利心沖劑通過(guò)SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌血管新生的作用機(jī)制

陸文江，劉雨辰，高 想，蘇憶玲，王 力，陸 齊

心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展到嚴(yán)重階段的臨床綜合征，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，且具有高患病率、高花費(fèi)和預(yù)后差的特點(diǎn)，是嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。隨著介入技術(shù)的進(jìn)步和新型溶栓藥物的應(yīng)用，心肌梗死后心力衰竭越來(lái)越常見(jiàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭的基本病理機(jī)制為心氣虛乏、心陽(yáng)式微、瘀阻水停[3]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)心力衰竭的描述基本一致?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血液在體內(nèi)運(yùn)行主要是通過(guò)心臟推動(dòng)的，由于心臟血管減少，纖維化增加，心臟泵血功能受損，導(dǎo)致心力衰竭[4]，因此，促進(jìn)血管新生、抑制纖維化顯得極為重要。目前，臨床治療心力衰竭的藥物主要分為強(qiáng)心苷和非強(qiáng)心苷[5]。然而，這些藥物治療心力衰竭作用有限，因而，尋找治療心力衰竭的新型藥物具有重要的臨床意義。

中醫(yī)學(xué)對(duì)心力衰竭的認(rèn)識(shí)與治療研究有數(shù)千年的歷史，積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。利心沖劑為朱良春大師苦心研究數(shù)十年的經(jīng)典處方，由益母草、葶藶子、補(bǔ)骨脂、黃精和黃芪組成，針對(duì)心氣虛乏、心陽(yáng)式微、瘀阻水停心力衰竭的病理變化，以黃芪和黃精補(bǔ)心氣，補(bǔ)骨脂溫陽(yáng)氣、振腎氣治其本；以益母草益氣活血利水，葶藶子瀉肺利水、通利水停瘀阻治其標(biāo)[6]。利心沖劑診治心力衰竭的臨床實(shí)踐中取得了顯著的療效[7]，但利心沖劑的作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌組織沉默調(diào)節(jié)蛋白3(SIRT3)/6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶3(PFKFB3)/缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)，探討利心沖劑促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌血管新生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J雄性小鼠250只，鼠齡均為8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自南通大學(xué)動(dòng)物房[合格證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合南通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求，倫理審查批號(hào)為S20190520-011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 利心沖劑由益母草、黃精、葶藶子、補(bǔ)骨脂、黃芪免煎顆粒按10∶5∶4∶4∶10調(diào)和而成(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為18122691，19030231，19010271，18111191，18120871)，均購(gòu)自南通市中醫(yī)院中藥房；美托洛爾(阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H32025391)；SIRT3(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)GB11354)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)GB11034)；HIF-1α(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)GB11031)；PFKFB3(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)AB181861)；一抗、二抗(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)GB23301)；2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白試劑盒(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)G2026)；凝膠配制盒(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)G2003)；蛋白Marker(美國(guó)Therm公司生產(chǎn)，批號(hào)26616)；RNA提取液(武漢塞維爾公司生產(chǎn)，批號(hào)G3013)；異丙醇(昆山裕隆化工生產(chǎn)，批號(hào)80109218)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)檢測(cè)儀(Rayto公司，型號(hào)Rt2100c)；電子天平(蘇州克瑞斯公司，型號(hào)PX125DH)；冷凍離心機(jī)(美國(guó)heal force公司，型號(hào)neofuge 13R)；電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)1645050)；轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)170-4070)；冰箱(西門(mén)子，型號(hào)BCD-186)；掃描儀(美國(guó)EPSON公司，型號(hào)V300)；勻漿儀(日本PRO公司，型號(hào)01-02300PC)；高速離心機(jī)(中國(guó)凱達(dá)公司，型號(hào)KH19A)；熒光定量酶聯(lián)免疫吸附(RT-qPCR)儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)Stepone plus)；超純水機(jī)(宏森科技公司，型號(hào)VE-10LH-E11)；小動(dòng)物心臟彩超(加拿大VisualSonics公司，型號(hào)Vevo?1100)。

