漆酶/TEMPO體系氧化殼寡糖的制備及其抗脂質氧化效果的研究*

唐延東，楊曉莉，潘玙璠，張方東，侯慶喜，裴繼誠

(天津科技大學 輕工科學與工程學院，天津市制漿造紙重點實驗室，天津 300457)

0 引 言

自由基是一種在光熱等外界條件下，共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，其廣泛存在于自然界之中[1]。其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類化學性質活潑的自由基的總稱[2]。ROS有較高的氧化活性，會使機體的代謝產生失衡。脂質過氧化作用是典型的自由基鏈式反應，一般表現為不飽和脂肪酸的氧化變質。這些脂肪酸在自由基作用下生成自由基中間產物L·，然后與O2反應形成脂質過氧自由基LOO·，后者與另一脂質作用形成脂質過氧化物LOOH。這些脂質過氧化物可以自發(fā)分解，形成更多的自由基來攻擊脂類的雙鍵，產生更多的脂質過氧自由基，并依次傳遞下去，形成自動分解的鏈式反應，造成更大的破壞[3]。

脂質過氧化反應造成的危害越來越多的被研究學者所發(fā)現，比如脂質氧化產物會直接參與細胞衰亡的信號傳導，導致人體衰老[4]；脂質過氧化反應也是誘發(fā)動脈粥樣硬化[5]、糖尿病[6]、惡性腫瘤[7]等疾病的重要原因。除去不適用于人體的人工抗氧化劑以外，目前還發(fā)現了多種具有抗氧化功效的天然物質，如維生素、多酚類、天然黃酮類、阿魏酸等[8]，但它們都存在著不穩(wěn)定、成本高、不易吸收、容易失活等缺點。因此，尋找一種合適的、高效的外源抗氧化劑，在維持機體平衡上變得尤為重要。

殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)是來源于蝦蟹殼的殼聚糖降解成的帶有氨基的小分子寡糖，是世界上最豐富的可再生資源之一[9]。其具有諸多優(yōu)良的生物活性，如分子量小、溶解性高、生物活性高、人體易吸收等。鑒于其具有的優(yōu)良性能，不斷涌現出新的殼寡糖的改性方法，其中化學改性方面的研究居多，有羥基化、烷基化、交聯(lián)化、接枝化以及羧基化等改性方向[10-11]?，F有研究可以證明，COS及其改性的衍生物具有一定的抗氧化作用[12-13]。

漆酶/TEMPO體系可以選擇性地將殼寡糖C6位上的羥基氧化為醛基進而氧化為為羧基，得到含有羧基的氧化殼寡糖(C-COS)[14-15]。近年來，本課題組對于C-COS的制備進行了一系列研究[16]，并證明其具有良好的保濕性[17]、抗黑色素沉積[18]及抗菌性能[19]。亞油酸(linoleic acid)和卵磷脂(lecithin)是人體中多不飽和脂肪酸(PUFA)的代表，亞油酸是一種ω-6多不飽和脂肪酸，是人體生長發(fā)育的必需脂肪酸；以卵磷脂為代表的磷脂構成了機體細胞膜50%左右的脂質，這些磷脂是維持生命活動的基礎物質。脂質過氧化的發(fā)生，意味著多不飽和脂肪酸上不飽和鍵的破壞。本文通過一種綠色化學的方法制備出C-COS，使其分子結構中C6位含有羧基，選取亞油酸和卵磷脂作為實驗對象，進行自由基誘導的體外脂質氧化實驗來驗證C-COS的抗脂質氧化能力，目的是尋找一種安全的、穩(wěn)定的，對脂質過氧化反應具有良好抑制效果的材料。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

漆酶，酶活1072 U/mL，由諾維信生物技術有限公司提供；2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)，購于Sigma公司；殼寡糖，相對分子質量≈1000，脫乙酰度為90.5%，購于上海源葉生物科技有限公司；蛋黃卵磷脂，水分≤5%，購于Solarbio公司；亞油酸，含量≥95%；其他試劑均為分析純，購于麥克林試劑網。

