血漿神經(jīng)酰胺與血管性事件相關(guān)性的meta分析

楊程緣，金奧銘，許杰，孟霞

心、腦血管疾病分別為全球致死病因的第1位和第2位[1]。合并高血壓、脂代謝紊亂、糖尿病、既往心腦血管疾病病史等危險(xiǎn)因素可使血管性事件的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增高[2]。因此，探索針對(duì)性預(yù)測(cè)心、腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的新型生物標(biāo)志物迫在眉睫。

神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）作為鞘脂的中間代謝產(chǎn)物，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]，有基礎(chǔ)研究表明，Cer可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與心、腦血管疾病的病理生理過(guò)程[4]。目前已有臨床研究將以Cer為基礎(chǔ)建立的神經(jīng)酰胺測(cè)試2（ceramide test 2，CERT2）評(píng)分應(yīng)用于心血管性死亡的預(yù)測(cè)[5-6]。最新一項(xiàng)meta分析說(shuō)明CERT2評(píng)分還可用于評(píng)估不良心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。然而，CERT2評(píng)分內(nèi)的特定Cer組分是否與不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，CERT2評(píng)分是否也可有效預(yù)測(cè)單獨(dú)的心、腦血管事件，目前尚無(wú)明確結(jié)論。本研究旨在通過(guò)meta分析評(píng)估CERT2評(píng)分內(nèi)的特定Cer組分與不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，以及CERT2評(píng)分與心肌梗死、卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)性檢索PubMed、Embase、Library、Web of Science、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方和維普數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索時(shí)限從建庫(kù)至2021年10月，收集涉及Cer與不良心血管事件、心肌梗死、卒中相關(guān)性的文獻(xiàn)。中文檢索策略：“神經(jīng)酰胺”和（“心血管事件”或“心肌梗死”或“心梗”或“冠心病”或“腦梗死”或“缺血性腦卒中”或“腦血管閉塞”或“腦血栓”或“腦梗塞”或“缺血性中風(fēng)”或“中風(fēng)”或“缺血性腦血管病”或“腦栓塞”或“缺血性腦病”或“卒中”“缺血性卒中”）。英文檢索策略：（ceramides[Mesh] OR ceramides[allfields]）AND（cardiovascular disease[Mesh]OR cardiovascular disease[all fields]OR myocardial infarction[Mesh] OR myocardial infarction[all fields] OR stroke[Mesh] OR brain infarction[Mesh]OR stroke[all fields] OR cerebrovascular accident[all fields] OR infarct[all fields]OR infarction[all fields] OR brain infarct[all fields] OR brain infarction[all fields]）。根據(jù)系統(tǒng)分析和meta分析優(yōu)先報(bào)告的條目（preferred reporting items for systematic review and meta-analysis，PRISMA）和流行病學(xué)觀察性研究的meta分析（meta-analysis of observational studies in epidemiology，MOOSE）報(bào)告規(guī)范，本研究執(zhí)行meta分析和研究結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究類(lèi)型為觀察性研究；②針對(duì)存在心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因素患者，分析血漿Cer與不良心血管事件或心肌梗死或卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性的研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①摘要、病例報(bào)告、綜述、信件、社論、方案、動(dòng)物或細(xì)胞研究、未發(fā)表的結(jié)果或信息以及隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)；②不能直接或間接提供不同Cer組分，包括Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）或CERT2評(píng)分與不良心血管事件或心肌梗死或卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)RR或HR及其95%CI數(shù)據(jù)的研究；③重復(fù)發(fā)表的研究結(jié)果；④非隨機(jī)干預(yù)研究偏移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具（risk of bias in non-randomised studies of interventions，ROBINS-I）評(píng)估為中等偏倚風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)以上的研究。

1.2 文獻(xiàn)篩選與方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià) 根據(jù)入排標(biāo)準(zhǔn)，兩名研究人員獨(dú)立審查檢索所得的文獻(xiàn)標(biāo)題和摘要，并獲取論文全文，進(jìn)行文獻(xiàn)篩選。如意見(jiàn)不一致，則與第三方會(huì)商確定。對(duì)所有符合標(biāo)準(zhǔn)的研究，提取第一作者、發(fā)表年份、研究時(shí)間、研究類(lèi)型、樣本量、研究人群特征、隨訪(fǎng)時(shí)長(zhǎng)、研究終點(diǎn)和混雜因素等相關(guān)信息。

