基于恒溫?zé)o蛋白酶核酸擴(kuò)增反應(yīng)的生物傳感器研究進(jìn)展

王思媛 楊慧然 翁本銳 冉家兵 王慧敏 楊昌英 鄧張雙

(1.三峽大學(xué) 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室,湖北 宜昌 443002;2.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

核酸是由核苷酸組成的生物大分子,廣泛存在于動植物細(xì)胞和微生物體內(nèi),是生命最基本的物質(zhì)之一.核酸大分子分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),是生物的基本遺傳物質(zhì),核酸也可以用作生物研究和醫(yī)學(xué)診斷的重要標(biāo)志物.其獨特的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)使核酸在生物分析、核酸納米技術(shù)和納米醫(yī)學(xué)方面有著巨大的應(yīng)用前景.在檢測方面,通過對特定靶標(biāo)進(jìn)行信號擴(kuò)增,實現(xiàn)對金屬離子、小分子和蛋白質(zhì)等分析物的高靈敏度和高特異性的檢測.

在核酸檢測方面,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[1]是最常用的擴(kuò)增技術(shù).然而,復(fù)雜的溫度循環(huán)和操作過程極大地限制了PCR 在細(xì)胞、生物體內(nèi)的實時分析應(yīng)用.恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)具有在常溫下快速、高效的擴(kuò)增能力,已經(jīng)成為一種有前景的擴(kuò)增方法.然而,大多數(shù)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)都需要蛋白酶的參與.但是蛋白酶易降解,需要嚴(yán)格的儲存條件,對擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響.所以迫切需要開發(fā)基于恒溫?zé)o蛋白酶的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的生物傳感器.目前這類生物傳感器主要有以下幾種:基于熵驅(qū)動反應(yīng)(entropy-driven reaction,EDC)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hybridization chain reaction,HCR)、催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)(catalyzed hairpin assembly,CHA)以及具有剪切活性或類辣根過氧化物酶催化活性的核酸酶(DNAzyme)的生物傳感器.這些生物傳感器被廣泛應(yīng)用于熒光、比色以及電化學(xué)檢測,而且可以實現(xiàn)核酸、蛋白質(zhì)、小分子和細(xì)胞等分析物的檢測,同時也廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞成像、活體成像等方面.本文對這幾種方法分別進(jìn)行了詳細(xì)的介紹.

1 基于熵驅(qū)動反應(yīng)(EDC)的生物傳感器

在核酸信號的擴(kuò)增策略中,熵驅(qū)動反應(yīng)(EDC)被認(rèn)為是DNA 反應(yīng)領(lǐng)域的一個里程碑[2].EDC 于2007年由Zhang等[3]首次提出.這種催化反應(yīng)由多條線性單鏈DNA 組成,通過目標(biāo)物引發(fā)由熵驅(qū)動的立足點介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TMSDR),釋放出多個寡核苷酸.EDC由額外釋放的分子的熵增加驅(qū)動,與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)和催化發(fā)卡自組裝(CHA)等這些基于發(fā)卡的反應(yīng)相比,EDC 反應(yīng)不涉及亞穩(wěn)態(tài)DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu),序列限制更少,而且由于EDC不需要復(fù)雜的發(fā)卡莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的DNA 反應(yīng)物,大大降低了隨機(jī)碰撞和亞穩(wěn)態(tài)發(fā)卡結(jié)構(gòu)相互作用的機(jī)會,從而減少了背景信號.因此,EDC 具有快速、簡單、穩(wěn)定和易于模塊化的優(yōu)點.EDC在開發(fā)分子納米機(jī)器、邏輯反應(yīng)和計算等多種動態(tài)分子器件方面顯示出獨特的優(yōu)勢.

