DLX3和Syncytin-1 mRNA在妊娠期糖尿病患者胎盤鈣化組織中的表達(dá)及意義

鄔 華，方 香，李 靜，藍(lán) 嬌，吳昊旻，梁旭霞

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是一種代謝性疾病，為妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常，其發(fā)病原因復(fù)雜[1-2]。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人們生活水平及生活方式的改變，妊娠婦女中肥胖或超重婦女占比不斷上升，GDM的發(fā)病率也隨之增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)GDM發(fā)病率為17.5%[3]。GDM患者產(chǎn)后患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加，GDM患者在產(chǎn)后9個(gè)月、15個(gè)月和5.2年的2型糖尿病的罹患率分別為3.7%、4.9%、13.15%[4]。妊娠合并糖尿病對(duì)母胎均有較多危害，需引起重視[5]。妊娠合并糖尿病中超過(guò)90%為GDM，其與不良妊娠結(jié)局有著密切關(guān)系。有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)將GDM納入“大產(chǎn)科綜合征”中，與早產(chǎn)、胎膜早破、巨大兒、子癇前期、自然流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育異常、死胎、新生兒低血糖、新生兒呼吸窘迫綜合征等密切相關(guān)，強(qiáng)調(diào)了胎盤在母胎間的相互作用[6-7]。同源盒轉(zhuǎn)錄因子3(distal-less homeobox 3,DLX3)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡[8]。Syncytin-1是人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄缺陷病毒(human endogenous retroviruses,HERVs)成員中HERV-W編碼的糖包膜蛋白。有研究顯示，Syncytin-1具有介導(dǎo)識(shí)別、與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的功能，在維持正常胎盤發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)為介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化融合并維持正常的細(xì)胞凋亡[9]。Choi等[10-11]發(fā)現(xiàn)DLX3對(duì)骨骼、牙齒的發(fā)育有重要影響。張薇等[12]指出DLX家族基因參與調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)生，是骨骼發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究旨在比較GDM患者與正常妊娠婦女胎盤鈣化組織DLX3和Syncytin-1的表達(dá)水平，探討其在GDM發(fā)病機(jī)制中的作用及其與胎盤鈣化的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2015年9月至2018年9月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科產(chǎn)檢并住院的GDM患者30例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合GDM的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5，13]；(2)單胎足月孕婦；(3)自然受孕；(4)因單純產(chǎn)科因素?fù)衿谄蕦m產(chǎn)終止妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他妊娠合并癥；(2)合并感染；(3)胎兒發(fā)育異常。另選擇同期健康孕產(chǎn)婦30名作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)GDM及其他妊娠合并癥；(2)無(wú)妊娠并發(fā)癥；(3)因單純產(chǎn)科因素?fù)衿谄蕦m產(chǎn)終止妊娠分娩的單胎、自然受孕、足月孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并感染；(2)胎兒發(fā)育異常。觀察組年齡大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組在孕前體重、民族、孕次等其他基線資料方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：KY-KJT-2015-1號(hào))，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

表1 兩組基線資料比較

1.2GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)GDM為妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)：孕產(chǎn)婦孕期規(guī)范產(chǎn)檢時(shí)在孕24～28周行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)，即試驗(yàn)前連續(xù)3 d正常飲食(每日進(jìn)食碳水化合物不少于150 g)，檢查期間靜坐、禁煙。OGTT前禁食至少8 h，5 min內(nèi)口服含75 g葡萄糖的液體300 ml，分別抽取孕婦服糖前及服糖后1 h、2 h的靜脈血，測(cè)定血糖水平。空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)<5.1 mmol/L、1 h血糖<10.0 mmol/L、2 h血糖<8.5 mmol/L，任何一項(xiàng)異常(≥正常值)即診斷為GDM[5]。(2)若首次OGTT結(jié)果正常，孕婦具有GDM高危因素。①孕婦因素：年齡≥35歲、妊娠前超重或肥胖、糖耐量異常史、多囊卵巢綜合征。②糖尿病家族史。③妊娠分娩史：不明原因的死胎、死產(chǎn)、流產(chǎn)史、巨大胎兒分娩史、胎兒畸形和羊水過(guò)多史、GDM史。④本次妊娠因素：妊娠期發(fā)現(xiàn)胎兒大于孕周、羊水過(guò)多；反復(fù)外陰陰道假絲酵母菌病者。妊娠30～32周重復(fù)OGTT，如有任何一項(xiàng)異常(≥正常值)即診斷為GDM[13]。

