不同規(guī)格大珠母貝稚貝生長、生理及腸道菌群組成

彭汝雨,李 曦,Hebert Ely Vasquez,鄭 興,顧志峰

(1.中交天航南方交通建設(shè)有限公司,廣東 深圳 518000;2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，?？?570228)

0 引言

大珠母貝 (Pinctadamaxima) 俗稱白蝶貝，屬于珍珠貝科(Pteriidae)、珠母貝屬(Pinctada)，喜棲息在 10 m 以上水深的珊瑚礁或沙礫海域，營附著生活[1]。大珠母貝是我國熱帶海域主要的大型珍珠貝品種，是海水珍珠貝中體型最大、貝殼最厚的種類，主要分布在海南、廣西、廣東等南方沿海區(qū)域[2-3]。大珠母貝所培育的圓形游離海水珍珠俗稱“南洋珠”，直徑最大可達(dá)2.0 cm，且具有珠層厚、光澤好的特點，其價值遠(yuǎn)高于其他珍珠貝品種所培育的珍珠，屬珍珠中的珍品[4-5]。

我國海水珍珠主要由體型較小的馬氏珠母貝培育，在20世紀(jì)90年代，其珍珠產(chǎn)量居世界海水珍珠產(chǎn)量首位，且珍珠質(zhì)量較好。然而21世紀(jì)以來，由于環(huán)境、苗種以及馬氏珠母貝體型本身的限制等，產(chǎn)量急劇下降，2013年全國海水珍珠產(chǎn)量已不足2 t，而且珍珠小、珠層薄、瑕疵多、質(zhì)量差，多數(shù)無法達(dá)到珠寶級標(biāo)準(zhǔn)，基本上不被國際珠寶市場認(rèn)可[6]?；谀壳皣H珍珠市場大型海水珍珠價值、產(chǎn)量和地位迅速攀升的現(xiàn)實，培育規(guī)格大、珠層厚、光澤好的優(yōu)質(zhì)大型海水圓形珍珠是我國海水珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必由之路，而大珠母貝是培育大型海水圓形珍珠最理想的珍珠貝。

我國海水珍珠研究人員自20世紀(jì)60年代就開始了大珠母貝研究，于20世紀(jì)80年代培育出中國第一顆大珠母貝“南洋珠”，該研究成果曾獲國家科技進(jìn)步一等獎。遺憾的是，這一成果至今沒有實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，其主要原因是在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大珠母貝人工苗種養(yǎng)殖至殼長3～7 cm時其存在規(guī)模化死亡現(xiàn)象，這成為大珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的技術(shù)瓶頸[7]。為有效提高大珠母貝稚貝養(yǎng)殖存活率，諸多學(xué)者開展了養(yǎng)殖方式、海上管理方式、喂養(yǎng)策略等多方面的研究[8-9]。在大珠母貝稚貝養(yǎng)殖過程中，餌料的類型會影響稚貝的存活率和生長速度[10]，珍珠貝可能在不同發(fā)育階段對餌料的需求存在一定差異，不同發(fā)育階段不同規(guī)格的稚貝對養(yǎng)殖環(huán)境的耐受能力也有差異。課題組前期進(jìn)行的大珠母貝稚貝接力式養(yǎng)殖試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同規(guī)格的稚貝在海上中間培育階段存活率存在明顯差異。本文在此基礎(chǔ)上選擇兩種不同大小規(guī)格的大珠母貝稚貝在海棠灣海域繼續(xù)開展試養(yǎng)實驗，并從生長性能、生理活力及腸道菌群結(jié)構(gòu)角度探究稚貝規(guī)格和存活率之間的關(guān)系，以期為大珠母貝稚貝海上中間培育技術(shù)的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與管理

實驗所用兩種規(guī)格的大珠母貝稚貝(殼長分別為30 mm和20 mm)均由海南三亞邁豐實業(yè)有限公司提供。稚貝在移入海棠灣海域開展試養(yǎng)實驗前，都在室內(nèi)養(yǎng)殖車間進(jìn)行養(yǎng)殖管理。期間每天使用湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)和牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)進(jìn)行混合投喂，養(yǎng)殖水體每天換水，換水量為30%，以保證養(yǎng)殖水體中的總氨氮含量小于0.02 mg·L-1，溶解氧濃度不小于6 mg·L-1。