ROBINS-I是為非隨機(jī)干預(yù)性研究設(shè)計(jì)的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具，本研究利用ROBINS-I進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)[8]。該評(píng)價(jià)工具包括7個(gè)評(píng)價(jià)領(lǐng)域，分為干預(yù)前（混雜偏倚和研究對(duì)象選擇偏倚）、干預(yù)中（干預(yù)分類(lèi)偏倚）和干預(yù)后（偏離既定干預(yù)偏倚、缺失數(shù)據(jù)偏倚、結(jié)局測(cè)量偏倚、結(jié)果選擇性報(bào)告偏倚）3個(gè)部分。評(píng)估者對(duì)相應(yīng)領(lǐng)域的偏倚風(fēng)險(xiǎn)按照事先制定的標(biāo)準(zhǔn)給出“低、中、高、極高或不清楚”的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。最終綜合單個(gè)領(lǐng)域的評(píng)估結(jié)果對(duì)研究的“整體偏倚”風(fēng)險(xiǎn)作出評(píng)價(jià)。

1.3 CERT評(píng)分和神經(jīng)酰胺組分 CERT2評(píng)分由4種組分組成，包括3種不同的Cer組分、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）及其比值：Cer（d18∶1/24：1）/Cer（d18∶1/24∶0）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（16∶0/22∶5）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（14∶0/22∶6）、PC（16∶0/16∶0）?？偡指鶕?jù)上述組分的四分位數(shù)計(jì)算，范圍是0～12分。根據(jù)總分將個(gè)體分為4個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)：0～3分為低風(fēng)險(xiǎn)，4～6分為中風(fēng)險(xiǎn)，7～8分為高風(fēng)險(xiǎn)，9～12分為極高風(fēng)險(xiǎn)。

本研究分別對(duì)CERT2包含的3種特定Cer組分——Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）與不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，以及CERT2評(píng)分與心肌梗死或卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性進(jìn)行meta分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用STATA 15.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3種特定Cer組分和CERT2評(píng)分均為連續(xù)變量，研究報(bào)告其HR及95%CI。用Q檢驗(yàn)和I2進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)并評(píng)估納入研究的異質(zhì)性。當(dāng)P＞0.1，I2＜50%，采用固定效應(yīng)模型計(jì)算合并效應(yīng)HR，反之采用隨機(jī)效應(yīng)模型。meta分析時(shí)進(jìn)行了多因素校正，校正變量包括臨床特征和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果、研究一般特征及質(zhì)量評(píng)價(jià)共檢索到5837篇相關(guān)文獻(xiàn)，剔除重復(fù)文獻(xiàn)2002篇和閱讀標(biāo)題、摘要后發(fā)現(xiàn)的不符合入排標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)3678篇。通過(guò)對(duì)剩余157篇文獻(xiàn)進(jìn)行通讀全文，去除不合格文獻(xiàn)151篇，最終納入6篇文獻(xiàn)（7項(xiàng)研究），共覆蓋30 886例患者。所有納入研究的整體偏倚風(fēng)險(xiǎn)為“中風(fēng)險(xiǎn)”，即納入的觀察研究都被認(rèn)為是非隨機(jī)研究的可靠證據(jù)，但與設(shè)計(jì)良好的隨機(jī)試驗(yàn)不等同。文獻(xiàn)篩選流程和納入的研究基本特征分別見(jiàn)圖1和表1。

表1 納入研究基本特征

圖1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

2.2 神經(jīng)酰胺檢測(cè)方法 Carvalho等[9]的研究利用親水性相互作用LC（HILIC色譜柱）MS/MS定量檢測(cè)患者血漿Cer組分，使用Agilent 1260 LC系統(tǒng)和Agilent 6430三重四極質(zhì)譜儀（Agilent科技公司，加利福尼亞州圣克拉拉）在HILIC色譜柱（馬薩諸塞州沃爾瑟姆賽默飛世爾科技公司）（100×2.1 mm；粒徑2.6 mm）上分離提取的脂質(zhì)。Yin等[10]的研究

采用超高效液相色譜-使用配備ESI探針并與安捷倫1290 infinity LC系統(tǒng)（安捷倫，加利福尼亞州帕洛阿爾托）連接的AB Sciex四極質(zhì)譜儀6500（馬薩諸塞州弗雷明翰市Sciex）對(duì)血漿Cer進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。Mundra等[11]的研究使用同樣的Cer檢測(cè)策略，使用安捷倫1290液相色譜系統(tǒng)和安捷倫6490三重四極質(zhì)譜儀，通過(guò)液相色譜和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行血漿Cer分析。Gence等[12]和Hilvo等[5，13]的研究收集患者血漿樣本后，代謝組學(xué)分析在配備超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）（日本京都島津Nexera-X2）的混合三重四極桿/線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀（QTRAP 5500，AB Sciex，Concord，Canada）上進(jìn)行。PC與Cer來(lái)自相同的紙質(zhì)提取物并進(jìn)行分析。

