烯唑醇與血清蛋白的立體選擇性作用機制

陳 冉， 郭 棟,2， 何汝堅， 殷 霞， 范 軍*， 章偉光*

(1. 華南師范大學化學學院， 廣州 510006； 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司， 廣州510663)

手性異構(gòu)體的物理化學性質(zhì)相同，但其生物活性、毒理、代謝和降解等性質(zhì)在手性環(huán)境下差異顯著[1]。例如S-萘普生的抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱效果是R-萘普生的28倍[2]；S-華法林對血栓栓塞性疾病的預防和治療效果是R-華法林的4倍以上，這歸因于2種異構(gòu)體與細胞色素酶(CYP2C9)的作用差異[3]。因此，研究手性藥物分子與蛋白的立體選擇性作用具有重要意義。

目前，UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、電子圓二色光譜和分子對接技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合特性研究中[4-6]。YUAN等[7]采用多譜學技術(shù)和分子對接技術(shù)研究乳酸與人血清蛋白(HSA)的相互作用，發(fā)現(xiàn)了L-乳酸更易于與HSA結(jié)合。CUI等[8]研究發(fā)現(xiàn)D-胞嘧啶與HSA的相互作用強于L-胞嘧啶，兩者的相互作用主要為疏水力。本課題組[9]采用紫外光譜和熒光光譜研究了R,S-1-(3-甲氧基苯)乙胺、R,S-1-(4-甲氧基苯)乙胺、R,S-四氫萘胺、R,S-2-辛醇和R,S-乳酸甲酯與血清蛋白的作用，血清蛋白與這些化合物表現(xiàn)出立體選擇性。

烯唑醇是一種廣譜三唑類殺菌劑，被廣泛應(yīng)用在小麥、水果、蔬菜和茶樹等抗菌[10]。烯唑醇有一個手性中心和一對對映異構(gòu)體。研究表明：R-烯唑醇的抗真菌活性顯著高于S-烯唑醇[10-11]；在生物積累時兩者表現(xiàn)為立體選擇性，S-烯唑醇在人工土壤[12]中和黃粉蟲幼蟲體內(nèi)[13]優(yōu)先積累；兩者的藥代動力學差異顯著，給兔靜脈注射烯唑醇對映體后，在血漿中S-烯唑醇的清除率是R-烯唑醇的1.57倍[14]。然而，它們未能揭示2種烯唑醇對映異構(gòu)體表現(xiàn)出立體選擇性的作用機制。在本研究中，采用UV-Vis吸收光譜法、熒光光譜法和分子對接技術(shù)研究了烯唑醇對映體與HSA或BSA的結(jié)合差異，為烯唑醇的立體選擇性作用機制提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

人血清蛋白(HSA，純度≥96%，A1653)購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。牛血清蛋白(BSA，純度≥98%，A104912)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。R-烯唑醇和S-烯唑醇(e.e.>98%)由廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供，結(jié)構(gòu)如圖1所示。磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉(分析純)購自天津市大茂化學試劑廠。

圖1 烯唑醇對映異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)

1.2 UV-Vis吸收光譜的測定

精密稱取9.98 mg HSA置于100 mL的容量瓶中，加入PBS(pH 7.4)緩沖溶液溶解，配制成濃度為1.5 μmol/L的溶液。向HSA溶液(3 mL，1.5 μmol/L)中依次加入一定體積的R-烯唑醇(600 μmol/L)后搖勻，使R-烯唑醇的濃度分別為 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μmol/L。將R-烯唑醇和HSA混合液在25 ℃的水浴中保持5 min后在紫外可見分光光度計(UV-2700，日本島津)上記錄了這一系列溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。S-烯唑醇與HSA作用實驗與R-烯唑醇類似，以S-烯唑醇替代R-烯唑醇。

BSA與R-烯唑醇和S-烯唑醇相互作用實驗與HSA類似，BSA的濃度為1.5 μmol/L，烯唑醇對映體在BSA溶液中的濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μmol/L。

