高效液相色譜法和分光光度法測(cè)定水溶肥料中殼聚糖含量的方法比較

黃均明，侯曉娜，劉 蜜，韓巖松，保萬(wàn)魁，王 旭，劉紅芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

甲殼素（Chitin）是地球上數(shù)量?jī)H次于纖維素的天然有機(jī)化合物，是地球上數(shù)量最大的含氮有機(jī)化合物[1]，主要存在于節(jié)肢動(dòng)物，如蝦、蟹、昆蟲等的外殼，軟體動(dòng)物如烏賊等的內(nèi)殼及軟骨中，被稱之為動(dòng)物纖維素[2-3]。殼聚糖（Chitosan，CTS）化學(xué)名稱為β-1，4-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，又稱脫乙酰甲殼素、甲殼胺、殼多糖、可溶性甲殼素等，是甲殼素脫乙酰基后得到的衍生物[4]。脫乙酰度（DD）反映了線性分子鏈上的氨基含量，一般而言，甲殼素DD值大于55%就可稱之為殼聚糖[1]。

殼聚糖是自然界天然多糖中大量存在的唯一堿性氨基多糖，具有優(yōu)異的生物相容性、良好的生物降解性以及多種生物活性等優(yōu)點(diǎn)[2]，被認(rèn)為是最有前途的功能性生物聚合物之一[5]，已在生物醫(yī)學(xué)[6-8]、食品工業(yè)[9-10]、水處理[11-12]以及農(nóng)業(yè)[13-20]等領(lǐng)域顯示出其廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。由于殼聚糖能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育、改善作物品質(zhì)、提高作物抗逆性[14-16]，因此以現(xiàn)代生物技術(shù)分解、提取得到的殼聚糖為原料制成的肥料及其研究應(yīng)用也逐漸引起了人們的關(guān)注[21-22]。

目前，測(cè)定殼聚糖的方法有高效液相色譜法[23-26]、分光光度法[27-28]、毛細(xì)管電泳法[29-30]、紅外光譜法[31-32]、氣相色譜法[33]、共振瑞利散射法[34]等。其中，高效液相色譜法是測(cè)定殼聚糖的一種主流分析方法，該方法通常是先用酸把殼聚糖水解為氨基葡萄糖，然后用衍生試劑進(jìn)行衍生，最后用液相色譜技術(shù)對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分析；分光光度法雖然可以作為殼聚糖的一種定量方法，但是它在測(cè)定過(guò)程中干擾因素較多，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不高、穩(wěn)定性較差；其他方法通常只是測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度，并沒(méi)有對(duì)殼聚糖進(jìn)行定量分析，或者僅適用于試劑、藥品等基質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品檢測(cè)[29，31，34]。以上方法中僅有分光光度法[27]應(yīng)用于肥料中殼聚糖含量測(cè)定的報(bào)道，但該方法并沒(méi)有對(duì)殼聚糖水解條件進(jìn)行研究分析。本研究以鹽酸溶液作為殼聚糖的水解介質(zhì)，建立了高效液相色譜法和分光光度法測(cè)定水溶肥料中殼聚糖含量的不同分析方法。

1 材料與方法

1.1 方法原理

1.1.1 高效液相色譜法

殼聚糖經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）進(jìn)行衍生，萃取除去過(guò)量PMP后，衍生物經(jīng)高效液相色譜分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法測(cè)定。

1.1.2 分光光度法

殼聚糖經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物。生色原與對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下反應(yīng)生成紫紅色化合物，在波長(zhǎng)525 nm處測(cè)定其吸光度，在一定濃度范圍內(nèi)，該化合物的吸光度與氨基葡萄糖濃度成正比，由此可以用分光光度法測(cè)定。

1.2 試劑

所用試劑和溶液的配制，在未注明規(guī)格和配制方法時(shí)，均按HG/T 3696規(guī)定執(zhí)行。高效液相色譜法用水為超純水，分光光度法用水為三級(jí)去離子水。

乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；三氯甲烷；濃鹽酸；氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品；無(wú)醛乙醇（95%以上）；乙酰丙酮；殼聚糖1（脫乙酰度80%～95%）；殼聚糖2（脫乙酰度大于95%）。

鹽酸溶液（1+1）：鹽酸與水體積比為1∶1。

鹽酸溶液（0.3 mol/L）：量取鹽酸27 mL，再加水稀釋至1 L。

鹽酸溶液（8 mol/L）：量取鹽酸680 mL，再加水稀釋至1 L。

氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：稱取氫氧化鈉400 g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1 L。

氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取氫氧化鈉40 g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1 L。

氫氧化鈉溶液（0.3 mol/L）：稱取氫氧化鈉12 g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1 L。

PMP甲醇溶液（0.5 mol/L）：稱取8.71 g PMP，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用甲醇定容。

磷酸二氫鉀溶液（0.1 mol/L）：采用超純水配制，調(diào)節(jié)pH至6.7，過(guò)0.45 μm水系微孔濾膜后備用（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

碳酸鈉溶液（0.5 mol/L）：稱取碳酸鈉53 g，置于500 mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中用水定容。

乙酰丙酮溶液：移取乙酰丙酮2.0 mL，用碳酸鈉溶液（0.5 mol/L）定容至50 mL，于冰箱中放置過(guò)夜。

對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液：稱取對(duì)二甲氨基苯甲醛0.8 g，溶于無(wú)醛乙醇15 mL及濃鹽酸15 mL中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00 g/L）：稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽0.100 g，置于100 mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用水定容。

氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）：移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00 g/L）2.00 mL至100 mL容量瓶中，用水定容（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.3 儀器

2695高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），配1 cm比色皿；AE 100S型電子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度0.0001 g）；SevenMulti pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；PH-240A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SWB3D數(shù)字控溫水浴鍋（Bibby Scientific有限公司）；SK8200HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；微孔濾膜（水系和有機(jī)系，0.45 μm）。

1.4 供試樣品

樣品來(lái)源于肥料生產(chǎn)企業(yè)的肥料產(chǎn)品。

1.5 樣品前處理

1.5.1 試樣的制備

將固體樣品采用四分法縮分至約100 g，將其迅速研磨至全部通過(guò)0.50 mm孔徑試驗(yàn)篩（如樣品潮濕，可通過(guò)1.00 mm孔徑試驗(yàn)篩），混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中；液體樣品經(jīng)搖動(dòng)均勻后，迅速取出約100 mL，置于潔凈、干燥的容器中。

1.5.2 試樣溶液的制備

稱取混合均勻的0.5～1 g固體試樣或5～10 g液體試樣（精確至0.0001 g，以含殼聚糖200～400 mg為佳），置于100 mL容量瓶中，先加入1.0 mL濃鹽酸，然后加入水溶解后定容。移取1.00 mL溶液至水解管中，加入1.0 mL濃鹽酸和8.0 mL鹽酸溶液（1+1），封管后于100℃水解24 h。水解完成后，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入氫氧化鈉溶液（10 mol/L）6 mL后用鹽酸溶液（0.3 mol/L）和氫氧化鈉溶液（0.3 mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.0，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容。

1.5.3 衍生化（高效液相色譜法）

吸取試樣溶液0.50 mL于具塞試管中，加入0.50 mL氫氧化鈉溶液（0.3 mol/L）和0.50 mL PMP甲醇溶液（0.5 mol/L），蓋塞混勻后，置于70℃恒溫水浴中反應(yīng)70 min，取出后冷卻至室溫，加入0.50 mL鹽酸溶液（0.3 mol/L）中和。用4 mL三氯甲烷萃取，棄去有機(jī)相（下層）。重復(fù)萃取3次，將得到的上層溶液過(guò)0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜后待測(cè)。

1.6 儀器條件（高效液相色譜法）

色 譜 柱：SunFire C18（150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm）；流動(dòng)相：乙腈+磷酸二氫鉀溶液（0.1 mol/L，pH 6.7）=18+82；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.7.1 高效液相色譜法

分別吸取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00 g/L）0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mL于7個(gè)100 mL容量瓶中，用水定容。該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量濃度分別為0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.50 mL于7個(gè)具塞試管進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 分光光度法

分別移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL置于7個(gè)具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00 mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的量分別為0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg。分別加入乙酰丙酮溶液1.00 mL，混勻，置于沸水浴中（1 min后蓋塞）放置25 min，取出，用冰水迅速冷卻至室溫，加入無(wú)醛乙醇3.00 mL，再加入對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液1.00 mL，混勻，于60℃水浴中（5 min后蓋塞）放置1 h，取出立即用冷水冷卻至室溫，在波長(zhǎng)525 nm處，用1 cm比色皿進(jìn)行比色，以含氨基葡萄糖鹽酸鹽0 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零，讀取吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 試樣溶液的測(cè)定

1.8.1 高效液相色譜法

將待測(cè)液在與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相同的條件下測(cè)定，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)試樣溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.8.2 分光光度法