2.3 特定神經(jīng)酰胺組分與不良心血管事件關(guān)系meta分析結(jié)果 特定Cer組分與不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系：共納入4項(xiàng)研究（3篇文獻(xiàn)）[9-11]，包括11 004例患者，其中發(fā)生不良心血管事件的患者2154例。Mundra等[11]的文獻(xiàn)涉及2項(xiàng)研究。Cer（d18∶1/16∶0）的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示I2=87.0%，P＜0.001，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，結(jié)果顯示Cer（d18∶1/16∶0）為不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR1.13，95%CI1.02～1.24，P=0.013）。Cer（d18∶1/24∶0）的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示I2=67.6%，P=0.026，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，結(jié)果顯示Cer（d18∶1/24∶0）不是不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR0.97，95%CI0.90～1.03，P=0.295）。Cer（d18∶1/24∶1）的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示I2=55.5%，P=0.081，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，結(jié)果顯示Cer（d18∶1/24∶1）不是不良心血管事件的危險(xiǎn)因素（HR1.05，95%CI0.99～1.10，P=0.081）（圖2）。

圖2 特定神經(jīng)酰胺組分與不良心血管事件關(guān)系的meta分析

2.4 CERT2評(píng)分與單獨(dú)卒中或心肌梗死關(guān)系meta分析結(jié)果 CERT2評(píng)分與卒中或心肌梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系分析共納入3項(xiàng)研究（3篇文獻(xiàn)）[5，12-13]，包括19 882例患者。CERT2評(píng)分與卒中關(guān)系研究的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示I2=64.1%，P=0.062，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，結(jié)果顯示CERT2評(píng)分不是卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR1.19，95%CI0.98～1.43，P=0.075）；CERT2評(píng)分與心肌梗死關(guān)系研究的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示I2=85.3%，P=0.001，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，結(jié)果顯示CERT2評(píng)分不是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR1.10，95%CI0.95～1.29，P=0.209）（圖3）。

圖3 CERT2評(píng)分與單獨(dú)卒中或心肌梗死關(guān)系meta分析

3 討論

本研究通過(guò)分析已發(fā)表的血漿Cer與不良心血管事件或心肌梗死或卒中關(guān)系的觀察性研究，對(duì)CERT2評(píng)分內(nèi)的特定Cer組分是否均與不良心血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，CERT2評(píng)分是否能夠針對(duì)性預(yù)測(cè)心、腦血管事件的發(fā)生這兩個(gè)待解決問(wèn)題進(jìn)行了探索。研究結(jié)果提示CERT2評(píng)分內(nèi)的Cer（d18∶1/16∶0）組分是不良心血管事件發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）與不良心血管事件之間無(wú)顯著相關(guān)性，另外，CERT2評(píng)分本身與單獨(dú)卒中或心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)也無(wú)顯著相關(guān)性。

Cer屬于鞘脂代謝中間產(chǎn)物的一種，是構(gòu)成細(xì)胞膜、外泌體等質(zhì)膜的重要成分，并作為第2信使參與炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，Cer可能參與了卒中的病理生理過(guò)程。Nakane等[14]觀察到沙土鼠的海馬在腦缺血再灌注5 min、30 min和24 h時(shí)Cer水平顯著升高，鞘磷脂水平顯著降低。大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）可導(dǎo)致大鼠大腦皮層Cer水平升高[15-16]。在自發(fā)性高血壓大鼠中，MCAO之前進(jìn)行短暫缺血預(yù)處理可顯著降低缺血區(qū)及周?chē)鷧^(qū)域的Cer水平[16]。在缺血性卒中的小鼠模型中，神經(jīng)磷脂酶活性的減弱可顯著減少腦組織損傷[17]。在一項(xiàng)模擬缺血性心臟病的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)RNA轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，使用特定Cer酶阻滯劑和RNA轉(zhuǎn)染調(diào)控缺氧狀態(tài)下小鼠心肌細(xì)胞Cer酶表達(dá)水平，進(jìn)而控制Cer水平。實(shí)驗(yàn)綜合分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)、Cer酶和Cer水平，得出上調(diào)Cer酶表達(dá)水平可通過(guò)水解抵消缺血性損傷后Cer異常增高帶來(lái)的負(fù)面影響，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，從而起到心肌保護(hù)作用的結(jié)論[18]。除此之外，使用能夠降低Cer水平的藥物可以防止載脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成[18]。