1.3 熒光光譜的測定

溶液配制方法與1.2節(jié)相同，HSA和BSA的濃度均為1.5 μmol/L，R-烯唑醇和S-烯唑醇的濃度分別為0、6.1、15.3、30.7、46.0和61.3 μmol/L。將混合溶液分別在293、303和313 K下孵育30 min后，使用熒光分光光度計(F-4600，日本日立)記錄這一系列血清蛋白溶液在300～530 nm波長范圍內(nèi)的熒光光譜，激發(fā)波長為280 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.4 分子對接模擬法

BSA和HSA晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID分別為3V03和1HA2。首先，使用Pymol 2.3軟件除去蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有配體和水分子，并以pdb格式保存；使用Autodock 4.2軟件對HSA進行加氫和電荷計算操作，設(shè)置為剛性對接模式。同時，將R-烯唑醇和S-烯唑醇的穩(wěn)定異構(gòu)體模型文件保存為pdb格式，對其加氫和加電荷處理。然后，調(diào)整網(wǎng)格框12.6 nm×12.6 nm×12.6 nm，間距參數(shù)為0.058 6 nm，使用Autodock 4.2軟件對HSA和R-烯唑醇進行了對接，得到了R-烯唑醇在HSA中最可能的結(jié)合位點范圍。為了進一步精確模擬烯唑醇與HSA間的相互作用，將網(wǎng)格距離和間距參數(shù)分別縮小為7 nm×7 nm×7 nm和0.037 5 nm。S-烯唑醇與HSA對接的網(wǎng)格距離和間距參數(shù)和R-烯唑醇與HSA對接的網(wǎng)格距離和間距參數(shù)一致。上述計算均使用Lamarckian遺傳算法。最后，基于能量最低原理，找到了R-烯唑醇和S-烯唑醇與HSA最有利的對接模型，使用Auto Dock Tools 1.5.6軟件包進行分析。

R-烯唑醇和S-烯唑醇與BSA的分子對接方法與之類似，網(wǎng)格距離和間距參數(shù)分別為7 nm×7 nm×7 nm和0.037 5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見吸收光譜分析

圖2為血清蛋白在滴加R-烯唑醇和S-烯唑醇前后的紫外吸收光譜圖。隨著R-烯唑醇和S-烯唑醇的濃度從0增大至8 μmol/L，HSA和BSA在波長280 nm附近的吸收峰強度增加，說明R-烯唑醇和S-烯唑醇與血清蛋白作用形成了復合物；而在波長250 nm附近的吸收峰歸屬于烯唑醇CC鍵、CN鍵和苯環(huán)n→π*和π →π*躍遷，隨烯唑醇濃度增大，吸收峰強度不斷增強。隨烯唑醇濃度的進一步增大，血清蛋白在波長280 nm處的特征吸收峰發(fā)生藍移，這歸因于加入R-烯唑醇和S-烯唑醇使得血清蛋白的肽鏈伸展，色氨酸和酪氨酸殘基上疏水基團暴露后疏水作用減弱，親水作用增強，n→π*和π →π*躍遷增強。最終，加入烯唑醇對HSA和BSA的構(gòu)象產(chǎn)生影響[15]。

圖2 不同烯唑醇對映體的濃度對HSA和BSA紫外吸收光譜的影響

藥物與血清蛋白間的結(jié)合常數(shù)(KA)可以反映兩者的結(jié)合能力。通過修正的Hildebrand-Benesi方程可得KA[16]：

(1)

通過式(1)計算可知，R-烯唑醇和S-烯唑醇與HSA作用的紫外結(jié)合常數(shù)KA分別為8.85×103mol/L和4.02×103mol/L，而兩者與BSA作用的紫外結(jié)合常數(shù)KA分別為9.14×103mol/L和3.94×103mol/L，這說明R-烯唑醇與血清蛋白的結(jié)合更穩(wěn)定。

