基于自主核酸提取方法分析單油井采出液微生物＊

熊駟駿 萬(wàn)云洋 穆紅梅 李文宏 費(fèi)佳佳 徐飛艷 陳?ài)`發(fā)

(1.中國(guó)石油大學(xué)(北京)油氣資源與探測(cè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，地層微生物資源與應(yīng)用研究中心，油氣污染防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，非常規(guī)油氣科學(xué)技術(shù)研究院；2.中國(guó)石油集團(tuán)長(zhǎng)慶油田分公司勘探開(kāi)發(fā)研究院)

0 引 言

由于微生物技術(shù)在油藏領(lǐng)域逐漸廣泛的應(yīng)用，使用常規(guī)培養(yǎng)[1-2]和免培養(yǎng)[3-4]方法研究其微生物變化特征的報(bào)道越來(lái)越多，一般對(duì)油田油藏樣品都是從油田取樣帶回實(shí)驗(yàn)室再進(jìn)行后續(xù)分析[5]，樣品中微生物信息往往隨樣品保存時(shí)間的延長(zhǎng)而失真，由此開(kāi)發(fā)了系列基于油田現(xiàn)場(chǎng)的培養(yǎng)[6-9]和免培養(yǎng)[10-11]技術(shù)用于原位快速分析指導(dǎo)油田生產(chǎn)實(shí)踐，結(jié)果表明以原位直接提取采出液總DNA為主的免培養(yǎng)方法能較好反映油藏樣品真實(shí)性。

由成千上萬(wàn)種烴類(lèi)和非烴類(lèi)化合物組成的原油[12-14]具有黏稠、濃黑、生物量低和試劑可及性差等特點(diǎn)，使得直接對(duì)油藏樣本總DNA的提取造成困難，成為油藏微生物多樣性研究的一大難題。目前對(duì)油井采出液微生物總DNA提取報(bào)道極少，在為數(shù)不多的相關(guān)報(bào)道中大多只是對(duì)原油樣品使用通用的針對(duì)環(huán)境樣本的商業(yè)基因組DNA試劑盒進(jìn)行提取[15-17]，針對(duì)性不強(qiáng)。本文基于自主DNA提取方法(原油核酸法)[1-11]，使用γ-戊內(nèi)酯等陽(yáng)-陰表活劑法并對(duì)操作方法進(jìn)行一定優(yōu)化，再通過(guò)高通量測(cè)序分析對(duì)開(kāi)發(fā)單井油水樣品進(jìn)行原油核酸法應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材 料

從長(zhǎng)慶油田的Q2YG138140生產(chǎn)井井口以避免污染的方法[18]采集了采出液(地層水和原油)樣品。實(shí)驗(yàn)試劑耗材[13]若無(wú)特別說(shuō)明，均為市售分析純，經(jīng)無(wú)菌處理使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原油密度和黏度測(cè)定

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[19-20]測(cè)定原油密度和黏度，簡(jiǎn)單的說(shuō)，取適量原油混合均勻并預(yù)熱，待對(duì)應(yīng)儀器溫度穩(wěn)定(密度計(jì)為28℃，黏度計(jì)為20℃)后讀數(shù)并記錄結(jié)果，密度的測(cè)量是將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量的玻璃砝碼懸空緩慢浸沒(méi)入裝有原油的燒杯中，通過(guò)測(cè)量浮力的變化計(jì)算出原油密度；黏度的測(cè)量是將標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)子放入填充好原油的套筒中，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)速時(shí)產(chǎn)生的扭矩而折算成黏度值。

1.2.2 樣本預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)所用試劑耗材經(jīng)高壓蒸汽滅菌(滅菌程序?yàn)?21℃，20 min)處理。4種孔徑(10.00，1.00，0.22，0.10 μm)的聚碳酸酯濾膜，由75%酒精浸泡10 min后經(jīng)反滲透(RO)純化水洗滌潤(rùn)濕，然后放入組裝好經(jīng)消毒滅菌后的砂芯過(guò)濾裝置[21]。

采出液即刻在長(zhǎng)慶油田現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行靜置油水分層(2～3 h)，分層采出液(上油下水)油相和水相均分別進(jìn)行基因組DNA提取。