旋轉蒸發(fā)儀，型號N-1100，京東理化；傅里葉變換紅外光譜儀，型號VERTEX 70，德國布魯克公司；自動電位滴定儀，型號AT-510，日本京都電子工業(yè)株式會社；核磁共振波譜儀，型號AVANCE Ⅲ，德國布魯克公司；紫外分光光度計，型號UV-2550，日本島津公司。

1.2 羧基化殼寡糖(C-COS)的制備及表征

將0.08 g(2%)的TEMPO放入200 mL， pH值為4.7的乙酸-乙酸鈉溶液中，加入4 g殼寡糖充分攪拌，使其溶解均勻。在30 ℃的恒溫條件下使其穩(wěn)定10 min后，加入400 μL漆酶至溶液中，在30 ℃下通氧反應18 h。通氧結束后，用稀NaOH溶液將反應體系調整至中性，通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮至10～20 mL，加入400 mL無水乙醇并不斷攪拌，待靜置分層后反應產物析出。利用真空抽濾得到反應物濾渣，加入蒸餾水重復以上操作3次以充分醇洗、水洗產物。最后，將得到的濾渣在真空干燥箱內烘干72 h，經研磨后得到制備好的羧基化殼寡糖。最后將制得的樣品通過FT-IR、13C NMR和電導滴定檢測，確認COS成功被選擇性氧化[16,18]。

1.3 對脂肪酸進行自由基誘導的氧化

取一定量蛋黃卵磷脂，加入0.01 moL/L， pH 值為7.4 PBS緩沖液，攪拌使其溶解成20 mg/mL的溶液。將溶液超聲乳化1 min，形成卵磷脂脂質體，低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 羥基自由基對脂肪酸的氧化

羥基自由基是一種最常見、破壞性最強的自由基。分別取2 mL卵磷脂脂質體和2 mL亞油酸(溶于無水乙醇)，實驗組分為兩組，均先加入1 mL、6 mmoL/L的FeSO4溶液和1 mL、6 mmoL/L的H2O2溶液，再分別加入2 mL、5 mg/mL的COS和C-COS溶液混勻；空白組加入等量的蒸餾水，使3組樣品在37 ℃水浴鍋內避光溫浴氧化1 h[20]。將氧化后萃取出反應體系中的脂肪酸成分，后經過旋轉蒸發(fā)得到氧化后的對比組。

1.3.2 AAPH自由基對脂肪酸的氧化

AAPH是一種在有氧條件下，熱分解形成的過氧脂質自由基。分別取2 mL卵磷脂脂質體和2 mL亞油酸(溶于無水乙醇)，氧化組加入2mL 0.1 moL/L AAPH啟動氧化反應。實驗組分別加入2 mL COS和C-COS溶液(5 mg/mL)，37 ℃避光溫浴1 h，空白組加入等體積的蒸餾水。萃取過程同上，得到經過AAPH自由基氧化后的對比組。

1.3.3 Cu2+自由基對脂肪酸的氧化

過渡金屬元素都是重要的脂質氧化參與者，一些過渡金屬離子可以作為電子傳遞體發(fā)揮作用，其可以等同于自由基進行反應。分別取2 mL卵磷脂脂質體和2 mL亞油酸(溶于無水乙醇)，氧化組加入2 mL 0.1 mmoL/L醋酸銅溶液啟動氧化反應。實驗組分別加入2 mL COS和C-COS溶液(5 mg/mL)，37 ℃避光溫浴1 h，空白組加入等體積的蒸餾水。萃取過程同上，得到經過Cu2+氧化后的對比組。

1.4 脂肪酸氧化產物的檢測

1.4.1 共軛二烯含量的檢測

共軛二烯是脂質過氧化反應生成的初級產物，將1.3實驗中兩種脂肪酸在3種自由基氧化后的各實驗組樣品經過乙醇稀釋后，以乙醇為參比溶液用紫外分光光度計在234 nm測量樣品的吸光度，雙鍵濃度可用摩爾濃度因數計算求得(雙鍵的摩爾吸光率為3.0×104L/(moL·cm))[21-22]，并計算其抑制率。