EDC的設(shè)計原理如圖1所示[4],EDC 由5個功能單鏈DNA 組成.底物復(fù)合物(底物,S)首先由3條核酸鏈雜交形成,即連接鏈(LB)、輸出鏈(OB)和信號鏈(SB).催化劑C 首先通過立足點結(jié)構(gòu)域5與底物復(fù)合物S結(jié)合,并通過TMSDR 取代SB,使中間體I3的立足點結(jié)構(gòu)域3暴露.隨后,燃料鏈(F)與中間體I3雜交,并從LB中置換出OB,進(jìn)而置換出C,形成不會參與后續(xù)反應(yīng)的雙鏈(W).此時,游離的催化劑C 可以引發(fā)新的催化組裝循環(huán),產(chǎn)生大量特定的寡核苷酸和雙鏈DNA.與生物有機(jī)體中催化的傳統(tǒng)觀點不同,該反應(yīng)由額外釋放的分子的熵驅(qū)動,不需要蛋白酶,也不會改變共價鍵.

圖1 EDC原理圖[4]

以納米粒子為載體,可以進(jìn)一步增大體系的穩(wěn)定性和反應(yīng)物的利用率.比如Liang等開發(fā)了一種基于金納米粒子(Au NPs)的EDC 驅(qū)動的3D DNA 行走機(jī)器人,用于細(xì)胞內(nèi)miRNA 成像[5],如圖2所示.目標(biāo)miRNA 誘導(dǎo)行走臂與固定有高密度DNA 底物的Au NPs相連,從而觸發(fā)EDC 并驅(qū)動行走臂在DNA軌道上逐步行走,最終將大量信號鏈釋放,產(chǎn)生擴(kuò)增的熒光信號.這種納米機(jī)器的檢測限達(dá)到8 pM,在活細(xì)胞中同樣表現(xiàn)出良好的靈敏度.

除了用納米粒子作為載體之外,還可以將四面體作為EDC反應(yīng)的載體,例如He等提出了一種miRNA 觸發(fā)熵驅(qū)動的活細(xì)胞三維DNA 擴(kuò)增(EDTD)策略[6].如圖3所示,通過目標(biāo)miRNA 與EDTD 的相互作用,借助熵驅(qū)動方式特異性地啟動一個自發(fā)的DNA 反應(yīng),并通過獨特的DNA 四面體框架結(jié)構(gòu),顯著地提高生物穩(wěn)定性和內(nèi)吞效率.該EDTD 的檢測限為3.3 pM,比傳統(tǒng)分子信標(biāo)和線性雜交探針低約3個數(shù)量級.因此,這種可編程的DNA 機(jī)器實現(xiàn)了顯著的熒光信號放大和對miRNA 的超靈敏檢測.還為檢測活細(xì)胞內(nèi)的其他生物標(biāo)志物提供了一種簡便和通用的擴(kuò)增策略.

圖3 基于EDC的DNA 四面體框架擴(kuò)增策略[6]

EDC反應(yīng)還可以應(yīng)用于電化學(xué)檢測[7],如圖4所示.首先通過Au-S鍵在金電極表面自組裝形成三鏈DNA 復(fù)合物以制備DNA 燃料分子機(jī)器.miRNA-21作為催化劑啟動EDC反應(yīng),通過第一個TMSDR,使miRNA-21取代AP 鏈,然后通過第二個TMSDR,使亞甲基藍(lán)(MB)標(biāo)記的DNA 燃料鏈取代目標(biāo)miRNA-21和PP鏈.隨后,釋放的目標(biāo)物miRNA-21可以參與下一次EDC進(jìn)行循環(huán)重復(fù)反應(yīng).最后,大量的MB修飾的DNA 鏈被金電極捕獲,產(chǎn)生顯著放大的電流信號.這種生物傳感器對miRNA-21 的檢測限低至1.4 f M,并顯示出良好的選擇性.該方法還可以用于檢測癌細(xì)胞中miRNA-21 的表達(dá)水平,在生物標(biāo)志物miRNA 的靈敏檢測以及癌癥早期診斷方面具有巨大潛力.

