犬下頜牽張成骨不同時期六種染色方法的應(yīng)用效果比較

趙真辰，蔣偉東，石恒蕾，黃旋平，周 諾

牽張成骨是一種截骨后通過機械應(yīng)力緩慢牽開斷端，從而在截斷處兩側(cè)形成新骨的過程[1]。牽張成骨在顱頜面畸形整復(fù)和骨缺損治療等方面的作用非傳統(tǒng)手術(shù)方法所能比擬。與自體骨移植、異體骨移植以及同種異體骨移植相比，牽張成骨無需植骨，神經(jīng)血管并發(fā)癥少，骨質(zhì)增長較大,患者可以較早負重[2-3]。然而，牽張成骨的作用機制尚未清楚。在該領(lǐng)域的研究中，研究人員試圖通過不同的染色方法來闡明下頜牽張成骨的發(fā)育和再生生物學(xué)機制[4-5]。牽張成骨是一個動態(tài)變化的過程，但在許多研究中，學(xué)者多只使用常規(guī)的HE染色和免疫組化染色方法來觀察組織學(xué)變化，而并未對牽張成骨不同時期的組織變化特點進行觀察。鑒此，本研究通過構(gòu)建不同時期的牽張成骨動物模型，對骨組織染色中常使用的6種染色方法進行比較，旨在探討不同牽張成骨時期中最適宜使用的染色方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用1歲雄性比格犬6只，購買并飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動物保護與使用委員會批準(編號：202111004)。

1.2實驗試劑與儀器 HE染色試劑盒(G1120，索萊寶)，Masson三色染色液(G1340，索萊寶)，亞甲基藍-酸性品紅(DB0088，雷根生物)，鈣鹽染色試劑盒(Von Kossa法，G3282，索萊寶)，鈣鹽染色液(改良茜素紅S法，G3280，索萊寶)，改良番紅O-固綠軟骨染色液(G1371，索萊寶)，旋轉(zhuǎn)切片機(RM2255，德國徠卡)，牙科高速渦輪機(日本NSK公司)，中性樹脂(G8590,索萊寶)，倒置顯微鏡(Nikon,日本)。

1.3下頜骨牽張成骨模型構(gòu)建[6]通過肌肉注射鹽酸賽拉嗪和腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉實驗犬，然后在右側(cè)下頜做切口，剝離皮下和肌肉層以及骨膜以暴露下頜骨體的側(cè)面。在下頜第一、第二磨牙之間垂直于牙槽骨截骨,使用牽張器固定遠端和近端。最后縫合下頜骨皮膚。于術(shù)后7 d開始，以1 mm/d的速度牽張，持續(xù)7 d。在術(shù)后14 d(牽張成骨早期)、28 d(牽張成骨中期)和42 d(牽張成骨后期)[7]，分別對6只實驗犬施行安樂死(靜脈注射過量的戊巴比妥鈉)，每期處死2只。應(yīng)用牙科高速渦輪機對牽張成骨區(qū)組織進行切割取材，用10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)脫鈣4～8周，石蠟包埋，用旋轉(zhuǎn)切片機切成4 μm切片。

1.4染色方法

1.4.1 常規(guī)HE染色 石蠟切片經(jīng)3次二甲苯脫蠟10 min，梯度乙醇溶液脫水，蘇木素染色4 min，分化液分化2 s，伊紅染色2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹脂封片。

1.4.2 Masson染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加入配制好的Weigert鐵蘇木素染色液染色10 min，酸性乙醇分化液分化5 s。切片用Masson藍化液返藍5 min，水洗后用麗春紅品紅染色液染色5 min。使用按試劑盒說明書配制的弱酸工作液洗1 min后以磷鉬酸洗1 min，再用弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺藍染色液染色2 min，封片。

1.4.3 亞甲基藍-酸性品紅染色 切片脫蠟至水后，用65 ℃亞甲基藍染色60 min，水洗后酸性品紅染色液染色20 min，封片。

1.4.4 Von Kossa染色 切片脫蠟脫水，滴加Von Kossa硝酸銀溶液，在紫外燈下照射10 min后在海波溶液中浸泡2 min，再用蘇木素復(fù)染4 min，封片。

1.4.5 改良茜素紅S染色 切片脫蠟脫水，茜素紅S染色液滴染5 min，McGee-Russell分化液分化1 s，Mayer蘇木素復(fù)染2 min，流水沖洗10 min，封片。