油相樣品的預(yù)處理參考原油核酸法[10-11]，水相樣品(500 mL)經(jīng)過(guò)裝有4種濾膜的設(shè)備依次逐級(jí)抽濾，將所得各級(jí)濾膜分別置于無(wú)菌離心管中，4℃保存，1 d內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室分析[21]。

1.2.3 樣本基因組DNA提取和驗(yàn)證

上一步靜置分層并經(jīng)預(yù)處理后的油相和水相(4種抽濾后的濾膜)基因組總DNA的提取參考原油核酸法。該方法相對(duì)于目前常規(guī)的提取方法，主要不同之處在于改良了分離和富集原油微生物的方法，原創(chuàng)性的緩沖液組合的配比體系使細(xì)胞裂解更徹底；并針對(duì)性地優(yōu)化了純化核酸的方法和步驟，相對(duì)于常規(guī)的商業(yè)試劑盒，該方法在保證提取質(zhì)量的同時(shí)也提高了時(shí)效性和重復(fù)性[10-11]。油相基因組總DNA經(jīng)4℃密封保藏7 d內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室分析。

應(yīng)用納量光度儀(NanoPhotoMeter 330，P-Class，音譜堎公司(Implen GmbH Schatzbogen)，德國(guó))和1%的瓊脂糖溶液電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.2.4 高通量測(cè)序以及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

PCR(伯樂(lè)(BIO-RAD)快速自動(dòng)編程PCR儀，C1000，美國(guó))所用引物為覆蓋16S rRNA基因V4區(qū)域的細(xì)菌、古菌通用引物515F(5′-GTGCCAGCMG-CCGCGGTA-3′)和806R(5′-GGACTACVSGGGTA- TCTAAT-3′)[22-23]。提取產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序分析[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié) 果

2.1.1 采出液樣本基因組總DNA提取結(jié)果

原油樣品的密度為0.838 g/cm3(28℃)，黏度為9.400 mPa·s(20℃)，屬于稀油樣本[25-26]。

研究表明，油相樣本總DNA濃度((3.07±0.11)μg/g)經(jīng)密度轉(zhuǎn)換后((2.57±0.09) μg/mL)遠(yuǎn)高于單位體積內(nèi)水樣樣本各級(jí)濾膜的總DNA濃度(各級(jí)濾膜總DNA分別為(9.89±0.76)，(7.51±0.47)，(4.36±0.29)，(2.45±0.30) ng/mL)(表1)，表明油藏有豐富的嗜油微生物。電泳結(jié)果顯示油相和水相對(duì)應(yīng)的提取產(chǎn)物在經(jīng)擴(kuò)增后均能產(chǎn)生特異性條帶，表明此方法提取到的油藏采出液基因組總DNA的質(zhì)量(圖1)可進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 Q2YG138140采出液基因組總DNA濃度

注：電泳條帶M表示核酸標(biāo)志物，1～4依次對(duì)應(yīng)Q2YG138140采出液樣品4種濾膜依次提取的微生物總DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，5為Q2YG138140樣品油相微生物總DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 提取Q2YG138140采出液總DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠(1%)電泳圖

2.1.2 采出液群落組成

高通量測(cè)序共得到采出液菌群總DNA原始序列63 487條，有效序列63 274條，樣品測(cè)序覆蓋度為99.66%，測(cè)序深度達(dá)到分析要求且數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠?；?7%相似度的分類(lèi)水平，共注釋到105個(gè)細(xì)菌和古菌的OTU，分屬于21門(mén)、43綱、73目、124科和183屬。所有門(mén)及相對(duì)豐度排名前20屬[27]的菌檢出情況(圖2)表明，采出液總菌群主要菌門(mén)依次是變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、桿狀菌門(mén)(Bacteroidetes)等，其中優(yōu)勢(shì)門(mén)為變形菌門(mén)。主要菌屬依次是蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、水小桿菌屬(Aquabacterium)、不運(yùn)桿菌屬(Acinetobacter)等，優(yōu)勢(shì)屬為蛭弧菌屬。原油核酸法對(duì)Q2YG138140采出液檢出的門(mén)和屬水平菌群分類(lèi)情況見(jiàn)表2。