圖4 基于EDC的miRNA 電化學(xué)檢測方法[7]

2 基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)的生物傳感器

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)是一種自組裝信號放大技術(shù),在常溫下即可發(fā)生反應(yīng),操作簡單,實驗成本低.HCR 打破了以往核酸擴(kuò)增方法的固有印象,摒棄了復(fù)雜的熱循環(huán)步驟,實現(xiàn)了類似PCR 的超高檢測靈敏度,且無需酶的參與,大大簡化了檢測方法[8].HCR最早是于2004年由Pierce和Dirks提出的[9].如圖5所示,HCR 是由兩個發(fā)卡DNA(H1和H2)組成,在目標(biāo)物I的存在下,通過TMSDR 依次打開兩個發(fā)卡DNA 形成長的雙鏈DNA 納米線.H1的莖端含有與目標(biāo)DNA I的區(qū)域b*互補(bǔ)的區(qū)域b,連接在序列b的單鏈區(qū)域a與目標(biāo)DNA 的區(qū)域a*互補(bǔ),發(fā)卡H1的環(huán)端由序列c組成.另一個發(fā)卡H2由莖端雙鏈b/b*、相應(yīng)的環(huán)部區(qū)域a*和與H1的環(huán)端區(qū)域c互補(bǔ)的單鏈區(qū)域c*組成.存在分析物I時,區(qū)域a和b通過TMSDR 打開了發(fā)卡H1并產(chǎn)生了一個穩(wěn)定性增強(qiáng)的DNA 雙鏈I-H1.在I-H1結(jié)構(gòu)中,單鏈區(qū)域c-b*打開發(fā)卡H2,同時產(chǎn)生結(jié)構(gòu)I-H1·H2,露出的單鏈區(qū)域a*-b*與目標(biāo)物序列相同,可繼續(xù)打開發(fā)卡H1,進(jìn)行循環(huán)雜交反應(yīng).目標(biāo)物DNA 引發(fā)了一個恒溫自發(fā)的聚合過程,即交叉打開發(fā)卡H1和H2,最終形成一個由I-(H1·H2)n組成的長聚合的納米線.

圖5 HCR 原理圖[9]

Wu等開發(fā)了一種基于HCR 的超靈敏信號放大策略,并探究了其在活細(xì)胞中m RNA 成像方面的潛力[10].如圖6所示,設(shè)計了兩個發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA 探針H1和H2,H1上標(biāo)記了熒光供體羧基熒光素(FAM),H2上標(biāo)記了熒光受體四甲基羅丹明(TMR).通過靜電作用使H1和H2探針穩(wěn)定地組裝在肽包被的金納米粒子上.由于核心的金納米粒子能夠有效淬滅FAM 和TMR 熒光,使H1和H2上的熒光信號非常微弱.細(xì)胞內(nèi)的m RNA 靶標(biāo)與H1雜交,并在H1中產(chǎn)生單鏈,這可能會使H1在粒子上解離或增加遷移率,促進(jìn)其與H2雜交,并釋放與目標(biāo)序列相同的單鏈.通過H1和H2之間的交替雜交反應(yīng),產(chǎn)生由多個H1和H2組成的長的雙鏈DNA 納米線.HCR 產(chǎn)物具有剛性雙鏈構(gòu)象,降低了對納米組裝體的親和力,使其從金納米粒子的表面解離下來,熒光供體和受體的距離拉近,以激活指示目標(biāo)m RNA表達(dá)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號.該納米傳感器的檢測限為0.5 pM,具有高靈敏分析的潛力.這種DNA 納米組裝體具有獨特的陽離子夾層和金核的結(jié)構(gòu),有利于核酸探針對細(xì)胞的高效遞送和熒光猝滅,從而實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)m RNA 的靈敏成像.

