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    廣西北部灣海域表層海水細(xì)菌多樣性及其潛在生物合成基因研究*

    2022-05-09 13:20:02蘇芯瑩王巧貞黃庶識楊慧歡覃仙玲
    廣西科學(xué)院學(xué)報 2022年1期
    關(guān)鍵詞:站位海水菌株

    李 菲,蘇芯瑩,李 喆,王巧貞,黃庶識,楊慧歡,覃仙玲**

    (1.廣西科學(xué)院,廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室,廣西南寧 530007;2.廣西科學(xué)院,廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點實驗室,廣西南寧 530007;3.南寧學(xué)院機電與質(zhì)量技術(shù)工程學(xué)院,廣西南寧 530200)

    海洋是地球上最大的水生生態(tài)系統(tǒng),約占地球總表面積的71%。海洋中海流、波浪、潮汐和風(fēng)暴潮等海水運動,可引起營養(yǎng)物質(zhì)大規(guī)模的水平/垂直運輸[1,2]。在洋流的驅(qū)動下,體積小、擴(kuò)散能力強的微生物遍布海洋的每個角落,承擔(dān)著海洋生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分循環(huán)和能量流動[3,4]。莊康等[5]指出,與陸地微生物相比,海洋微生物在物種類群、生理代謝通路及代謝產(chǎn)物等方面都更具新穎性和多樣性。故利用可培養(yǎng)方法來獲得海洋微生物資源,開展其生理生化特征與生態(tài)功能研究,對物種庫與功能基因庫的開發(fā)和應(yīng)用有著重要的意義。目前,關(guān)于廣西北部灣海域中可培養(yǎng)微生物的研究大多集中在海洋沉積物、海洋動植物及紅樹林生態(tài)系統(tǒng)[6,7],對海水中可培養(yǎng)微生物的研究鮮有報道,究其原因可能是海水中微生物的豐度、潛在新物種數(shù)量及其代謝功能均較海洋其他來源的微生物低,未獲得廣泛關(guān)注。本研究選取的3處近岸港灣分別為廣西北部灣茅尾海(002站位)、珍珠港(073站位)和北侖河口(067站位)。3處港灣的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)生物群落豐富,加上大量的生蠔養(yǎng)殖,豐富了海水中的組成成分,加快了能量和物質(zhì)循環(huán)速度,增強了微生物的生產(chǎn)力和有機質(zhì)的代謝能力。此外,067站位位于敞開式海域,002站位和073站位屬于半封閉內(nèi)海,使得3處海域中海水的硅酸鹽、銨鹽及鹽度等理化指標(biāo)上存在較大差異。

    本課題組致力于海洋沉積物、海洋動植物及紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中可培養(yǎng)微生物的分離鑒定及功能菌株的挖掘[8-11],深知開展微生物次級代謝活性物質(zhì)的分離、純化、組成和結(jié)構(gòu)解析等工作需要花費大量的精力、時間和費用,且往往會遇到次級代謝產(chǎn)物率低、重現(xiàn)性差和反復(fù)挖掘等問題[12]。此外,從微生物中分離到的化合物種類,遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其基因組中次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的數(shù)目,即有為數(shù)不少的基因簇在實驗室條件下表達(dá)量低或不表達(dá),難以在傳統(tǒng)研究中被發(fā)現(xiàn)[13,14]。因此,通過次級代謝產(chǎn)物生物合成基因篩選這一種快速發(fā)現(xiàn)新型化合物的方法,能高效提升篩選速度。其中,PKS是一種多功能酶復(fù)合物,催化如阿維菌素、雷帕霉素、紅霉素等聚酮類化合物的合成[15];NRPS則是一種非核糖體肽合成酶,催化如環(huán)孢菌素、博來霉素、達(dá)托霉素等多肽類化合物的合成[16]。Halo是一種具有修飾作用的酶,通過改變化合物的空間和電子效應(yīng),賦予微生物次級代謝產(chǎn)物生物活性,如黃素依賴型鹵化酶[17]。本研究選取廣西北部灣海域的3個站位,以其表層海水作為研究對象,通過4種分離培養(yǎng)基、分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,獲取海水中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性信息,并利用PKSⅠ型、PKSⅡ型、NRPS和Halo合成基因,對可培養(yǎng)海洋細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行篩選,挖掘潛在合成活性代謝產(chǎn)物的能力,為深入研究表層海水來源的海洋細(xì)菌多樣性及其功能提供前期基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品