1.4 動(dòng)物模型制備 C57BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，行左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎手術(shù)或?qū)φ帐中g(shù)。術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。將氣體麻醉(異氟烷)后小鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，乙醇消毒切口。在小鼠左胸部切一1.0 cm切口，鈍性分離胸部肌肉，在心臟搏動(dòng)最明顯處使用血管鉗分離肋間隙，同時(shí)將心臟迅速擠出，分離心包；于左心耳下1 mm處，以6-0 proline絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針時(shí)不要刺破心臟；將心臟快速回納胸腔，擠出胸內(nèi)血?dú)?，絲線關(guān)胸，即刻采用小動(dòng)物心電圖儀測(cè)量小鼠心電圖，心電圖可見(jiàn)Ⅱ?qū)?lián)ST段較手術(shù)前抬高0.2 mV以上視為造模成功；摘除麻醉面罩，小鼠1 min內(nèi)蘇醒。對(duì)照組給予相同手術(shù)但只穿線不結(jié)扎前降支。

1.5 分組、給藥方法 C57BL/6J雄性小鼠結(jié)扎左前降支構(gòu)建心肌梗死模型，4周后通過(guò)小鼠心臟彩超檢測(cè)心力衰竭指標(biāo)排除非心力衰竭小鼠。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、利心沖劑低劑量組(28 g/kg)、利心沖劑高劑量組(56 g/kg)和美托洛爾組(0.06 g/kg)，各20只小鼠。給藥組小鼠給藥方式為灌胃，對(duì)照組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃。各組小鼠連續(xù)給藥4周，每日1次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 心功能指標(biāo) 采用小動(dòng)物心臟彩超測(cè)定小鼠心功能，包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.6.2 小鼠體質(zhì)量和心臟體質(zhì)量比 使用異氟烷麻醉小鼠后，采用電子天平分別稱(chēng)取各組小鼠體質(zhì)量，之后處死小鼠取出心臟，擠出血液，使用生理鹽水充分漂洗沾干水分，分別稱(chēng)取各組小鼠心臟重量，計(jì)算心臟體質(zhì)量比，之后將心臟置入-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.6.3 小鼠心肌四氮唑(TTC)染色 取出小鼠心臟，使用自來(lái)水洗凈血液，吸干水分后置入-80 ℃冰箱10 min。取出后延左室長(zhǎng)軸切成1 mm薄片加入TTC染料，置于37 ℃水浴箱中水浴20 min，取出后甲醛固定，體視顯微鏡拍照。使用Image J處理圖像，白色部分為梗死區(qū)，梗死區(qū)面積除以心肌總面積計(jì)算梗死比，同時(shí)進(jìn)行組間比較。

1.6.4 Masson染色 將小鼠心肌切片脫蠟后使用自來(lái)水與蒸餾水依次沖洗，應(yīng)用Regaud蘇木精染色6 min，之后蒸餾水洗5 min，復(fù)染8 min。2%冰醋酸洗10 s，置于1%水溶磷鉬酸液中4 min；直接應(yīng)用苯胺藍(lán)染5 min；再以2%冰醋酸水溶液浸洗；最后用中性樹(shù)膠封固拍片，藍(lán)色為纖維組織采用Image J處理，纖維化面積除以心肌總面積計(jì)算纖維化占比，同時(shí)進(jìn)行組間比較。

1.6.5 蘇木精-伊紅(HE)染色 取心肌石蠟切片60 ℃烤片2 h，趁熱將其移入二甲苯Ⅰ、Ⅴ中脫蠟2 h，分別采用二甲苯Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ脫蠟過(guò)夜。采用100%，95%，90%，80%乙醇梯度水化，每次5 min，再使用蒸餾水漂洗3次，每次5 min。染色(蘇木素)10 min，沖洗3 min，后分化10 s(1%鹽酸乙醇)，再次沖洗 5 min，復(fù)染 3 min(伊紅)，沖洗 1 min。依次使用80%，90%，95%，100%乙醇脫水，每次 5 min，待乙醇揮發(fā)后封片，使用顯微鏡觀察小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)改變。