注：*目前未知微生物。圖2 Q2YG138140采出液門(mén)水平(a)、變形菌門(mén)綱水平(b)及屬水平(c)菌群相對(duì)豐度

表2 原油核酸法對(duì)Q2YG138140采出液檢出的門(mén)和屬水平菌群分類(lèi)情況

2.1.3 采出液油相和水相的群落組成

采出液中油相共檢出11門(mén)，水相共檢出17門(mén)，油相和水相共有6門(mén)是變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、桿狀菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、酸桿菌門(mén)，油相獨(dú)有的4門(mén)是奇果熱菌門(mén)(1.06%)、芽單胞菌門(mén)(0.258%)、螺旋體門(mén)(0.079 2%)和候選醋熱菌門(mén)(0.002 08%)，水相獨(dú)有的9門(mén)是紡錘菌門(mén)(0.290%)、衣原體門(mén)(0.232%)、協(xié)生菌門(mén)(0.102%)、熱袍菌門(mén)(0.079 7%)、候選甘蔗菌門(mén)(0.075 5%)、熱脫硫化小桿菌門(mén)(0.058 1%)、疣微菌門(mén)(0.050 7%)、浮霉菌門(mén)(0.006 33%)和廣古菌門(mén)(0.002 11%)等(圖3)。

注：*細(xì)菌_門(mén)。圖3 Q2YG138140采出液油相和水相門(mén)水平菌群相對(duì)豐度

采出液中油相共檢出78屬，水相共檢出150屬，油相和水相共有的9屬依次是葡萄果菌屬(Staphylococcus)、不運(yùn)桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、棒小桿菌屬(Corynebacterium)、蛭弧菌屬、淖單胞菌屬(Pelomonas)、鏈果菌屬(Streptococcus)、海之桿菌屬(Marinobacter)和甲基小桿菌屬(Methylobacterium)，油相獨(dú)有的是冷桿菌屬(Psychrobacter)(12.9%)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(5.49%)、陌柄菌屬(Atopostipes)(2.39%)、窄營(yíng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)(2.03%)、莫拉姓菌屬(Moraxella)(1.57%)、萊茵海默氏菌屬(Rheinheimera)(1.36%)、芬戈?duì)柕率暇鷮?Finegoldia)(1.31%)、乳竿菌屬(Lactobacillus)(1.14%)、奇果菌屬(Deinococcus)(1.06%)、玫果菌屬(Rhodococcus)(0.862%)、琻姓菌屬(Kingella)(0.819%)、噬甲基菌屬(Methylophaga)(0.812%)、韋榮姓菌屬(Veillonella)(0.712%)和紫小桿菌屬(Janthinobacterium)(0.685%)；水相獨(dú)有的是水小桿菌屬(14.8%)、分枝小桿菌屬(Mycobacterium)(4.23%)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)(2.11%)、芽單胞菌屬(Blastomonas)(1.34%)、涅瓦河菌屬(Nevskia)(1.03%)、慢根瘤菌屬(Bradyrhizobium)(1.02%)、孿果菌屬(Geminicoccus)(0.937%)、嗜血菌屬(Haemophilus)(0.854%)、弓桿菌屬(Arcobacter)(0.755%)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)(0.619%)、卟單胞菌屬(Porphyromonas)(0.475%)、竿菌屬(Bacillus)(0.403%)和小粒小鏈菌屬(Granulicatella)(0.342%)等(圖4)。

注：1—藍(lán)細(xì)菌門(mén)_屬；2—奈瑟氏菌科_屬；3—細(xì)菌_屬；4—黃小桿菌科_屬；5—乳桿菌目_屬；6—蒂西耶姓菌科_屬；7—酸桿菌綱_屬；8—變形菌門(mén)_屬；9—德?tīng)査冃螚U菌綱_屬；10—阿爾法變形桿菌綱_屬；11—間孢囊菌科_屬。圖4 Q2YG138140采出液油相和水相屬水平菌群相對(duì)豐度

2.1.4 采出液分級(jí)膜濾的群落組成

采出液的水相樣本中，共檢出17門(mén)、35綱、64目、105科和150屬。4種濾膜(10.00，1.00，0.22，0.10 μm)檢出的共有菌門(mén)有4門(mén)：變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和桿狀菌門(mén)，其中相對(duì)豐度最高的均為變形菌門(mén)(分別為83.0%，84.7%，72.3%和80.9%)。4種濾膜檢出的共有菌屬有11屬：蛭弧菌屬、不運(yùn)桿菌屬、水小桿菌屬、甲基小桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、葡萄果菌屬、分枝小桿菌屬、芽單胞菌屬、涅瓦河菌屬、淖單胞菌屬和弓桿菌屬，其中相對(duì)豐度最高的分別是蛭弧菌屬(10.00 μm，20.7%)、蛭弧菌屬(1.00 μm，17.9%)、水小桿菌屬(0.22 μm，20.2%)和水小桿菌屬(0.10 μm，16.9%)。