    2021年8月中旬,采集廣西北部灣海域中3處站位的海水樣品,取樣點見圖1。3個站位分別為茅尾海(002站位)、珍珠港(073站位)和北侖河口(067站位)。對每個站位采集3 L表層海水(0.5 m深度)樣品。隨船記錄水溫、鹽度、pH值及溶解氧等環(huán)境參數(shù),營養(yǎng)鹽、化學(xué)需氧量(COD)、懸浮物及細(xì)菌總數(shù)等各指標(biāo)均待收集水樣后帶回實驗室測定,研究細(xì)菌多樣性的水樣置于50 mL無菌離心管中,4℃低溫保藏備用。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    (1)4種分離培養(yǎng)基:2216E固體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司),改良高氏一號固體培養(yǎng)基(GN培養(yǎng)基,可溶性淀粉10.0 g,葡萄糖1.0 g,甘油10 mL,復(fù)合鹽母液10 mL,瓊脂14.0 g,去離子水1 000 mL),P7固體培養(yǎng)基(L-酪氨酸0.5 g,L-天門冬酰胺1.0 g,甘油10 mL,復(fù)合鹽母液10 mL,瓊脂14.0 g,去離子水1 000 mL,pH值7.2-7.4),M5固體培養(yǎng)基(海藻糖5.0 g,脯氨酸1.0 g,瓊脂14.0 g,陳海水1 000 mL,pH值7.2-7.4)。復(fù)合鹽母液配方為KNO31.0 g,NaCl 15.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO40.5 g,NH4NO30.1 g,F(xiàn)eSO40.01 g,去離子水10 mL。

    (2)純化培養(yǎng)基:改良ISP2固體培養(yǎng)基(麥芽提取粉2.0 g,酵母粉2.0 g,葡萄糖2.0 g,去離子水1 000 mL,海鹽25.0 g,瓊脂14.0 g)。

    (3)含氨芐的LB固體培養(yǎng)基:酵母粉5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化鈉5.0 g,氨芐青霉素100 mg,瓊脂13.0 g,超純水1 000 mL,pH值為7.2-7.4。

    1.2 方法

    1.2.1 海水參數(shù)測定

    作業(yè)現(xiàn)場采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀(JFE AAQ171,日本)測定水溫、鹽度、pH值及溶解氧;參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.1-2007),對營養(yǎng)鹽(氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮、磷酸鹽及硅酸鹽)、化學(xué)需氧量、懸浮物濃度及細(xì)菌總數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行測定。

    1.2.2 菌株分離純化

    用無菌水將樣品稀釋成10-1、10-2和10-3濃度的樣液,取100 μL稀釋后的樣液涂布至4種固體培養(yǎng)基中,每個梯度兩個平行,28℃培養(yǎng)5-7 d,挑取肉眼可見菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),記錄其形態(tài)特征和菌落數(shù),以30%(V∶V)甘油-ISP2混合液作為保護(hù)劑,將純化好的菌株保藏于-80℃。

    1.2.3 16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

    用無菌牙簽挑取少量培養(yǎng)好的菌苔,放置于裝有無菌 chelex-100樹脂[18]的管子中進(jìn)行研磨,100℃加熱10 min后,5 000 r/min離心10 min,取上清液(細(xì)菌的DNA)為PCR模板,再根據(jù)Walsh等[19]的方法對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和測序引物均為細(xì)菌通用引物27F和1492R,PCR反應(yīng)條件參照李菲等[8]的方法設(shè)定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序分析。其中,潛在新物種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行切膠回收,將純化好的DNA連接pEASY-T1克隆載體上,轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落情況,隨機挑取5-6個菌落,用PCR法驗證克隆的片段大小并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后,利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net)進(jìn)行在線比對[20];選取同源性最高的菌株序列作為參比對象,運用MEGA7.0軟件,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Boostrap 1 000次檢測各分支的置信值,對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析[21],并使用EvolView對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化處理[22]。采用Excel軟件計算Simpson、Shannon-Wiener和Pielou生物多樣性指數(shù)[23],并用SPSS軟件分析可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性與海水理化參數(shù)的Pearson相關(guān)性。