準(zhǔn)確移取試樣溶液1.00～5.00 mL（含氨基葡萄糖鹽酸鹽10～100 μg）置于具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00 mL，在與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相同的條件下顯色、比色，以空白實(shí)驗(yàn)溶液調(diào)零，讀取吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）。在測(cè)定過(guò)程中，若試樣溶液在加入顯色劑之前有顏色，則應(yīng)于另一具塞試管中，加入相同體積的試樣溶液，除顯色階段用1.00 mL鹽酸溶液（1+1）代替對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液外，其余操作相同，測(cè)定吸光度，計(jì)算時(shí)扣除該吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的確定

2.1.1 殼聚糖水解條件

殼聚糖一般采用鹽酸水解，鹽酸濃度越高，水解溫度越高，水解速度越快，但同時(shí)對(duì)水解產(chǎn)物氨基葡萄糖的破壞也越嚴(yán)重[23]。因此，選用較溫和的水解條件（1+1鹽酸溶液，100℃）進(jìn)行最佳水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)，具體操作為：分別稱取樣品1（含殼聚糖約70%）約1 g、樣品2（含殼聚糖約4%）約10 g、樣品3（含殼聚糖約80%）約1 g，均定容至100 mL。吸取1 mL溶液（含殼聚糖4～8 mg）至水解管中，加入1.0 mL濃鹽酸和8.0 mL的1+1鹽酸溶液，封管后于100℃水解不同時(shí)間。按規(guī)定測(cè)定殼聚糖的含量，結(jié)果見圖1。

圖1 1+1鹽酸溶液水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，初步判斷樣品沒(méi)有水解完全。因此，減小稱樣量后再次進(jìn)行最佳水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)，具體操作為：分別稱取樣品1約0.5 g、樣品2約5 g、樣品3和樣品4（含殼聚糖約80%）約0.5 g，均定容至100 mL。吸取1 mL溶液（含殼聚糖2～4 mg）至水解管中，加入1.0 mL濃鹽酸和8.0 mL的1+1鹽酸溶液，封管后于100℃水解不同時(shí)間。按規(guī)定測(cè)定殼聚糖的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 減小稱樣量后1+1鹽酸溶液水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示，2～4 mg的殼聚糖采用1+1的鹽酸溶液在100℃水解24 h的效果最好。為驗(yàn)證1+1鹽酸溶液的水解效果，進(jìn)行了采用8 mol/L鹽酸溶液進(jìn)行水解的實(shí)驗(yàn)。具體操作為：分別稱取樣品1約0.5 g、樣品2約5 g、樣品3和樣品4約0.5 g，均定容至100 mL。吸取1 mL溶液（含殼聚糖2～4 mg）至水解管中，加入2.0 mL濃鹽酸和7.0 mL的8 mol/L鹽酸溶液，封管后于100℃水解不同時(shí)間。按規(guī)定測(cè)定殼聚糖的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 8 mol/L鹽酸溶液水解時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定結(jié)果顯示，2～4 mg的殼聚糖采用8 mol/L的鹽酸溶液在100℃水解6 h的效果最好，但結(jié)果比1+1的鹽酸溶液水解24 h的略低，因此，最終選擇了采用1+1的鹽酸溶液水解24 h。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)和衍生條件（高效液相色譜法）

在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)氨基葡萄糖衍生物溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基葡萄糖衍生物在250和320 nm處均有較大的紫外吸收，其中250 nm為其最大紫外吸收波長(zhǎng)，且溶劑、基質(zhì)的干擾較小，故選擇250 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

此外，根據(jù)文獻(xiàn)[25]和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了殼聚糖水解產(chǎn)物氨基葡萄糖的衍生條件為：c（NaOH）=0.3 mol/L、c（PMP）=0.5 mol/L、衍生溫度70℃、衍生時(shí)間70 min。

2.1.3 顯色條件（分光光度法）

結(jié)合之前的研究報(bào)道[27]，考察了乙酰丙酮-碳酸鈉溶液濃度和配制時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，比較了分別使用前一日配制的4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液、現(xiàn)用現(xiàn)配的4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液和現(xiàn)用現(xiàn)配的7%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液的3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)使用7%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)吸光值僅有0.27，而使用4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)吸光值均可達(dá)0.45，其中，使用現(xiàn)用現(xiàn)配的4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9987，使用前一日配制的4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9996。由此，確定顯色時(shí)使用4%的乙酰丙酮-碳酸鈉溶液，且應(yīng)于使用前一日配制。

2.2 干擾實(shí)驗(yàn)