4種濾膜檢出菌門(mén)分別是10門(mén)、8門(mén)、10門(mén)和13門(mén)(圖5)。10.00 μm濾膜上檢出的特有菌門(mén)是協(xié)生菌門(mén)，1.00 μm濾膜上檢出的特有菌門(mén)是疣微菌門(mén)，0.22 μm濾膜上未檢出的特有菌門(mén)，0.10 μm濾膜上檢出的特有菌門(mén)是熱袍菌門(mén)、熱脫硫化小桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)。

注：“其它”是指無(wú)命名地位但已分類(lèi)的菌名的集合；“未分類(lèi)”指未明確分類(lèi)菌門(mén)的集合。圖5 Q2YG138140不同膜濾級(jí)別門(mén)水平菌群相對(duì)豐度

注：分類(lèi)級(jí)別為1—變形菌門(mén)_屬；2—細(xì)菌域_屬；3—阿爾法變形桿菌綱_屬；4—藍(lán)細(xì)菌門(mén)_屬；5—奈瑟氏菌科_屬；6—外磂玫螺體科_屬；7—德?tīng)査冃螚U菌綱_屬；8—間孢囊菌科_屬；9—伽馬變形桿菌綱_屬。圖6 Q2YG138140不同膜濾級(jí)別屬水平群落相對(duì)豐度

4種濾膜菌屬的檢出分別是59屬、65屬、79屬和82屬(圖6)。10.00 μm濾膜上檢出的特有7菌屬是嗜血菌屬、卟單胞菌屬、小粒小鏈菌屬、淡紅微菌屬(Rubellimicrobium)、小孿菌屬(Gemella)、鏈竿菌屬(Streptobacillus)和布魯斯姓菌屬(Brucella)等；1.00 μm濾膜上檢出的特有4菌屬是無(wú)氧竿菌屬(Anoxybacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、副果菌屬(Paracoccus)和縛桿菌屬(Conexibacter)等；0.22 μm濾膜上檢出的特有5菌屬是芽小鏈菌屬(Blastocatella)、夷桿菌屬(Pontibacter)、差果菌屬(Alloiococcus)、噬甲基菌屬和吸吮弧菌屬(Vampirovibrio)等；0.10 μm濾膜上檢出的特有7菌屬是竿菌屬、孿果菌屬、詭小粒菌屬(Dolosigranulum)、鞘氨醇胞菌屬(Sphingosinicella)、邏斯氏菌屬(Rothia)、排污管小桿菌屬(Cloacibacterium)和金小桿菌屬(Chryseobacterium)。

2.2 討 論

采出液油相的DNA濃度為(3.07±0.11) μg/g，與我們之前對(duì)各油田的研究總體一致，相對(duì)誤差要遠(yuǎn)小于先前對(duì)來(lái)自不同油田不同油品性質(zhì)原油的DNA提取效果(普通稠油(3.36±5.31) μg/g、中質(zhì)原油(2.20±0.86) μg/g、特稠油(1.96±2.79) μg/g及超稠油(1.82±2.27) μg/g)[26]，較小的質(zhì)量提取偏差表明原油核酸法相較于先前的方法具有更好的重復(fù)性，對(duì)原油樣本的提取本方法的提取效果更為穩(wěn)定。

采出液的油相樣本中，共檢出11門(mén)、25綱、43目、66科和78屬，而水相樣本中，共檢出17門(mén)、35綱、64目、105科和150屬(圖3和圖4)，采出液水相樣本的微生物多樣性顯著大于油相樣本，但從提取結(jié)果看，油相的DNA濃度高于水相，可見(jiàn)油相中存在非常明顯的優(yōu)勢(shì)菌群。關(guān)于遼河油田采出液的研究中發(fā)現(xiàn)，在稠油油井中同一口井油相中微生物群落多樣性比水相中更豐富[26]，或體現(xiàn)微生物對(duì)不同油性的適應(yīng)性差異。另外，本次提取的長(zhǎng)慶油田白153區(qū)塊Q2YG138140油井采出液樣本基因組總DNA，共檢出21門(mén)和183屬。相比之前關(guān)于稠油的研究，每口稠油油井僅分別平均檢出15門(mén)和180屬。此外，奇果熱菌門(mén)(僅油相檢出)及3個(gè)候選菌門(mén)(候選醋熱菌門(mén)(油相)、候選暗桿菌門(mén)(油相)和候選甘蔗菌門(mén)(水相))相對(duì)于先前的研究[25-26]是首次檢出，這能進(jìn)一步看出原油核酸法對(duì)于油藏采出液菌群總DNA的提取更具普適性，并對(duì)油相樣本尤其是稠油樣本的檢測(cè)具有更好的實(shí)用性。