    1.2.4 抗生素合成基因的擴(kuò)增及檢測

    對1.2.2節(jié)提取到的細(xì)菌DNA進(jìn)行NRPS、PKS和Halo基因擴(kuò)增。引物信息見表1,PCR擴(kuò)增參數(shù)參照文獻(xiàn)[24,25]的方法進(jìn)行設(shè)定。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 取樣站位的海水理化性質(zhì)

    取樣站位的環(huán)境特征與海水理化性質(zhì)如表2所示。3處取樣站位海水的營養(yǎng)鹽含量、鹽度、化學(xué)需氧量和懸浮物濃度均存在較大差異,溫度、pH值、溶解氧含量等指標(biāo)差別不大。

    表2 取樣站位的環(huán)境特征與海水理化性質(zhì)

    2.2 表層海水中可培養(yǎng)細(xì)菌

    本研究采集了廣西北部灣3處近岸海域的表層海水樣品,共獲得252株海洋細(xì)菌,隸屬于4門7綱20目25科37屬52種(圖2、圖3)。變形菌門(Proteobacteria,172株)、放線菌門(Actinobacteria,43株)、厚壁菌門(Firmicutes,22株)和擬桿菌門(Bacteroidetes,15株)分別占總分離菌株的68.25%、17.06%、8.73%和5.95%[圖2(a)]。在綱水平,γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,114株)細(xì)菌數(shù)最多,占總菌數(shù)的45.24%;其次為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,50株,19.84%)和放線菌綱(Actinomycetia,43株,17.06%)。此外,芽孢桿菌綱(Bacilli)、噬纖維菌綱(Cytophagia)、黃桿菌綱(Flavobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)分別包含22株、10株、5株和8株細(xì)菌[圖2(b)]。在屬水平(圖3),假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株最多,分離出33株(3種);其次是鏈霉菌屬(Streptomyces)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus),分別獲得25株(4種)、21株(2種)和19株(4種)。此外,袁其鵬屬(Qipengyuania)、噬冷菌屬(Algoriphagus)、交替單胞菌屬(Alteromonas)和鹽單胞菌屬(Halomonas)中的菌種數(shù)分別為3個、3個、3個和2個,其余29個菌屬中均僅分離到1種細(xì)菌。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因相似度低于98.65%屬于不同物種的歸類原則[26],本研究共分離培養(yǎng)出10株細(xì)菌的潛在新種 (表3),分別屬黃桿菌綱、噬纖維菌綱、α-變形菌綱和γ-變形菌綱,其數(shù)目分別為4株、1株、2株和3株。

    表3 表層海水中潛在新型菌株

    續(xù)表

    圖2 表層海水可培養(yǎng)細(xì)菌在門(a)和綱(b)水平的組成分布

    對不同站位分離的細(xì)菌類群比較發(fā)現(xiàn),002站位、067站位和073站位分別獲得細(xì)菌76株(21屬25種)、102株(23屬31種)和74株(16屬19種)(表4)。其中,有8個屬的細(xì)菌僅在002站位中分離得到,11個屬的細(xì)菌僅在067站位中分離得到,4個屬的細(xì)菌僅在073站位中分離獲得,而有9個屬的細(xì)菌在這3個站位均能分離得到(圖4)。對3處站位細(xì)菌多樣性與環(huán)境參數(shù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,銨鹽和溶解氧含量與細(xì)菌總數(shù)呈正相關(guān)性,存在顯著性差異(P<0.05)。細(xì)菌種類與硅酸鹽、鹽度也存在顯著性差異,硅酸鹽、磷酸鹽和鹽度在3處海域的細(xì)菌多樣性上有顯著性差異(表5),而海水中的亞硝酸鹽、硝酸鹽、懸浮物及海水的pH值、溫度、COD與3處海域的細(xì)菌多樣性不相關(guān)(P>0.05)。