1.6.6 免疫組化CD31染色 將待檢組織用4%的多聚甲醛室溫固定過(guò)夜，固定好組織，使用薄刀片切成約2 mm薄片，加入目標(biāo)抗體(CD31抗體)產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)。CD31染色后，可見(jiàn)被CD31染成棕色的陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)數(shù)血管密度(MVD)。人工計(jì)算5張圖片棕色點(diǎn)數(shù)，之后總點(diǎn)數(shù)除以5張圖片總面積得到單位血管點(diǎn)數(shù)，取平均值作為MVD。

1.6.7 RT-qPCR檢測(cè)小鼠心肌炎性因子白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達(dá) 取心肌組織約100 mg，按步驟提取總RNA，之后逆轉(zhuǎn)錄，使用RT-qPCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性，95 ℃ 1 min；PCR反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，轉(zhuǎn)錄水平采用公式2-△△Ct計(jì)算。引物均由武漢Servicebio公司設(shè)計(jì)合成：GAPDH正向引物為CCTCGTCCCGTAGACAAAATG，反向引物為T(mén)GAGGTCAATGAAGGGGTCGT；IL-6正向引物為T(mén)TCTTGGGACTGATGCTGGTG，反向引物為GCCATTGCACAACTCTTTTCTC；TNF-α正向引物為CCCTCACACTCACAAACCACC，反向引物為GCCATTGCACAACTCTTTTCTC；NF-κB正向引物為AAGCACAGATACCACCAAGACAC，反向引物為CGCACTGCATTCAAGTCATAGTC。

1.6.8 蛋白免疫印跡法測(cè)量心肌組織SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá) 將心肌組織應(yīng)用冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，漂洗干凈后切成小塊置入勻漿管中徹底勻漿。以12 000 r/min離心10 min，收集上清液。測(cè)定上清液蛋白濃度，以4∶1比例加入緩沖液，使用100 ℃開(kāi)水變性15 min，置入冰箱備用。按實(shí)驗(yàn)所需配液，配電泳液加入目的蛋白電泳2 h之后濕轉(zhuǎn)膜90 min，使用牛奶封閉2 h取膜TBST沖洗2 min，孵一抗過(guò)夜之后用TBST將膜沖洗干凈，避光孵二抗2 h再用TBST洗膜，配熒光液拍照，分別用PhotoShop和Alpha軟件分析光密度值。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)完成情況 喂養(yǎng)、給藥過(guò)程中，對(duì)照組2只小鼠死亡，模型組10只小鼠死亡，利心沖劑低劑量組6只小鼠死亡，利心沖劑高劑量組3只小鼠死亡，美托洛爾組3只小鼠死亡。

2.2 各組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠LVEF、LVFS降低，LVEDD、LVESD升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組小鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組小鼠LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組小鼠心臟彩超圖(×200)

表1 各組小鼠LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD比較(±s)

2.3 各組小鼠體質(zhì)量、心臟重量和心臟體質(zhì)量比比較 與對(duì)照組比較，模型組體質(zhì)量下降，心臟重量增加，心臟體質(zhì)量比升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組體質(zhì)量增加，心臟重量和心臟體質(zhì)量比降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組體質(zhì)量增加，心臟重量和心臟體質(zhì)量比降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量、心臟重量和心臟體質(zhì)量比比較(±s)

2.4 各組小鼠TTC染色改變 與對(duì)照組比較，模型組梗死區(qū)比例明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組梗死區(qū)比例降低(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組梗死區(qū)比例降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組小鼠梗死區(qū)TTC染色圖(×200)

表3 各組小鼠梗死區(qū)比例比較(±s) 單位：%

2.5 各組小鼠Masson染色改變 與對(duì)照組比較，模型組Masson染色最深，心肌纖維化最嚴(yán)重(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組Masson染色改善明顯，心肌纖維化減輕(P<0.01)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組Masson染色減輕最明顯，心肌纖維化最輕(P<0.01)。詳見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組小鼠心肌纖維化改變Masson染色圖(×200)

表4 各組小鼠心肌纖維化比例比較(±s) 單位：%

2.6 各組小鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)改變 模型組小鼠心肌細(xì)胞由正常的圓形或橢圓形變?yōu)殚L(zhǎng)桿狀且排列紊亂，可見(jiàn)細(xì)胞碎裂、壞死。利心沖劑各劑量組心肌細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞碎裂、壞死相對(duì)較少，其中利心沖劑高劑量組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞碎裂、壞死最少，與美托洛爾組形態(tài)相似。詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠心肌組織HE染色圖(×200)