1.2 實驗設(shè)計

實驗采用片籠吊養(yǎng)方式進(jìn)行實驗動物的養(yǎng)殖，將殼長30 mm和20 mm的大珠母貝實驗組分別標(biāo)記為HA組和HB組，在養(yǎng)殖場室內(nèi)移入相應(yīng)片籠中后，直接運至海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域。實驗共持續(xù)60 d，期間每10 d進(jìn)行一次附著物清理工作，試養(yǎng)結(jié)束后分別對HA組和HB組稚貝進(jìn)行樣品采集及數(shù)據(jù)收集，進(jìn)而開展統(tǒng)計學(xué)相關(guān)分析。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 存活率的檢測

試養(yǎng)的大珠母貝稚貝存活率(SR，記為ρSR)的計算方法為

ρSR=(N2/N1)×100%,

(1)

其中：N1、N2分別為稚貝總數(shù)和存活稚貝個數(shù)。

1.3.2 殼長相關(guān)指標(biāo)的檢測

使用游標(biāo)卡尺對稚貝樣品進(jìn)行殼長測量，以便計算絕對增長率(AGR,記為kAGR)和相對增長率(RGR，記為kRGR)，其計算公式為

(2)

(3)

其中：X1和X2分別是試養(yǎng)實驗前后樣品的平均殼長，t是實驗時間。

1.3.3 消化酶及免疫酶活力的檢測

對HA組和HB組樣品測量其形態(tài)指標(biāo)后，隨機(jī)取部分樣品分別分成2份投入液氮中進(jìn)行保存，其中一部分用于消化酶和免疫酶活力的檢測。消化酶包括淀粉酶(AMS)、胃蛋白酶(PES)、脂肪酶(LPS)，免疫酶包括溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)。實驗采用南京建成生物科技有限公司的生化試劑盒進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書所示的方法進(jìn)行。

1.3.4 腸道微生物分析

液氮保存的另一份樣品用于腸道菌群構(gòu)成分析，該部分樣品直接送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行后續(xù)檢測，樣品保存方法及步驟嚴(yán)格按照技術(shù)要求進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計分析軟件DPS 14.5進(jìn)行顯著性檢驗統(tǒng)計分析，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率及生長差異比較

HA組和HB組間的實驗存活率、生長性能(表1)存在顯著差異(P<0.05)，且HA組優(yōu)于HB組。HA組存活率為(86.16±1.58)%，顯著高于HB組的結(jié)果(67.88±3.02)%。試養(yǎng)結(jié)束后，HA組和HB組殼長分別增至(43.18±3.17) mm和(26.65±2.06) mm；HA組殼長的絕對和相對增長率分別為(0.22±0.05)mm·d-1、(0.73±0.06)%·d-1，顯著高于HB組的相應(yīng)結(jié)果(0.11±0.04)mm·d-1、(0.55±0.09)%·d-1。

表1 不同規(guī)格大珠母貝稚貝存活率及殼長比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2 部分消化酶和免疫活力差異比較

試養(yǎng)結(jié)束后，HA組與HB組間部分消化酶和免疫酶活力(表2)存在顯著差異(P<0.05)，HA組的酶活力均高于HB組。其中，HA組淀粉酶和胃蛋白酶活力分別為(4.07±0.45)、(3.38±0.19)U·mg·prot-1，顯著高于HB組的相應(yīng)結(jié)果(2.00±0.52)、(2.36±0.16) U·mg·prot-1；HA組堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活力都高于HB組，分別為(16.49±0.80)、(14.58±0.38)King·mg·prot-1和(16.86±1.25) U·mg·prot-1。

表2 不同規(guī)格大珠母貝稚貝消化酶和免疫酶活力比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 腸道菌群組成比較