    表5 3處站位細(xì)菌多樣性與環(huán)境參數(shù)的Pearson相關(guān)性分析

    續(xù)表

    紅色三角符號表示該菌為潛在的新分類單元

    表4 3處站位及4種培養(yǎng)基中細(xì)菌屬級群類分布

    續(xù)表

    圖4 3處站位來源海洋細(xì)菌屬級群類的維恩分析

    2.3 培養(yǎng)基的分離效果

    采用4種分離培養(yǎng)基對表層海水中海洋細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),分離到細(xì)菌多樣性情況如表6所示。就多樣性指數(shù)可知,2216E培養(yǎng)基的Simpon指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou指數(shù)均高于M5、P7和GN培養(yǎng)基。在綱水平,α-變形菌綱、γ-變形菌綱、放線菌綱和芽孢桿菌綱的細(xì)菌在4種培養(yǎng)基均能分離獲得;2216E和M5培養(yǎng)基中均分離到β-變形菌綱、黃桿菌綱和噬纖維菌綱的細(xì)菌,P7培養(yǎng)基中分離到1株黃桿菌綱的細(xì)菌,GN則未分離到3個綱的細(xì)菌。在屬水平(表4),2216E、M5、P7和GN培養(yǎng)基均獲得鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細(xì)菌,其中,優(yōu)勢類群假單胞菌屬在GN培養(yǎng)基中菌株數(shù)目最多;作為本次分離培養(yǎng)的第二大優(yōu)勢類群,鏈霉菌屬(Streptomyces)在2216E培養(yǎng)基中菌株數(shù)目最多,但在P7培養(yǎng)基中未分離到。此外,分別有7個、2個、2個與1個屬的細(xì)菌僅在2216E、M5、P7及GN培養(yǎng)基中被培養(yǎng)。其中,2216E培養(yǎng)基中分離出6株細(xì)菌的潛在新種,GN和P7培養(yǎng)基中各培養(yǎng)出3株和1株(表3)。

    表6 不同培養(yǎng)基分離到細(xì)菌多樣性情況

    2.4 抗生素合成基因的檢測結(jié)果

    為了進(jìn)一步評價52種細(xì)菌是否存在次級代謝產(chǎn)物生物合成的潛能,對其進(jìn)行PKS、NRPS和Halo基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增和電泳檢測結(jié)果(表7)顯示,22種細(xì)菌均至少擴(kuò)增出1條目的條帶,即其含有1種次級代謝產(chǎn)物合成基因。其中,PKSⅡ基因在15株細(xì)菌中檢測到;Halo基因在13株細(xì)菌中檢測到,3株細(xì)菌含PKSⅠ基因和2株細(xì)菌檢測到NRPS基因,有10株細(xì)菌含2種或2種以上的生物合成基因簇。