1.3標(biāo)本的收集 于研究對(duì)象剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后15 min內(nèi)取標(biāo)本，于近臍帶根部胎盤母體面肉眼可見鈣化區(qū)取約1 cm3組織1塊，以生理鹽水沖洗干凈，即刻分裝于經(jīng)焦炭酸二乙酯(diethylpyro-carbonate，DEPC)水處理過(guò)的2 ml凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)方法 采用TRIzol法提取胎盤組織標(biāo)本總RNA,應(yīng)用DNase I(Cat:M0303S,NEB)去除DNA后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat:K1622,Thermo)將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。應(yīng)用QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒(Cat：208054，QIAGEN)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，所用儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為20 μl，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行配制操作。RT-qPCR擴(kuò)增參數(shù)：(1)95 ℃預(yù)變性2 min;(2)95 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。引物序列見表2,由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于Ct值≥30的樣本結(jié)果，以Ct值=30進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。

表2 引物序列

1.5臨床觀察指標(biāo) (1)孕期體重增加量：孕期檢查發(fā)現(xiàn)GDM后常規(guī)加強(qiáng)孕期體重管理，以分娩前孕婦體重減去孕前體重所得值為孕期體重增加量。(2)巨大胎兒[5]：測(cè)量新生兒出生時(shí)體重，體重>4 000 g者為巨大胎兒。

2 結(jié)果

2.1兩組孕期體重增加量及巨大兒發(fā)生率比較 觀察組孕期體重增加量為(11.15±4.03)kg，對(duì)照組為(13.23±2.98)kg，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.069,P=0.044)。觀察組出現(xiàn)巨大兒3例(10.00%)，對(duì)照組1例(3.33%)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.268，P=0.605)。

2.2兩組DLX3和Syncytin-1 mRNA表達(dá)水平比較 觀察組DLX3 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。兩組Syncytin-1 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組DLX3和Syncytin-1 mRNA表達(dá)水平比較[M(P25,P75),2-△△Ct]

2.3影響GDM發(fā)生的多因素logistic回歸分析結(jié)果 以年齡、孕期體重增加量和DLX3 mRNA作為自變量，以GDM的發(fā)生情況為因變量(是=1，否=0)進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，較高的DLX3 mRNA表達(dá)水平是促進(jìn)GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響GDM發(fā)生的多因素logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

3.1目前，GDM的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，有研究認(rèn)為其發(fā)生與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[14]。GDM可能導(dǎo)致或加劇胎盤功能異常，通過(guò)改變胎盤結(jié)構(gòu)或功能，從而增加圍產(chǎn)兒不良結(jié)局的發(fā)生。DLX3是同源異型盒DLX基因家族中的一員，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有一定作用，可調(diào)控胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡[8]。另外，有研究表明，DLX3過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)胎盤生長(zhǎng)因子(placenta growth factor，PGF)的表達(dá)，DLX3與膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子1(glial cell missing 1，GCM-1)可協(xié)同調(diào)控人滋養(yǎng)細(xì)胞衍生細(xì)胞中PGF的表達(dá)，二者的協(xié)調(diào)作用可導(dǎo)致PGF拮抗[15-16]。李艾珍[17]的研究顯示，孕中期腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和8-異前列腺素F2a(8-isoprostaglandins F2a，8-iso-PG F2a)與GDM的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性，認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎癥因子可能引起GDM患者胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致功能障礙。GDM是妊娠常見合并癥,此類孕婦孕早期可能存在糖耐量受損，加之妊娠激素影響使機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性進(jìn)一步降低，以致不能維持正常血糖水平。本研究結(jié)果顯示，與正常妊娠者相比，GDM患者的DLX3 mRNA表達(dá)水平顯著增高，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示其為GDM發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示DLX3與GDM的發(fā)病機(jī)制具有關(guān)聯(lián)，具有應(yīng)用于預(yù)測(cè)GDM發(fā)生的潛在臨床價(jià)值。另外，DLX3參與調(diào)控胚胎形態(tài)，是骨骼發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究取材樣本為胎盤鈣化部位，不排除DLX3對(duì)于GDM胎盤鈣化的發(fā)病有一定的影響，但DLX3是否通過(guò)影響GDM的發(fā)生、發(fā)展而促進(jìn)胎盤鈣化發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