圖6 基于HCR 的金納米粒子用于miRNA 成像原理[10]

為了提高單級HCR 的靈敏度,Wei等構(gòu)建了串聯(lián)HCR 反應(yīng)進(jìn)行信號放大[11].上游HCR-1的擴(kuò)增產(chǎn)物作為下游HCR-2的觸發(fā)器,產(chǎn)生多個分支的雙鏈DNA 共聚納米結(jié)構(gòu).如圖7 所示,引發(fā)鏈觸發(fā)HCR-1中兩個DNA 發(fā)卡的交叉打開,生成HCR-1納米線,該納米線含有下游HCR-2的觸發(fā)鏈(T).T引發(fā)了HCR-2的發(fā)卡反應(yīng)物的多重組裝,產(chǎn)生樹狀分枝的DNA 納米結(jié)構(gòu).并且通過將兩個熒光團(tuán)的距離拉近,將分析物的識別過程轉(zhuǎn)換為放大的FRET信號.通過引入輔助DNA,串聯(lián)HCR 反應(yīng)可以簡便地應(yīng)用于其他分析物的靈敏檢測.這種擴(kuò)增方案可以用于高靈敏度和選擇性檢測緩沖液和人的血清中低至3 pM 的miR-21.串聯(lián)HCR 反應(yīng)進(jìn)一步實現(xiàn)了高效、準(zhǔn)確的細(xì)胞內(nèi)miRNA 成像,并且可以通過miRNA 的含量不同從而區(qū)分不同的腫瘤細(xì)胞,為潛在的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了強(qiáng)大的多功能工具.

圖7 級聯(lián)HCR 反應(yīng)用于miRNA 成像原理[11]

除了發(fā)卡介導(dǎo)的多支狀HCR,Chen等報道了一種無發(fā)卡介導(dǎo)的多支狀HCR,用于miRNA 的電化學(xué)檢測[12].如圖8所示,將Y 形DNA 結(jié)構(gòu)(由3條單鏈DNA Y1、Y2 和Y3 組成)作為探針固定在電極上,miRNA 作為靶標(biāo)競爭探針結(jié)合位點,從Y 形結(jié)構(gòu)中釋放出Y3,進(jìn)而觸發(fā)電極表面的非線性HCR反應(yīng).這種競爭性結(jié)合方法顯著提高了該生物傳感器的特異性.非線性HCR 進(jìn)一步實現(xiàn)了電化學(xué)信號的擴(kuò)增,在1～10000 f M 的濃度范圍內(nèi)對miRNA-25呈線性響應(yīng),檢測限為0.333 4 f M.該生物傳感器能夠有效區(qū)分單堿基突變和其他miRNAs,在miRNA 檢測方面具有較高的特異性.

圖8 HCR用于基于多支狀HCR的miRNA的電化學(xué)檢測原理[12]

3 基于催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)(CHA)的生物傳感器

催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)(CHA)最早是于2008 年由Pierce等[13]提出的.如圖9所示[14],目標(biāo)物C1作為立足點打開H1并形成C1-H1中間體,同時釋放出H1上的結(jié)構(gòu)域3*,3*可以與H2的結(jié)構(gòu)域3結(jié)合,再次啟動鏈置換反應(yīng)以形成H1-H2-C1復(fù)合物,這種不穩(wěn)定的復(fù)合物進(jìn)一步解離為C1和H1-H2,解離下來的C1可以引發(fā)新一輪CHA 反應(yīng),生成大量的雙鏈DNA 產(chǎn)物H1-H2.

圖9 CHA 原理圖[14]

由于CHA 反應(yīng)具有快速且高效的擴(kuò)增性能,因此該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和小分子檢測以及活細(xì)胞成像等.例如,Wu等設(shè)計了一種基于CHA 的m RNA 成像方法[15],如圖10 所示.細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)m RNA 打開發(fā)卡H1,產(chǎn)生H1-m RNA 中間體.H1-mRNA 中間體釋放的結(jié)構(gòu)域3*進(jìn)一步打開H2,隨后打開的H2將目標(biāo)m RNA 取代下來,使目標(biāo)m RNA 繼續(xù)催化下一輪雜交反應(yīng),生成雙鏈DNA 產(chǎn)物,產(chǎn)物將標(biāo)記了猝滅基團(tuán)的序列從雙鏈上取代下來,使熒光基團(tuán)的熒光恢復(fù),在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了擴(kuò)增的熒光信號,從而實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)m RNA 的成像.