    表7 3類生物合成基因在22種細(xì)菌中的分布

    續(xù)表

    3 討論

    從總體上看,該研究區(qū)域中海水可培養(yǎng)優(yōu)勢細(xì)菌類群與大多數(shù)前人研究報道[22,27]較為一致,主要由γ-變形菌、α-變形菌、擬桿菌和放線菌等優(yōu)勢菌群組成。其中,γ-變形菌類群相對豐度最高(114株,45.24%),同時檢測到海水中硝酸鹽、磷酸鹽、銨鹽等無機鹽濃度較高,兩者是否存在關(guān)聯(lián),仍需要進(jìn)一步去考證。此外,3處海域海水中的細(xì)菌群落組成存在明顯差異。其中,細(xì)菌總數(shù)排序為珍珠港(073站位)<茅尾海(002站位)<北侖河口(067站位),細(xì)菌種類排序為北侖河口(067站位) >茅尾海(002站位)>珍珠港(073站位)。珍珠港(073站位)內(nèi)潮流暢通、水質(zhì)清澈,隨著養(yǎng)殖珍珠貝的數(shù)量減少,鋼鐵、火電和紙漿等工業(yè)快速發(fā)展,環(huán)境污染驟增,尤其是重金屬類污染[28]。作為相同半封閉內(nèi)海,茅尾海(002站位)是廣西沿海最大的養(yǎng)殖區(qū),由于受到周邊江水匯集和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的影響,海水中大量的營養(yǎng)物質(zhì)聚集,重金屬污染加劇[29]。研究指出,重金屬污染物可迅速地與懸浮物和沉積物結(jié)合而沉入海底,海水中重金屬含量大大降低[30]。此外,海水的重金屬含量與細(xì)菌數(shù)量的分布呈不同程度的相關(guān)性,一定濃度的重金屬含量可對細(xì)菌的生長起到促進(jìn)作用[30]。相比之下,敞開式淺水港灣北侖河口具有連片生長紅樹林,動植物種類組成和群落結(jié)構(gòu)隨海岸類型變化而呈多樣化等特征,加速了海水運動,提升了營養(yǎng)物質(zhì)反復(fù)置速率,使得該區(qū)域表層海水鹽度低,銨鹽、硅酸鹽和溶解氧含量高,更利于多種微生物生存。此外,海水運動驅(qū)使下,表層和底層菌群趨于平衡,進(jìn)而豐富細(xì)菌類群組成。

    本研究采用4種營養(yǎng)類型與濃度差異較大的培養(yǎng)基,分別對北部灣3處海域表層海水進(jìn)行細(xì)菌的分離純化培養(yǎng)。結(jié)果表明,2216E培養(yǎng)基分離到的細(xì)菌種類和數(shù)量最多,其次是M5培養(yǎng)基,P7和GN培養(yǎng)基分離到的最少。其中,GN培養(yǎng)基主要以淀粉、葡萄糖和甘油等碳源為主,常用于分離培養(yǎng)放線菌及觀察其形態(tài)特征;GN培養(yǎng)基中分離到的兩大放線菌類群鏈霉菌和微桿菌,在廣西北部灣已發(fā)現(xiàn)的海洋細(xì)菌類群中占最高比例,在土壤、水體和植物內(nèi)都占據(jù)絕對優(yōu)勢[7,9];GN培養(yǎng)基中未篩選到擬桿菌門類群,大多數(shù)擬桿菌可產(chǎn)生多種功能的胞外酶[31],而酶的合成與分泌需要大量的營養(yǎng)物質(zhì),尤其是氮源[32],故推測該類群難以在單一營養(yǎng)源的GN培養(yǎng)基中生長。相比較,2216E培養(yǎng)基更適合分離培養(yǎng)海水中的細(xì)菌,獲得潛在新分類單元的菌株數(shù)高于其他培養(yǎng)基。因此,在分離海水中可培養(yǎng)細(xì)菌時,可通過營養(yǎng)類型多元化來培養(yǎng)更多的細(xì)菌資源。

    在52種細(xì)菌中,有22種細(xì)菌檢測出抗生素生物合成基因,總陽性率為42.31%。相對于紅樹植物和沉積物來源細(xì)菌,本研究海水來源細(xì)菌中檢測到的抗生素生物合成基因率偏低,其可能原因是紅樹林生境中有機質(zhì)較其他海洋區(qū)域的豐富[33],富含動植物殘體的脂素、蛋白和纖維素等營養(yǎng)物質(zhì),促使其菌落組成多樣化,可加快能量和物質(zhì)循環(huán)速度,增強生產(chǎn)力和有機質(zhì)的降解活性[34]。

    4 結(jié)論

    廣西北部灣海域表層海水中具有豐富的可培養(yǎng)細(xì)菌,具有較高的物種多樣性,蘊藏著潛在新物種資源,且具有合成聚酮類、非核糖體肽類化合物及鹵化酶的潛能,為后續(xù)開展拮抗菌篩選工作及其活性化合物的研究提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。

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