3.2HERVs大約占人類基因組的8%。有18個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜基因中均包含一個(gè)開放閱讀框，其中6個(gè)表達(dá)于胎盤組織，分別為HERV-K、HERV-R(b)、HERV-T、ERV3(HERV-R)、HERV-W和HERV-FRD，前3個(gè)在胎盤組織呈低表達(dá)，后3個(gè)在胎盤組織中呈高表達(dá)[18]。Syncytin-1是由HERVs成員中HERV-W編碼而形成的糖包膜蛋白，位于染色體7q21，由表面亞單位(surface subunits，SU)和跨膜亞單位(transmembran subunits，TM)組成，前者具有介導(dǎo)識(shí)別、與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的功能，后者具有促進(jìn)細(xì)胞膜融合功能，主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞，在維持正常胎盤發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用，主要為介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化融合并維持正常的細(xì)胞凋亡[9]。大多數(shù)GDM患者的胎盤具有典型的組織學(xué)表現(xiàn)，如絨毛不成熟、絨毛纖維蛋白樣壞死、毛細(xì)血管和血管增殖等[7]。Soygur等[19]通過(guò)研究GDM胎盤標(biāo)本中Syncytin-1、Syncytin-2及其受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在GDM胎盤病理中Syncytin-2及其受體促進(jìn)調(diào)節(jié)蛋白超家族2(major facilitator superfamily domaining 2，MFSD2)的表達(dá)發(fā)生了改變，與正常胎盤相比較，Syncytin-2及其受體MFSD2蛋白表達(dá)下降，提示Syncytin-2可能參與GDM的發(fā)病機(jī)制。Murphy等[20]研究顯示，Syncytin-1的過(guò)表達(dá)上調(diào)了促炎因子的表達(dá)，如白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)等。有研究認(rèn)為，胎盤產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)及抗氧化防御功能的失衡可能導(dǎo)致GDM相關(guān)的氧化應(yīng)激[21]。Yu等[22]指出Syncytin是膠質(zhì)細(xì)胞缺失因子a(glial cell missing a,GCMa)的靶因子，GCMa可正調(diào)控Syncytin。趙先蘭等[23]研究認(rèn)為DLX3可能是Syncytin的上游調(diào)控因子。推測(cè)Syncytin-1可能通過(guò)促炎反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激參與GDM的發(fā)生和發(fā)展，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。但本研究結(jié)果顯示，GDM患者與非GDM患者的胎盤組織中Syncytin-1表達(dá)水平無(wú)顯著差異，這不排除由于樣本量較小的影響因素，結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3GDM會(huì)增加巨大胎兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，考慮原因?yàn)樘洪L(zhǎng)期處于母體高血糖所致的高胰島素血癥環(huán)境，蛋白、脂肪合成增加而脂解作用被抑制，導(dǎo)致軀體過(guò)度發(fā)育[5]。史亞波等[24]研究認(rèn)為GDM誘導(dǎo)的高糖環(huán)境可上調(diào)胎盤組織中PGF的表達(dá)水平，減少胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，使胎盤過(guò)度發(fā)育，進(jìn)而增加巨大胎兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究中觀察組出現(xiàn)巨大兒3例(10.00%)，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.605)，這也可能與本研究例數(shù)較少有關(guān)，但也不排除本研究對(duì)象均為規(guī)范產(chǎn)檢者，觀察組在確診GDM后均予以飲食、運(yùn)動(dòng)指導(dǎo)等干預(yù)。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示孕期體重增加量與GDM發(fā)生無(wú)顯著關(guān)聯(lián)，這可能得益于孕期相關(guān)體重控制等干預(yù)措施的開展。

綜上所述，DLX3可能參與了GDM的發(fā)病機(jī)制，也不排除DLX3促進(jìn)了GDM胎盤鈣化的發(fā)生，其具體的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Syncytin-1在GDM患者胎盤鈣化組織中的表達(dá)水平與正常妊娠者差異不顯著，這不排除是由于樣本量較小造成的結(jié)果偏倚，有待后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以驗(yàn)證。