無毒害的H2O和O2，最終清除超氧陰離子，減少逆境對植物的毒害[41]。同時，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSH-ST）是植物體中廣泛存在的一種可催化還原型谷胱甘肽（GSH）與各種親電子化合物進行親核加成反應的一種多功能藥物代謝Ⅱ相酶，是多種植物體內(nèi)的主要解毒系統(tǒng)[42]。谷胱甘肽還原酶（GR）是一類黃素蛋白氧化還原酶，在真核生物和原核生物中都存在，其利用NADPH提供的電子將氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成GSH，從而維持還原型谷胱甘肽的含量，其活性的大小反映了植物體內(nèi)抗氧化能力水平，在植物氧化脅迫過程中對活性氧的清除有非常重要的作用。還原型谷胱甘肽是細胞內(nèi)最重要的抗氧化物，廣泛存在于植物細胞中，由于其結(jié)構(gòu)中活潑巰基的存在，從而成為植物體內(nèi)主要的自由基清除劑，氧化脫氫后不需要酶催化直接可以迅速還原活性氧，并且GSH又可作為酶的底物，在GSHPX的作用下，把H2O2還原成H2O，自身被氧化為GSSG。Hartikainen等[43]報道，在幼苗中添加硒會降低SOD活性，但在較老的（衰老脅迫）黑麥草中會增加SOD活性；Xue等[44]在生菜中也得到了類似的結(jié)果。本研究中硒酸鈉處理中因產(chǎn)生較多的超氧陰離子，從而顯著提高了葉片中CAT、POD、GSHPX、GSH-ST和GR活性，以便達到清除活性氧、降低葉片中MDA含量、減少葉片膜質(zhì)過氧化的作用，緩解其對植株的傷害，但對SOD活性均無顯著性影響，則表明超氧陰離子的歧化主要通過谷胱甘肽酶系完成。此外，可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其含量的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用。雖然亞硒酸鈉在前期對葉片可溶性蛋白含量無明顯影響，但隨著生育期推進，其能夠緩解可溶性蛋白含量的降低，從而延緩苧麻植株的衰老。

4 結(jié)論

硒酸鈉對苧麻生理生化特性的影響程度遠遠大于亞硒酸鈉，且其在植株體內(nèi)易遷移，生物有效性強，更易造成植株傷害。當施用量大于1.8 mg·kg-1時造成苧麻幼苗死亡；當施用量為0.9 mg·kg-1硒酸鈉時，雖然提高苧麻植株體內(nèi)SOD、POD、GSH-PX和GR活力，但超氧陰離子含量和釋放量最高，葉綠素和類胡蘿卜素含量最低，抑制苧麻幼苗的生長，降低生物量。亞硒酸鈉能夠通過降低苧麻幼苗葉片光合色素的分解程度來緩解植株衰老，且能夠一定程度降低膜質(zhì)過氧化作用。因此，施用0.9 mg·kg-1亞硒酸鈉在不影響苧麻生物量的同時能夠顯著提高硒含量和硒積累總量，并且能夠緩解植株衰老。