2.7 各組小鼠免疫組化CD31染色改變 與對(duì)照組比較，模型組MVD減少(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組MVD增加(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組MVD增加(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5、表5。

圖5 各組小鼠免疫組化CD31染色圖(MVD，×200)

表5 各組小鼠MVD比較(±s) 單位：個(gè)/高倍鏡

2.8 各組小鼠血清 IL-6、TNF-α、NF-κB比較 與對(duì)照組比較，模型組IL-6、TNF-α、NF-κB水平升高(P<0.01)；與模型組比較，利心沖劑低劑量組小鼠IL-6、TNF-α、NF-κB水平降低(P<0.01)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組IL-6、TNF-α、NF-κB明顯降低(P<0.01)。詳見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠心肌IL-6、TNF-α、NF-κB比較(±s)

2.9 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，利心沖劑低劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與利心沖劑低劑量組比較，利心沖劑高劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)增加最明顯(P<0.05)。詳見(jiàn)圖6、表7。

圖6 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)條帶圖(A為對(duì)照組；B為模型組；C為利心沖劑低劑量組；D為利心沖劑高劑量組；E為美托洛爾組)

表7 各組小鼠心肌SIRT3、PFKFB3、HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

本研究探討利心沖劑治療心肌梗死后心力衰竭小鼠的可能機(jī)制。結(jié)果顯示，利心沖劑可能通過(guò)激活SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路，促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭小鼠血管新生[8-9]，且與美托洛爾作用相似，本研究選擇美托洛爾是由于其為臨床抗心力衰竭的常用藥，且具有促血管新生的作用。

SIRT3是與人類(lèi)壽命長(zhǎng)短有關(guān)的因子，可調(diào)節(jié)體內(nèi)線粒體代謝等生理活動(dòng)[10]。已有研究表明，SIRT3通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3表達(dá)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解，正常情況下糖酵解是內(nèi)皮細(xì)胞獲取能量的主要方式[11]，也是內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行遷移和增殖的主要能量來(lái)源，通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解影響內(nèi)皮細(xì)胞血管新生[12-13]。PFKFB3與HIF-1α存在正反饋調(diào)節(jié)，HIF-1α與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄[14-15]和血管生成[16]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，利心沖劑各劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)增多，血管新生增加，其中利心沖劑高劑量組SIRT3、PFKFB3、HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)最多，血管新生明顯，且與美托洛爾組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推測(cè)利心沖劑可能通過(guò)SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路，促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭小鼠血管新生，且具有劑量依賴(lài)性。既往研究顯示，PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路可促進(jìn)炎性因子表達(dá)[17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，利心沖劑各劑量組IL-6、TNF-α、NF-κB減少，其中利心沖劑高劑量組增加明顯，且與美托洛爾組作用相似。推測(cè)利心沖劑可能通過(guò)促進(jìn)血管新生，進(jìn)而改善心力衰竭小鼠組織氧供，抑制炎性因子表達(dá)[18-19]。利心沖劑可能通過(guò)其他通路直接抑制心肌炎性因子表達(dá)，需進(jìn)一步研究明確。

目前血管新生和纖維化關(guān)系尚未明確，相關(guān)研究顯示，抑制血管新生，可抑制纖維化，尤其在肝臟、眼科方面的研究[20-21]。有研究表明，肝臟細(xì)胞中血管竇毛細(xì)血管增生，可促進(jìn)肝細(xì)胞纖維化，門(mén)脈血管新生，抑制肝細(xì)胞纖維化[22]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血管新生減少，纖維化增加；與模型組比較，利心沖劑各劑量組血管新生增多，纖維化降低，且具有劑量依賴(lài)性。推測(cè)利心沖劑可能通過(guò)SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)生理性血管新生，抑制纖維化。

綜上所述，利心沖劑可能通過(guò)激活SIRT3/PFKFB3/HIF-1α信號(hào)通路促進(jìn)血管新生，但利心沖劑中何種成分促進(jìn)血管新生，是否通過(guò)其他通路促進(jìn)血管新生仍需進(jìn)一步研究。