圖10 基于CHA 的細(xì)胞內(nèi)m RNA 成像原理[15]

為了提高CHA 的靈敏度,近年來研究者們將CHA 和其他的擴(kuò)增策略相結(jié)合以提高檢測方法的信號擴(kuò)增能力.Wang等設(shè)計了一種級聯(lián)CHA-HCR 反應(yīng),用于信號擴(kuò)增及細(xì)胞內(nèi)的miRNA 成像[16].如圖11所示,該CHA-HCR 反應(yīng)包含兩種信號擴(kuò)增方法:上游CHA 和下游HCR.目標(biāo)物I引發(fā)上游CHA 反應(yīng),通過鏈置換反應(yīng)打開H1以生成I-H1,I-H1釋放的單鏈序列打開發(fā)卡H2,進(jìn)而置換出目標(biāo)物進(jìn)行下一輪催化雜交反應(yīng),并產(chǎn)生大量的雙鏈DNA 產(chǎn)物,產(chǎn)物暴露出的T 作為下游HCR 的引發(fā)鏈,引發(fā)下游發(fā)卡H3、H4、H5和H6的HCR 自組裝,最終生成大量的雙鏈DNA 納米線,同時拉進(jìn)FAM 與TAMRA的距離從而產(chǎn)生顯著的FRET 信號.該反應(yīng)的檢測限為2 pM,級聯(lián)的CHA-HCR 反應(yīng)被進(jìn)一步應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)miRNA-21的精確成像,通過檢測miRNA的含量可以區(qū)分不同腫瘤細(xì)胞.

圖11 級聯(lián)CHA-HCR 反應(yīng)用于miRNA 檢測原理[16]

為了進(jìn)一步提高CHA 的靈敏度,還可以構(gòu)建具有更高擴(kuò)增能力的自催化反應(yīng).自催化是指將整體化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物用作其至少一個子系統(tǒng)或整個系統(tǒng)本身的催化劑的現(xiàn)象.例如Dai等設(shè)計了一種自催化的CHA 反應(yīng)用于DNA 和ATP 的比色檢測[17].如圖12所示,這個自催化發(fā)卡組裝(SRCHA)反應(yīng)由發(fā)卡H1和H2組成,分別含有部分引發(fā)鏈序列和G-四鏈體序列.

圖12 自催化的CHA反應(yīng)用于DNA和ATP 的比色檢測原理[17]

在ATP或者引發(fā)鏈的存在下,H1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開(Step 1),H1新暴露的粘性末端與H2的粘性末端雜交形成中間引發(fā)鏈-H1-H2(Step 2);然后,引發(fā)鏈被釋放(Step 3),它可以作為新的催化劑來繼續(xù)引發(fā)CHA 反應(yīng),同時生成H1-H2復(fù)合物(循環(huán)I),復(fù)合物使兩個引發(fā)鏈片段距離接近,形成完整的引發(fā)鏈復(fù)制品,促使H1-H2繼續(xù)打開H1形成H1-H2-H1復(fù)合物,觸發(fā)第二次循環(huán)(Step 4～6)形成更多的H1-H2復(fù)合物.復(fù)合物使兩個G-四鏈體片段距離接近以形成完整的G-四鏈體結(jié)構(gòu),隨后與氯化血紅素相互作用,形成具有類辣根過氧化物酶(HRP)催化活性的氯化血紅素/G-四鏈體脫氧核糖核酸酶(DNAzyme),并催化H2O2介導(dǎo)的ABTS2-氧化,生成有色的ABTS·-,產(chǎn)生比色信號.在SRCHA 反應(yīng)中循環(huán)使用引發(fā)鏈及其復(fù)制品產(chǎn)生大量復(fù)合物,同時產(chǎn)生了自催化的信號擴(kuò)增.該方法的檢測限約為48 n M,這種基于SRCHA 的ATP 檢測方法與先前報道的ATP檢測方法有相似的靈敏度,但其檢測時間明顯更短.