4種濾膜上檢出的OTU數(shù)量依次為49 554，48 427，45 793和45 658，這與各級(jí)濾膜上提取得到的總DNA濃度大小順序(依次為(9.89±0.76)，(7.51±0.47)，(4.36±0.29)，(2.45±0.30) ng/mL)一致(表1)，可見(jiàn)此提取方法在一定程度上符合一般規(guī)律，對(duì)于油藏采出液樣本具較好的有適用性。門(mén)分類(lèi)單元下，相對(duì)豐度大于1%的菌門(mén)(由多到少)依次為：變形菌門(mén)(75%)、厚壁菌門(mén)(11%)、放線菌門(mén)(9%)、桿狀菌門(mén)(2%)、其它(1%)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)(1%)等(圖2)，其中變形菌門(mén)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；在屬分類(lèi)單元下，相對(duì)豐度大于1%的16屬中其它占比最大(28%)(圖2)，進(jìn)一步表明原油核酸法對(duì)油藏常見(jiàn)多種菌門(mén)及菌屬基因組DNA的提取均具較好的適用性。

不論油相和水相均存在“其它”和“未分類(lèi)”的菌屬。油相中“未分類(lèi)菌屬”的相對(duì)豐度小于0.01%，水相中“未分類(lèi)菌屬”的相對(duì)豐度0.40%(表2)說(shuō)明原油核酸法確能檢出油藏采出液里存在的未知菌，對(duì)于環(huán)境樣本里的未知微生物基因組總DNA具有一定的提取效果；提取得到的油相及水相的“其它”相對(duì)豐度分別達(dá)到10.02%和17.34%，高于文獻(xiàn)報(bào)道[18，24]，可見(jiàn)本方法針對(duì)生物量相對(duì)較低的極端環(huán)境微生物仍具有較好的檢出能力，也進(jìn)一步說(shuō)明原油核酸法作為一種研究油藏微生物多樣性的免培養(yǎng)的手段具有一定可行性。從菌門(mén)及菌屬的檢出情況(圖5和圖6)看，0.10 μm濾膜上檢出的(0.10～1.00 μm尺寸范圍)菌群多樣性均大于其它3種濾膜的檢出，這與先前的報(bào)道一致[28]，說(shuō)明自主DNA提取技術(shù)對(duì)于小尺寸油藏微生物的專(zhuān)有響應(yīng)性能。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)自主研發(fā)的原油微生物總DNA提取方法(原油核酸法)檢測(cè)到長(zhǎng)慶油田白153區(qū)塊Q2YG138140油井采出液微生物菌群。首先，較小的質(zhì)量提取偏差表明本方法具有更好的重復(fù)性，對(duì)原油樣本的提取效果更為穩(wěn)定；其次，采出液檢出菌群油相少于地層水相，符合文獻(xiàn)報(bào)道的一般規(guī)律，表明原油核酸法對(duì)油藏常見(jiàn)多種菌門(mén)及菌屬基因組DNA的提取均具較好的適用性和穩(wěn)定性；第三，相對(duì)于先前的研究[18，25-26]，該方法首次檢出奇果熱菌門(mén)(油相)及3個(gè)候選菌門(mén)(候選醋熱菌門(mén)(油相)、候選暗桿菌門(mén)(油相)和候選甘蔗菌門(mén)(水相))，說(shuō)明本方法對(duì)油藏采出液樣本總DNA的提取仍具有較大的應(yīng)用潛力；最后，4種濾膜共有5門(mén)和13屬，0.10μm濾膜檢出的菌群多樣性明顯多，或反映了油藏地層對(duì)微生物的脅迫。