試養(yǎng)結(jié)束后，HA組與HB組間腸道菌群結(jié)構(gòu)(圖1)總體相似，群落結(jié)構(gòu)不存在顯著差異(P>0.05)。其中，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)都為兩組實驗貝的優(yōu)勢菌群，

(a)門水平 (b) 屬水平 圖1 不同規(guī)格大珠母貝稚貝腸道菌群組成比較

在HA組中其相對豐度分別為63.36%、68.87%，在HB組中則分別為16.35%、18.32%。在屬水平上，伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)和弧菌屬(Vibrio)為優(yōu)勢菌群，在HA組中其相對豐度分別為53.83%、55.11%，在HB組中則分別為18.26%、16.29%。

3 討論

養(yǎng)殖活動中存活率和生長性能是行業(yè)中最關(guān)注的重要評判因素之一[10-12]。本文所選海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域為典型熱帶氣候海域，自然環(huán)境下餌料種類豐富，鹽度和溫度等環(huán)境條件合適，對于大珠母貝、珠母貝、馬氏珠母貝等熱帶養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類而言是較好的棲息環(huán)境。本研究所獲結(jié)果表明，兩種規(guī)格的大珠母貝稚貝在蜈支洲島試養(yǎng)海域存活率可達(dá)67%以上，該存活率雖然低于室內(nèi)培養(yǎng)的同批次稚貝的結(jié)果(88%，數(shù)據(jù)來源于養(yǎng)殖場)，但其生長性能優(yōu)于室內(nèi)同批次稚貝的結(jié)果。這可能是因為蜈支洲島試養(yǎng)海域餌料種類較豐富和數(shù)量比較充足，可滿足大珠母貝稚貝在該階段生長發(fā)育所需的餌料的營養(yǎng)性和數(shù)量。本研究結(jié)果與Yang等[13]關(guān)于大珠母貝稚貝室內(nèi)養(yǎng)殖與海上養(yǎng)殖的情況對比，以及與楊創(chuàng)業(yè)等[12]關(guān)于馬氏珠母貝室內(nèi)養(yǎng)殖與海上養(yǎng)殖效果的比較均較為一致，主要原因在于餌料種類和營養(yǎng)的豐富度和充足性。本研究中，將30 mm規(guī)格組與20 mm規(guī)格組的稚貝的存活率和生長性能進(jìn)行對比，得到的結(jié)果是30 mm規(guī)格組稚貝的存活率較高，生長性能也較優(yōu)。其原因可能在于較大規(guī)格的稚貝具有相對較強的體質(zhì)、攝食能力，對環(huán)境的適應(yīng)耐受性更強，且對餌料的營養(yǎng)吸收更為快速有效。

動物對餌料或飼料的消化吸收過程較為復(fù)雜，消化酶在這個過程中有著十分重要的作用。消化酶可以幫助機(jī)體消化和分解從外界攝取的食物，從而為機(jī)體的生長、發(fā)育、繁殖等生命活動提供所需的能量[14]。目前所關(guān)注的消化酶主要為淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶，酶活力的大小常被用作反映動物消化性能、營養(yǎng)狀況等方面的重要指標(biāo)[15]。本研究結(jié)果表明，大珠母貝稚貝在海區(qū)吊養(yǎng)期間，30 mm規(guī)格組稚貝的胃蛋白酶、脂肪酶活力顯著高于20 mm規(guī)格組的結(jié)果，這代表著30 mm規(guī)格組稚貝的消化能力強于20 mm規(guī)格組稚貝，從而可獲得更多的能量用于生長及環(huán)境適應(yīng)，這在一定程度上也反映了兩組不同規(guī)格稚貝在同一試養(yǎng)海域養(yǎng)殖時生長性能和存活率存在差異的原因。30 mm規(guī)格組稚貝具有較好的攝食及消化能力，可更有效地獲得食物及吸收營養(yǎng)，從而擁有更多的能量抵御不良環(huán)境因子的脅迫，有更多機(jī)會生存于野外環(huán)境，繼而生長發(fā)育。