共軛二烯生成抑制率(%)=(A2-A1)/A0×100%

(1)

式中：A0為脂肪酸原樣的吸光度；A2為對比組脂肪酸吸光度；A1為各樣品組的脂肪酸吸光度。為了避免實驗誤差，式中均減去了COS和C-COS樣品本身的吸光度，并且每組實驗測量3次，取得最后的平均值。同時設置空白對照組來消除乙醇對自由基捕獲作用造成的影響，下同。

1.4.2 丙二醛含量的檢測

丙二醛是脂質過氧化反應的次級產物，具有很高的危害性，其含量也代表了脂質過氧化反應的進程。取1.3實驗中所得的樣品溶于乙醇中，加入2 mL TCA-TBA-HCL混合溶液，沸水浴15 min，經過冰浴后用紫外分光光度計在532 nm測量樣品的吸光度。(MDA的摩爾吸光率為1.56×105L/(moL·cm))[23-24]，并計算其抑制率。

丙二醛生成抑制率(%)=(A2-A1)/A0×100%

(2)

1.4.3 過氧化物含量的檢測

油脂氧化后會生成氫過氧化物，它可以將碘化鉀溶液還原成碘，采用硫代硫酸鈉溶液滴定析出的碘單質來比較不同亞油酸氧化后產生的過氧化值。取1.3實驗中所得的樣品，稱量后置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液(2∶3)，溶解樣品后加入1 mL飽和碘化鉀溶液于暗處靜置3 min。再加入30 mL蒸餾水后搖勻，滴加1 mL淀粉指示液(10 g/L)，立即用前先已經精準標定好的硫代硫酸鈉標準溶液(0.10 mol/L)滴定至藍紫色消失。同時取用相同量的試劑，用水做空白試驗。

過氧化物的含量按式(3)計算：

X=(V1-V2)×c×0.1269/m

(3)

式中：X為過氧化值，g/100g；V1為消耗的硫代硫酸鈉溶液體積；V2為空白組消耗的硫代硫酸鈉溶液體積；c為硫代硫酸鈉溶液濃度；m為樣品質量；0.1269為1 mL、1 mol/L硫代硫酸鈉溶液相當的碘的質量。

1.5 脂肪酸氧化后結構檢測

1.5.1 紅外光譜(FI-IR)檢測

選取氧化程度最強的自由基來催化兩種脂肪酸的氧化，對兩種脂肪酸的原樣組，對比樣組、C-COS組的官能團變化進行分析。取適量反應后的亞油酸和卵磷脂涂到傅里葉變換紅外光譜儀的ATR檢測臺上，以空氣為采樣背景，掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描32次。

1.5.2 核磁共振氫譜(1H NMR)檢測

將1.5.1實驗中兩種脂肪酸的原樣組，對比樣組、C-COS組進行1H NMR檢測。兩種油樣均以氘代氯仿為溶劑，采用30°脈沖序列，采樣時間定為1.36 s，弛豫時間是1.89 s，累計掃描次數為1 024次。

2 結果與討論

2.1 C-COS抑制脂質氧化性能檢測

2.1.1 生成共軛二烯含量的檢測

共軛二烯是脂質過氧化反應的初級產物，在亞油酸和卵磷脂啟動氧化后分別加入COS和C-COS，檢測共軛二烯產生量的變化情況，考察COS和C-COS的抗脂質氧化能力，其結果如圖1所示。

由圖1可以看到,羥基自由基對兩種脂肪酸氧化程度最強，產生的共軛二烯含量最高。通過對比COS組和C-COS組的檢測可以看出，兩個實驗組產生的共軛二烯含量均有所下降，代表著其初級產物減少，說明COS和C-COS均可對自由基誘導的氧化進行抑制。經計算，C-COS相較于COS對亞油酸被自由基催化生成共軛二烯的抑制率分別提高了54%、7%、42%，對卵磷脂的抑制率分別提高了54%、38%、26%。