4 基于核酸酶的生物傳感器

核酸酶是一種具有催化性能的單鏈核酸,通過SELEX 體外篩選得到,已被證明可以催化DNA/RNA 的剪切、連接等反應(yīng)[18],以及催化氧化還原反應(yīng).生物傳感器中最常用的DNAzyme是具有剪切活性或者類辣根過氧化物酶催化活性的DNAzyme,下面分別介紹基于這兩類DNAzyme的生物傳感器.

4.1 具有剪切活性的核酸酶

DNAzyme通常需要輔因子來催化DNA 或RNA的剪切,是一種很有前景的信號放大器.目前已知的輔因子有金屬離子(Pb2+[19]、Mg2+[20]、Zn2+[21]、Cu2+[22]、Ni2+[23]、Hg2+[24])、組氨酸[25]等.最常用的以金屬離子作為輔因子,催化切割RNA 的DNAzyme是8～17 DNAzyme[26]和10～23 DNAzyme[27].如圖13所示,DNAzyme(藍(lán)色鏈)可通過Watson-Crick堿基配對雜交與含有核糖腺嘌呤(r A,黃色)的DNA 底物(紫色鏈)特異性結(jié)合[28].在輔因子的存在下,DNAzyme可折疊成具有催化活性的結(jié)構(gòu),在“r A”位點對底物進(jìn)行切割,從而釋放切割底物的兩個片段.

圖13 DNAzyme剪切原理圖[28]

DNAzyme可以與其他核酸擴(kuò)增反應(yīng)組裝,以產(chǎn)生更高的檢測靈敏度.Wang等設(shè)計了一種恒溫?zé)o蛋白酶的CHA-HCR-DNAzyme級聯(lián)反應(yīng),用于miRNA 的檢測以及細(xì)胞內(nèi)成像[29].如圖14所示,目標(biāo)物I引發(fā)H1和H2的CHA 反應(yīng),形成中間產(chǎn)物H1-H2,中間產(chǎn)物暴露出HCR 的引發(fā)鏈T,進(jìn)一步引發(fā)下游發(fā)夾H3、H4、H5和H6的HCR 反應(yīng),從而得到了含有大量DNAzyme的納米線.然后在Mg2+輔因子的存在下,這些新組裝的DNAzyme被激活以切割特定的含核糖核苷酸的底物,由DNAzyme裂解的底物使標(biāo)記FAM 和猝滅劑的序列斷開,產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的熒光信號.

圖14 級聯(lián)CHA-HCR-DNAzyme反應(yīng)用于miRNA檢測原理[29]

該CHA-HCR-DNAzyme級聯(lián)反應(yīng)通過順序引發(fā)CHA、HCR 和DNAzyme,巧妙地實現(xiàn)了三重擴(kuò)增效果以檢測目標(biāo)物,成功應(yīng)用于高靈敏度和選擇性的miRNA-21檢測,檢測限為2 pM.而且,該反應(yīng)被進(jìn)一步用于活細(xì)胞中miRNA-21 的精準(zhǔn)成像,并顯示出實時分析低表達(dá)、短鏈RNA 靶標(biāo)的巨大潛力.