抗氧化系統(tǒng)可清除體內(nèi)過量活性氧，保護(hù)機(jī)體不受氧化損傷，其中起免疫防御功能的免疫酶對機(jī)體抗逆能力是十分重要的。ACP、AKP 是兩種重要的代謝調(diào)控酶，同時也是巨噬細(xì)胞溶酶體酶的標(biāo)志酶，通過形成水解酶體系消除異物，從而起到免疫防御的功能[16-18]。LZM屬于機(jī)體的非特異性免疫因子，是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，參與多種免疫反應(yīng)，在免疫反應(yīng)中可以增強巨噬細(xì)胞的吞噬和消化能力，激活白細(xì)胞的吞噬功能，誘導(dǎo)其他免疫因子的合成和分泌，其活力變化可作為動物免疫機(jī)能狀態(tài)的指標(biāo)[19-20]。ACP、ALP和LZM的活力都可以反應(yīng)機(jī)體的抗氧化水平及免疫健康狀態(tài)，本研究結(jié)果表明，在海棠灣海域養(yǎng)殖結(jié)束后的30 mm規(guī)格組稚貝的ACP、ALP和LZM的活力都顯著優(yōu)于20 mm規(guī)格組稚貝，這在一定程度上代表著30 mm規(guī)格組稚貝具有較強的抗氧化劑免疫性能，體質(zhì)情況相對較佳，因此可更有效地適應(yīng)和抵抗外界自然環(huán)境因素的變化，從而提高自身存活能力，這可能就是30 mm規(guī)格組稚貝在本試養(yǎng)實驗中存活率相對較高的原因之一。

腸道菌群由種類多樣和數(shù)量龐大的微生物所構(gòu)成，并通過各個種類的相互作用形成復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，在宿主生長、發(fā)育、免疫等諸多重要生命活動環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[21-22]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)合理性及穩(wěn)定性對宿主的健康極其重要，不合適的環(huán)境、食物等因素都可能會導(dǎo)致腸道菌群的紊亂，從而影響宿主的生命質(zhì)量。腸道菌群的負(fù)向改變會損害宿主的免疫功能，從而使其患病風(fēng)險提高，影響存活能力[23]。不同物種的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)有所差異，且會受到養(yǎng)殖環(huán)境、餌料環(huán)境等因子的影響[13]。本研究結(jié)果表明，在海棠灣蜈支洲島海域養(yǎng)殖的大珠母貝稚貝腸道菌群結(jié)構(gòu)在門水平上其優(yōu)勢菌群是變形菌門(Proteobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)，該結(jié)果與長牡蠣(Crassostreagigas)的腸道菌群研究結(jié)果較為一致[24-25]。變形菌門是動物所有生命階段中數(shù)量最大、表型最多樣化和最豐富的門[26-27]。本文進(jìn)一步在屬水平上對大珠母貝稚貝進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，其分析結(jié)果表明伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)和弧菌屬(Vibrio)是其核心優(yōu)勢菌群?；【鷮僦械幕【俏覀兯J(rèn)知的條件致病菌，但在本研究過程中并未發(fā)現(xiàn)大珠母貝稚貝存在感染病害或發(fā)病的跡象，其原因可能是條件致病菌只有在滿足環(huán)境惡劣、宿主體質(zhì)及抵抗力較差的條件下才會發(fā)生致病現(xiàn)象，而本研究所在蜈支洲島海域環(huán)境良好、稚貝體質(zhì)較佳，且弧菌數(shù)量較低，因此在該環(huán)境中本實驗試養(yǎng)的稚貝未發(fā)生致病現(xiàn)象。此外，相關(guān)研究表明病原微生物在水生動物腸道中的存在可以看作是一種普遍現(xiàn)象，在宿主體內(nèi)主要是對代謝和免疫等生命過程起著或大或小的作用，而并不是致病的關(guān)鍵因素[28-30]。

綜上所述，殼長30 mm規(guī)格的大珠母貝稚貝相對于20 mm規(guī)格稚貝而言，在海棠灣蜈支洲島試養(yǎng)海域的存活率較高，生長性能較好，消化和免疫性能較佳，其后期養(yǎng)殖成功的可能性更大。本研究結(jié)果可為大珠母貝稚貝海上中間培育技術(shù)的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。