2.2.1 硝酸根對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響

在干擾因素研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)硝酸根會(huì)對(duì)殼聚糖經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖的過(guò)程產(chǎn)生干擾。為考察硝酸根對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響，在2個(gè)樣品中分別添加不同質(zhì)量的硝酸根進(jìn)行水解和測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 硝酸根對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響

測(cè)定結(jié)果顯示，極少量的硝酸根對(duì)殼聚糖的測(cè)定沒(méi)有影響，但隨著硝酸根含量不斷增大，殼聚糖的測(cè)定結(jié)果會(huì)越來(lái)越低。因此，本研究的高效液相色譜法和分光光度法不適用于含硝酸根的水溶肥料殼聚糖含量的測(cè)定。

2.2.2 蛋白質(zhì)對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響

根據(jù)殼聚糖的生產(chǎn)工藝，殼聚糖產(chǎn)品中可能含有未除凈的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)會(huì)被鹽酸水解成與氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)類似的氨基酸。因此，為考察蛋白質(zhì)對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響，向2個(gè)樣品（均含殼聚糖約80%）中添加不同質(zhì)量的玉米粉（蛋白質(zhì)含量約8%）進(jìn)行水解、測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 蛋白質(zhì)對(duì)殼聚糖測(cè)定的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)樣品與玉米粉質(zhì)量比為1∶2和1∶6，即樣品中蛋白質(zhì)含量為殼聚糖含量的20%和60%時(shí)，兩個(gè)樣品的回收率達(dá)到97%～101%。因此，實(shí)際樣品中可能殘留的少量蛋白質(zhì)對(duì)殼聚糖的測(cè)定沒(méi)有影響。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性相關(guān)性和檢出限

高效液相色譜法：對(duì)一系列不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以氨基葡萄糖鹽酸鹽質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)、峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以3倍信噪比（S/N）估算檢出限，結(jié)果見表3。

分光光度法：對(duì)一系列不同濃度的氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量x（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用20個(gè)空白樣品的測(cè)定結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，并以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差估算檢出限[35]，結(jié)果見表3。

表3 高效液相色譜法和分光光度法的線性范圍和檢出限比較

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)高效液相色譜法和分光光度法的準(zhǔn)確性。經(jīng)兩次平行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)這兩個(gè)方法的回收率。結(jié)果顯示，這兩個(gè)方法的殼聚糖回收率分別為95%～101%和94%，結(jié)果見表4。

表4 殼聚糖回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （%）

為了考察高效液相色譜法和分光光度法的精密度，分別稱取2個(gè)樣品各6份，定容至100 mL，吸取1 mL溶液至水解管中，按規(guī)定水解后測(cè)定殼聚糖含量。結(jié)果顯示，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%和3.6%，結(jié)果見表5。

表5 方法的精密度考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （%）

2.4 方法比對(duì)

分別采用高效液相色譜法和分光光度法對(duì)10個(gè)水溶肥料樣品殼聚糖含量進(jìn)行測(cè)定，以考察這兩種方法所測(cè)結(jié)果是否具有一致性。此外，還以氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）為衍生劑的高效液相色譜法[36]對(duì)這些樣品進(jìn)行檢測(cè)，前處理采用本研究的方法。結(jié)果見表6。氨基葡萄糖PMP衍生物的色譜圖見圖4。

圖4 氨基葡萄糖PMP衍生物的色譜圖

表6 不同分析方法測(cè)定殼聚糖含量比對(duì) （%）

結(jié)果顯示，采用這3種方法所測(cè)結(jié)果有良好的一致性。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，以氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）為衍生劑的高效液相色譜法由于氨基葡萄糖1位的-OH有兩種不同的構(gòu)型，在衍生化后產(chǎn)生兩種同分異構(gòu)體，從而在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，這與之前有關(guān)的研究報(bào)道一致[26，36]，這樣會(huì)給殼聚糖的定量檢測(cè)帶來(lái)一定的影響，相關(guān)問(wèn)題有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜法和分光光度法這兩種方法測(cè)定水溶肥料中殼聚糖含量，并對(duì)這兩種方法所測(cè)的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，這兩種方法均能滿足水溶肥料中殼聚糖含量的分析要求，從而為該產(chǎn)品的規(guī)范生產(chǎn)提供了技術(shù)保障，為行政管理和市場(chǎng)監(jiān)管提供了技術(shù)依據(jù)。相比之下，分光光度法所需實(shí)驗(yàn)儀器簡(jiǎn)單、適用性廣，而高效液相色譜法在操作性、靈敏度、穩(wěn)定性以及可靠性等方面更具優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)人員可以根據(jù)實(shí)際情況選擇相應(yīng)的檢測(cè)方法。