此外,DNAzyme可以分別與CHA 或HCR 組成自催化反應(yīng).例如Zou等開發(fā)了一種新的交叉催化的CHA-DNAzyme反應(yīng)[30],如圖15所示,該反應(yīng)由兩個催化反應(yīng)組成:CHA反應(yīng)由H1,帶有熒光團(tuán)供體和受體的H2,DNAzyme底物S-L組成.交叉催化反應(yīng)從引發(fā)鏈T激活CHA 反應(yīng)開始,使攜帶部分DNAzyme的H1和H2連續(xù)雜交,形成完整的DNAzyme結(jié)構(gòu).同時,H2的打開增大了熒光團(tuán)供體和受體的距離,從而恢復(fù)供體的熒光信號.隨后,DNAzyme特異性地切割底物S-L 復(fù)合物,并連續(xù)釋放T 以反向引發(fā)CHA 反應(yīng).因此,DNAzyme將底物轉(zhuǎn)化為CHA 的引發(fā)劑,從而顯著促進(jìn)CHA 的擴(kuò)增,實現(xiàn)交叉催化的CHA-DNAzyme反應(yīng).該生物傳感器的檢測限為15.6 pM,這可以與許多其他無酶傳感方法相媲美.級聯(lián)的交叉催化擴(kuò)增傳感系統(tǒng)可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)miRNA的不同表達(dá)水平,具有較高的檢測靈敏度.

圖15 交叉催化CHA-DNAzyme反應(yīng)原理[30]

為了進(jìn)一步提高檢測的靈敏度,Jie等通過HCR和DNAzyme之間的協(xié)同交叉引發(fā),開發(fā)了一種用于體外和體內(nèi)microRNA 成像的DNA 自催化方法[31].如圖16 所示,DNAzyme的兩部分分別連接在發(fā)卡H1和H3上,阻止活性DNAzyme的形成,而熒光團(tuán)給體和受體分別修飾在發(fā)卡H2和H4上,阻止它們發(fā)生FRET.底物(S)由含有核糖核苷酸(r A)的DNAzyme底物a*-h*和啟動序列(T)組成,與阻斷鏈(L)部分雜交以阻止S上的T 直接引發(fā)HCR.引發(fā)鏈T 觸發(fā)HCR 反應(yīng)物的循環(huán)交叉打開,產(chǎn)生DNAzyme納米線,并使兩個熒光團(tuán)(FAM 和TAMRA)靠近,從而實現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET).隨后,每個DNAzyme在Mg2+的存在下可以催化剪切底物(S/L)以釋放T 觸發(fā)HCR 反應(yīng)發(fā)生.HCR 納米線中的每一個DNAzyme都會產(chǎn)生大量的HCR 觸發(fā)器,以加速整個相互催化反應(yīng)過程.該反應(yīng)表現(xiàn)出HCR 和DNAzyme相互催化的NN 倍的指數(shù)擴(kuò)增效率,產(chǎn)生大量長的串聯(lián)DNAzyme納米線和顯著增強(qiáng)的FRET 信號.對microRNA 的檢測限達(dá)到6.8 pM,這與大多數(shù)其他無蛋白酶的信號擴(kuò)增方法相當(dāng),甚至更低.該生物傳感器實現(xiàn)了細(xì)胞和活體內(nèi)的miRNA檢測,從而為體內(nèi)追蹤少量生物標(biāo)志物提供了一個強(qiáng)大的傳感平臺.

圖16 交叉催化HCR-DNAzyme反應(yīng)原理[31]

4.2 具有類辣根過氧化物酶催化活性的核酸酶

除了具有剪切活性的核酸酶,還具有類辣根過氧化物酶催化活性的DNAzyme,即氯化血紅素/G-四鏈體DNAzyme,其催化活性比單純的氯化血紅素增強(qiáng)上百倍,被廣泛應(yīng)用于比色和化學(xué)發(fā)光檢測.例如,Shimron等通過將氯化血紅素/G-四鏈體DNAzyme與HCR 相結(jié)合,用于檢測目標(biāo)DNA[32].如圖17所示,它由兩個發(fā)卡結(jié)構(gòu)1和2組成.發(fā)卡1的5＇端含有3/4的G-四鏈體序列,發(fā)卡2的3＇端包含1/4的G-四鏈體序列.目標(biāo)物引發(fā)HCR 反應(yīng),生成長的含有多個DNAzyme單元的納米線,在H2O2存在的條件下,氯化血紅素/G-四鏈體納米線催化ABTS2-氧化為ABTS·-(λmax=420 nm),產(chǎn)生比色信號,或者催化氧化魯米諾,產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(λmax=415 nm).該平臺對分析物DNA 的檢測限可以達(dá)到1×10-13M,證明了基于DNAzyme的系統(tǒng)的高選擇性.