圖1 羥基自由基、AAPH自由基和Cu2+離子氧化亞油酸(a)和卵磷脂(b)產生的共軛二烯含量Fig 1 Amount of conjugated dienes produced by oxidation of linoleic acid and lecithin by hydroxyl radical, AAPH radical, and Cu2+ ion

2.1.2 生成丙二醛含量的檢測

丙二醛是脂質過氧化反應的次級產物，在亞油酸和卵磷脂啟動氧化后分別加入COS和C-COS，檢測丙二醛產生量的變化情況，考察COS和C-COS的抗脂質氧化能力，其結果如圖2所示。

圖2 羥基自由基、AAPH自由基和Cu2+離子氧化亞油酸(a)和卵磷脂(b)產生的丙二醛含量Fig 2 Amount of malondialdehyde produced by oxidation of linoleic acid and lecithin by hydroxyl radical, AAPH radical, and Cu2+ ion

由圖2可以看出,羥基自由基氧化程度最強，其次是銅離子和AAPH自由基。分別加入COS和C-COS后，丙二醛的生成量會有不同程度的降低，丙二醛的含量減少證明了脂質氧化的抑制程度。COS和C-COS對羥基自由基和Cu2+離子的抑制程度最強，經計算，C-COS相較于COS對亞油酸被自由基催化生成丙二醛的抑制率分別提高了55%、7%、36%，對卵磷脂的抑制率分別提高了55%、36%、26%。

2.1.3 不同自由基氧化脂肪酸產生的過氧化值比較

過氧化值是脂肪酸被氧化程度的一種測量指標。在亞油酸和卵磷脂啟動氧化后分別加入COS和C-COS，檢測過氧化值的變化情況，考察COS和C-COS的抗脂質氧化能力，其結果如圖3所示。

由圖3可以看出,C-COS組相比于COS組，其過氧化值均有下降，對脂肪酸產生過氧化物的抑制效果均有提升，但主要在羥基自由基提升較為顯著。經計算，C-COS相較于COS對亞油酸被氧化產生過氧化值的抑制率分別提高了51%、43%、8%，對卵磷脂的抑制率分別提高了15%、50%、21%。

圖3 羥基自由基、AAPH自由基和Cu2+離子氧化亞油酸(a)和卵磷脂(b)產生的過氧化值Fig 3 Peroxide values generated from linoleic acid and lecithin oxidized by hydroxyl radical, AAPH radical, and Cu2+ ion

2.2 脂肪酸氧化后結構分析

2.2.1 紅外光譜分析

選取氧化效果最強的羥基自由基進行誘導氧化，通過紅外光譜分析亞油酸和卵磷脂被氧化前后結構的變化，并與加入C-COS樣品后的譜圖進行比較，亞油酸和卵磷脂的紅外吸收光譜如圖4所示。

圖4 亞油酸(a)和卵磷脂(b)的FT-IR 圖Fig 4 FT-IR spectra of linoleic acid and lecithin

由圖4(a)可以看出,亞油酸氧化后，對比樣組940 cm-1處出現一個新的峰，為共軛二烯特有的吸收峰。這是亞油酸受到自由基的攻擊失去電子而產生的共軛中間形態(tài)[25]。1 710 cm-1處羰基的吸收峰增強，這可能是脂質氧化生成的降解產物導致的，如丙二醛(MDA)[26]。在加入C-COS樣品后(圖4a(c))，1 710處和940 cm-1處的吸收峰強減弱，這印證了2.1.1和2.1.2中的結果，即初級產物和次級產物：共軛二烯和丙二醛的生成量減少，說明加入C-COS后，脂質氧化一定程度上受到抑制。

由圖4(b)可以看出,卵磷脂氧化后(圖4b(b))，1 556 cm-1處峰強減弱，這是C=C伸縮振動對應的特征峰，推斷可能是卵磷脂分子上的不飽和雙鍵受到破壞。1 240 cm-1處峰強減弱，推斷可能是卵磷脂分子上P=O鍵受到了攻擊，而C-COS組(圖b(c))中C=C鍵和P=O鍵吸收峰與對比樣相比較原樣減弱不大。說明加入C-COS后，卵磷脂的氧化也受到抑制。