血漿Cer作為心、腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分層的生物標(biāo)志物的潛力已經(jīng)得到了越來(lái)越多的關(guān)注。既往研究關(guān)于含有C16∶0、C24∶0、C24∶1?；溨坏腃er組分和不良心、腦血管事件的相關(guān)性結(jié)果并不一致。一方面，綜合其他涉及Cer與不良心血管事件相關(guān)性但未納入本次分析的研究來(lái)看[19-21]，含有C16∶0或C24∶1?；湹腃er組分更傾向于是不良心血管事件的危險(xiǎn)因素，而C24∶0與不良心血管事件發(fā)生無(wú)關(guān)或只有較弱相關(guān)性，這與我們的meta分析結(jié)果部分一致。另一方面，綜合腦血管病領(lǐng)域內(nèi)有限的研究報(bào)道，C16∶0、C24∶0傾向于是卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素[20-22]。部分研究提示C24∶1與卒中發(fā)生正相關(guān)。但最近發(fā)表的一項(xiàng)對(duì)比急性缺血性卒中和無(wú)腦血管病對(duì)照組的研究中，C24∶1是唯一在缺血性卒中急性期水平降低的Cer組分，并且隨著距離發(fā)病時(shí)間的增加其水平進(jìn)一步降低，這與其他研究結(jié)果相反[23]。由此可見(jiàn)，C24∶0、C24∶1?；溑c心血管疾病的關(guān)系可能不同于其與腦血管疾病的關(guān)系。CERT2評(píng)分包含C16∶0、C24∶0、C24∶1?；湹奶囟–er組分，既往有研究顯示每標(biāo)準(zhǔn)差增量的CERT2評(píng)分對(duì)應(yīng)患者發(fā)生不良心血管結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)升高20%[7]，而本研究未見(jiàn)CERT2評(píng)分與卒中之間存在顯著相關(guān)性。盡管前期關(guān)于Cer與心、腦血管疾病的相關(guān)性研究數(shù)量有限，部分還受到小樣本量和橫斷面研究設(shè)計(jì)的限制，但C24∶0、C24∶1與心腦血管疾病的不同關(guān)系可能解釋CERT2可以作為預(yù)測(cè)心血管事件的指標(biāo)，但不能有效預(yù)測(cè)卒中結(jié)局，也進(jìn)一步說(shuō)明Cer在心血管領(lǐng)域內(nèi)的研究結(jié)果并不能完全外推至腦血管病領(lǐng)域。本研究結(jié)果還顯示CERT2與單獨(dú)心肌梗死事件并無(wú)顯著相關(guān)性，提示CERT2并不能特異性預(yù)測(cè)心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)需要高質(zhì)量的臨床研究進(jìn)一步探索卒中、心肌梗死特異性Cer的預(yù)測(cè)模型。

目前將血漿Cer應(yīng)用于卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的臨床數(shù)據(jù)十分有限，并且很多受樣本量小和橫斷面研究設(shè)計(jì)的限制，本研究的優(yōu)勢(shì)是采用ROBINS-I工具對(duì)非隨機(jī)干預(yù)性研究進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，在保證納入研究質(zhì)量的前提下，綜合而成樣本量大、隨訪(fǎng)時(shí)間長(zhǎng)、有足夠的統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)來(lái)定量分析特定血漿Cer組分水平、Cer評(píng)分與血管性事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間相關(guān)性的數(shù)據(jù)。未來(lái)需要補(bǔ)充Cer針對(duì)性應(yīng)用于卒中和缺血性心臟病的相關(guān)數(shù)據(jù)，可探索Cer與不同血管性疾病亞型之間的關(guān)系，并進(jìn)一步明確在疾病發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用的特定Cer組分種類(lèi)及其內(nèi)在的作用通路。

【點(diǎn)睛】本研究是首篇針對(duì)CERT2評(píng)分的Cer組分及評(píng)分本身與不良心腦血管事件相關(guān)性進(jìn)行的meta分析，結(jié)果顯示，CERT2評(píng)分本身不能反映卒中或心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)，但部分Cer組分與不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。