2.2 熒光光譜分析

2.2.1 烯唑醇對血清蛋白的熒光猝滅 熒光光譜研究可以獲得小分子與蛋白的結(jié)合位點、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合機理等信息。HSA/BSA的熒光歸因于血清蛋白中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的熒光發(fā)射。圖3為293 K下加入烯唑醇對映體后HSA/BSA溶液的熒光譜圖，隨著R-烯唑醇濃度從0增加至61.3 μmol/L，HSA的熒光發(fā)射顯著降低，說明了R-烯唑醇與HSA的相互作用是HSA的內(nèi)源性熒光猝滅。同時，HSA的最大發(fā)射峰波長從350 nm藍移到347 nm，說明加入R-烯唑醇后，HSA中的色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生了改變。圖3B中給出了S-烯唑醇對HSA熒光的影響，變化規(guī)律與R-烯唑醇的一致。對于BSA，隨R-烯唑醇和S-烯唑醇濃度的升高，其熒光強度顯著下降，最大發(fā)射峰發(fā)生微小藍移。

圖3 HSA和BSA在加入烯唑醇對映體前后的熒光光譜

2.2.2 熒光猝滅類型確定 熒光猝滅分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是由猝滅劑與激發(fā)態(tài)分子間的碰撞引起的熒光猝滅；靜態(tài)猝滅是指猝滅劑和基態(tài)分子形成無熒光的復雜化合物，溫度升高可能導致結(jié)合較弱的復合物解離發(fā)生熒光猝滅。靜態(tài)猝滅常數(shù)也具有溫度依賴性，溫度升高會使靜態(tài)猝滅常數(shù)降低。然而，當溫度升高引起的熒光增強程度大于分子碰撞引起熒光猝滅程度，即出現(xiàn)靜態(tài)猝滅常數(shù)增大的反?，F(xiàn)象[17]。猝滅類型可以通過Stern-Volmer方程來判斷：

(2)

其中，F(xiàn)0和F對應(yīng)于加入猝滅劑(烯唑醇)前后血清蛋白的熒光強度，KSV是Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，Q是猝滅劑的濃度，kq是生物大分子的猝滅速率常數(shù)，τ0為生物大分子內(nèi)源性熒光壽命，對于HSA或BSA，τ0約為1×10-8s。繪制F0/F與Q的曲線如圖4所示，F(xiàn)0/F與Q間具有良好的線性關(guān)系，說明烯唑醇對血清蛋白的熒光猝滅是單一靜態(tài)猝滅或動態(tài)猝滅[18]。表1中，kq均在1013數(shù)量級，遠大于各種猝滅劑對生物大分子的最大碰撞速率常數(shù)(約2.0×1010L/(mol·s))，說明烯唑醇對血清蛋白的猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅。猝滅常數(shù)KSV隨溫度升高而增大。因此，KSV和kq隨溫度的變化規(guī)律都表明烯唑醇對血清蛋白的熒光猝滅行為屬于靜態(tài)猝滅機理[19]。

圖4 不同溫度下烯唑醇與HSA、BSA的Stern-Volmer圖

表1 不同溫度下HSA和BSA與烯唑醇對映體的結(jié)合常數(shù)(Ka)、結(jié)合位點數(shù)(n)和熱力學參數(shù)

2.2.3 手性結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)n采用雙對數(shù)方程得到烯唑醇與血清蛋白作用的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)[20]:

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlgQ。

(3)

表1中，隨溫度升高，Ka逐漸減小，說明烯唑醇對血清蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。在3個溫度下，R-烯唑醇與血清蛋白的結(jié)合常數(shù)均大于S-烯唑醇與血清蛋白的結(jié)合常數(shù)。n在0.95～1.66范圍內(nèi)變化，表明烯唑醇與血清蛋白結(jié)合達到穩(wěn)定時，血清蛋白上有1個結(jié)合位點被烯唑醇占據(jù)。