2.2.2 核磁共振氫譜分析

為與紅外光譜相結合來驗證亞油酸和卵磷脂氧化后及加入C-COS結構的變化，采用核磁共振波譜儀進行檢測，所得的1H NMR譜圖分別如圖5和圖6所示。

圖5 亞油酸的1H NMR圖Fig 5 1H NMR spectra of linoleic acid

圖6 卵磷脂的1H NMR圖Fig 6 1H NMR spectra of lecithin

圖5是亞油酸原樣的1H NMR譜圖。在氧化后，對比樣組δ=5.41～5.29(9、10、12、13位置上)的積分由3.64減小到3.42、δ=2.79 (11位置上)的積分由1.77減小到1.61。δ=1.39～1.25(4～7，15～17位置上)的積分由14.03增大到14.14，推測這可能是由于經過氧化進程中，亞油酸分子遭到破壞導致其鏈的破裂，亞甲基數量增多。同時雙鍵被自由基攻擊而破壞，其間的H被俘獲，導致其數量減少。而C-COS組9、10、12、13位置和11位置積分分別為3.61和1.75，較對比樣組積分有所增大；4～7，15～17位置的峰積分為14.09，較對比樣組積分有所減小。說明加入了C-COS后，氧化受到了抑制。

圖6是卵磷脂原樣的1H NMR譜圖。在氧化后，δ=5.36(52～55位置上)的積分值由4.03增大到4.90，而加入C-COS后該處峰的積分值為4.79，較對比組積分有所減小?？梢哉J為是經過氧化后卵磷脂分子上的不飽和雙鍵受到破壞，但C-COS的添加抑制了這一破壞效果，這也印證了上文紅外光譜的結果。

2.3 抑制脂質過氧化機理

通過對比各組COS和C-COS的抗脂質氧化實驗，發(fā)現C-COS抑制脂質過氧化的能力相比COS均有不同程度的增強，推斷它們的抑制機理如圖7所示。

圖7 COS與C-COS對脂質過氧化的抑制機理Fig 7 Inhibitory mechanism of COS and C-COS on lipid peroxidation

從圖7中C0S路線可以看出，由于COS中C2位上含有氨基(-NH2)，它可以提供電子并捕獲自由基，最終生成穩(wěn)定的大分子自由基(RH)[27]。這解釋了COS本身就可以抑制自由基誘導的脂質氧化反應。但經過漆酶/TEMPO體系，COS的C6位羥基被選擇性地氧化為羧基(-COO-)而轉變?yōu)榫哂懈呖怪|氧化效果的C-COS。即圖7中C-C0S路線，羧基一方面具有與過渡金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)螯合的能力[28]，從而避免其催化產生自由基；另一方面螯合作用可以讓C2上氨基更多地暴露在糖鏈外側，使其更充分地捕獲自由基。這兩種途徑相結合，協(xié)同提升了自由基的捕獲效率，且C-COS與被氧化底物不飽和脂肪酸形成了競爭機制而起到保護作用。由于自由基的減少，從源頭起到了抑制脂肪酸被自由基氧化的程度。

3 結 論

(1)利用漆酶/TEMPO體系選擇性的將殼寡糖C6上的羥基氧化成羧基，得到C-COS。通過體外實驗法，發(fā)現加入C-COS較COS生成的共軛二烯含量、丙二醛含量和過氧化值均有下降，證明了其具有更好的抑制脂質氧化的效果，說明這一新型材料在抗脂質氧化方面有較大的應用價值。

(2)通過FT-IR和1H NMR，檢測了亞油酸和卵磷脂被氧化前后結構的變化，并與加入C-COS樣品后的譜圖進行比較，證實了C-COS的添加可以保護脂肪酸上的不飽和雙鍵，從而抑制其脂質過氧化反應。

(3)根據氨基可以捕獲自由基、羧基可以螯合金屬離子這兩種性質，進一步推斷出C-COS有較好抑制效果的原因，說明C6位羧基和C2氨基在清除自由基、減少脂質氧化方面起積極作用。這也為殼寡糖類似結構物質的改性及應用提供了重要思路。