圖17 氯化血紅素/G-四鏈體與DNAzyme納米線的無酶自主組裝放大用于檢測級聯(lián)HCR-DNAzyme反應(yīng)原理[32]

魯米諾的發(fā)射波長較短,其穿透能力有限,為了使輸出信號的發(fā)射波長更長,可以通過引入化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)信號轉(zhuǎn)換方式來增強(qiáng)信號.化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移是將化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的供體分子激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體分子的能量轉(zhuǎn)移過程.化學(xué)發(fā)光供體不需要外部激發(fā)光源,沒有自發(fā)熒光和光漂白的干擾,因此在分析檢測等眾多領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的性能.例如,Zhang等將封裝染料的金屬有機(jī)框架納米粒子UiO-66與HCR-DNAzyme結(jié)合,對miRNA 進(jìn)行基于CRET 的放大檢測[33].如圖18所示,將一個反應(yīng)物發(fā)卡修飾到封裝染料的UiO-66 上,目標(biāo)物miRNA 將UiO-66上的發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開,產(chǎn)物繼續(xù)打開溶液中的另一個發(fā)卡,通過發(fā)生HCR,在UiO-66上形成長的含有重復(fù)DNAzyme單元的納米線.在魯米諾和H2O2的存在下,氯化血紅素/G-四鏈體DNAzyme催化魯米諾的氧化反應(yīng),通過化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移將能量轉(zhuǎn)移給UiO-66中負(fù)載的染料,使染料在沒有外部光源激發(fā)的情況下產(chǎn)生發(fā)光信號,實現(xiàn)對miRNA 的靈敏檢測.

圖18 基于HCR-DNAzyme的金屬有機(jī)框架化合物用于CRET 介導(dǎo)的miRNA 檢測原理[33]

該系統(tǒng)對miRNA-21進(jìn)行分析的檢測限為1.67 n M,對miRNA-155的檢測限為0.17 n M.此外,通過改變識別發(fā)卡和封裝不同的染料,該體系還可以用于檢測p53和BRCA1.

5 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了一些基于恒溫?zé)o蛋白酶的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的生物傳感器,見表1.包括基于熵驅(qū)動反應(yīng)(EDC)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)(CHA)以及具有剪切活性或類辣根過氧化物酶催化活性的核酸酶的生物傳感器,同時也總結(jié)了一系列基于級聯(lián)和自催化擴(kuò)增反應(yīng)的生物傳感器,產(chǎn)生更強(qiáng)的信號擴(kuò)增能力.它們在熒光、比色、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光檢測等方面都顯示出了簡便、高效、高靈敏度等特點和優(yōu)勢,被廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、小分子和金屬離子等目標(biāo)物的檢測.盡管恒溫?zé)o蛋白酶的核酸檢測方法已經(jīng)取得了一些進(jìn)展,但這些檢測方法也存在一定的局限性,例如,目前沒有具體的CHA 和HCR 設(shè)計方法,大部分設(shè)計只能參照已有文獻(xiàn)中的發(fā)卡結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整;DNAzyme底物鏈中的r A 在復(fù)雜環(huán)境中有解離的可能性;基于DNAzyme的化學(xué)發(fā)光和CRET 難以高效地將多種反應(yīng)物運輸?shù)郊?xì)胞,同時實現(xiàn)長時間的檢測和成像.更重要的是,如何將所有反應(yīng)物限域到一定的空間或者載體上,實現(xiàn)生命體系中高效的限域擴(kuò)增,以及發(fā)卡反應(yīng)物的穩(wěn)定性和生物安全性問題等仍是目前面臨的巨大挑戰(zhàn),需進(jìn)一步的完善和發(fā)展相關(guān)檢測體系.

表1 常見的恒溫?zé)o蛋白酶的核酸擴(kuò)增反應(yīng)