2.2.4 烯唑醇與血清蛋白相互作用力類型預測 熱力學參數(shù)可以確定藥物與血清蛋白間的相互作用力種類，如范德華力、氫鍵、靜電作用和疏水相互作用等。通過范特霍夫方程來計算烯唑醇和血清蛋白作用過程的熱力學參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG：

(4)

其中，K是不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為理想氣體常數(shù)(8.314 J/(mol·K))。

ΔH和ΔS的符號和大小是判斷蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合形式的重要依據(jù)。若ΔH<0且ΔS<0，則氫鍵和范德華力占主導作用[21]。表1中，R-/S-烯唑醇與HSA作用的ΔH分別為-91.4 kJ/mol和-94.0 kJ/mol，而兩者與BSA作用的ΔH均為-74.9 kJ/mol。R-烯唑醇和S-烯唑醇與血清蛋白作用的ΔS在-199.98～-269.44 J/(mol·K)范圍內(nèi)。ΔH和ΔS均為負值,說明了烯唑醇與血清蛋白作用時，范德華力和氫鍵占主導地位。同時，ΔG均小于零，說明烯唑醇與血清蛋白的結(jié)合是自發(fā)進行的。

2.3 分子對接法研究烯唑醇與血清蛋白作用機制

采用分子對接技術(shù)模擬HSA或BSA和烯唑醇對映體的結(jié)合。圖5為R-烯唑醇和S-烯唑醇與HSA(A、B)和BSA(C、D)間相互作用的最優(yōu)狀態(tài)，形成復合物時涉及的氨基酸殘基見表2。

圖5 HSA-烯唑醇和BSA-烯唑醇復合物的分子對接結(jié)果

R-烯唑醇與HSA的ARG117、ILE142和TYR161形成疏水相互作用，與氨基酸殘基ARG117、LEU182、ARG186形成了4個氫鍵 (距離分別為0.252、0.232、0.201、0.322 nm)，還與ARG117形成了弱的π-陽離子相互作用；S-烯唑醇與HSA中氨基酸殘基ILE142、PHE157和ARG186存在疏水作用，與TYR161(0.219 nm)、LEU185(0.185 nm)、GLY189(0.337 nm)形成了3個氫鍵。這說明烯唑醇與血清蛋白間通過疏水作用、氫鍵和π-陽離子相互作用結(jié)合，氫鍵對增強復合物的穩(wěn)定性具有重要作用。同時，R-烯唑醇-HSA復合物的對接能量為-26.4 kJ/mol，S-烯唑醇-HSA復合物的對接能量為-23.6 kJ/mol，說明R-烯唑醇-HSA復合物更穩(wěn)定。

烯唑醇與BSA的氨基酸殘基間存在氫鍵和疏水相互作用。R-烯唑醇和S-烯唑醇與BSA作用的對接能量分別為-27.6 kJ/mol和-23.3 kJ/mol，說明R-烯唑醇與BSA的結(jié)合更穩(wěn)定。

表2 HSA-烯唑醇和BSA-烯唑醇復合物的分子對接參數(shù)Table 2 The molecular docking parameters for binding between HSA- and BSA-diniconazole complexes

3 結(jié)論

采用UV-Vis吸收光譜、熒光光譜和分子對接技術(shù)研究了烯唑醇對映體與血清蛋白的結(jié)合差異。血清蛋白與烯唑醇結(jié)合時表現(xiàn)出立體選擇性，與R-烯唑醇的結(jié)合更強。加入烯唑醇后，血清蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，其特征吸收峰藍移，熒光猝滅。分子對接的結(jié)果表明R-烯唑醇和S-烯唑醇與HSA和BSA之間的作用力主要是范德華力和氫鍵。研究結(jié)果為進一步研究烯唑醇在生物體內(nèi)的代謝和降解行為提供了理論參考。