1.4.6 改良番紅O-固綠染色 切片脫蠟至水后，用新鮮配制的Weigert鐵蘇木素染色液浸泡5 min，水洗，用酸性分化液分化15 s，蒸餾水洗10 min后用固綠染色液浸染5 min，快速用弱酸溶液洗滌10 s,用番紅染色液浸染5 min，封片。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果 在牽張成骨早期，可見紅色的細胞分泌的細胞外基質(zhì)及結(jié)締組織，藍紫色的細胞核，未見明顯骨小梁結(jié)構(gòu)。在牽張成骨中期，可見幼質(zhì)骨小梁結(jié)構(gòu)，周圍有一圈成骨細胞包繞。在牽張成骨后期，可見更加成熟粗壯的骨小梁以及周圍排列成行的成骨細胞。見圖1。

A、B、C為40倍鏡觀察所見；A′、B′、C′為100倍鏡觀察所見?！鵀槌晒羌毎?，＊為骨小梁。圖2～6說明均與圖1同。

2.2Masson染色結(jié)果 顏色對比鮮明，可見明顯的膠原纖維網(wǎng)，能較好地反映纖維組織的形態(tài)。在牽張成骨早期，可觀察到牽張中心呈較紅的顏色，兩側(cè)顏色偏紫。隨著牽張間隙的增大，初始礦化前緣鄰近兩側(cè)纖維間帶，纖維間帶內(nèi)有高密度的增殖成骨細胞。這些成骨細胞在新形成的毛細血管和血管竇區(qū)域進行初級礦化。藍色膠原纖維沿牽張方向排列，紅色炎癥細胞、單核細胞等彌散其中。在牽張成骨中期，新生組織包含豐富的排列整齊的膠原，基質(zhì)已經(jīng)開始礦化，可觀察到在幼稚骨小梁附近有大量血管，紅細胞豐富。在牽張成骨后期，可見較成熟的骨小梁結(jié)構(gòu)，基質(zhì)中可見膠原纖維網(wǎng)及豐富的血管，管腔內(nèi)有大量紅細胞。部分骨小梁為紅色或深紫色，提示此處為成熟骨質(zhì)。見圖2。

圖2 Masson染色所見

2.3亞甲基藍-酸性品紅染色結(jié)果 在牽張成骨早期，可見淺紫色的細胞分泌的細胞外基質(zhì)，深紫色的細胞核，未見明顯骨小梁結(jié)構(gòu)。在牽張成骨中期，可見骨小梁較細小，骨小梁區(qū)比結(jié)締組織區(qū)顏色更紫。在牽張成骨后期，見骨小梁較粗壯，周圍一圈可見深藍色成骨細胞，骨小梁邊緣處為紫灰色新生骨組織，中心為深紫色的較成熟骨組織。見圖3。

2.4Von Kossa染色結(jié)果 在牽張成骨早期，可見淺紫灰色結(jié)締組織與深紫色的細胞核，未見明顯骨小梁結(jié)構(gòu)。在牽張成骨中期，可見紫色幼稚骨小梁被深紫色成骨細胞包繞，骨小梁結(jié)構(gòu)之間可見淺紫色結(jié)締組織。在牽張成骨后期，可見更粗壯骨小梁，周圍緊密排列深紫色成骨細胞。見圖4。

圖3 亞甲基藍-酸性品紅染色所見

圖4 Von Kossa染色所見

2.5改良茜素紅S染色結(jié)果 在牽張成骨早期，可見未脫鈣完全部分鈣鹽沉積呈紅色。在牽張成骨中期，可見細小骨小梁結(jié)構(gòu)，未見紅色鈣鹽沉積部分。在牽張成骨后期，可見更粗壯骨小梁，周圍緊密排列深紫色成骨細胞，未見紅色鈣鹽沉積部分。見圖5。

圖5 改良茜素紅S染色所見

2.6改良番紅O-固綠染色結(jié)果 在牽張成骨早期，僅可見深淺不一的紅染結(jié)締組織及藍紫色細胞核，牽張中心細胞數(shù)較近骨段較少。在牽張成骨中期，可見紅色幼稚骨小梁，骨小梁之間可見豐富的深紅色血管截面。在牽張成骨后期可見骨小梁邊緣呈藍色，中心呈紅色，對比明顯，分界線大致清晰，能較好地呈現(xiàn)骨小梁的正常形態(tài)。見圖6。

圖6 改良番紅O-固綠染色所見

3 討論

3.1在牽張成骨的過程中，牽張成骨區(qū)域組織中骨、血管、纖維以及成熟和不成熟膠原等成分，會使分析染色結(jié)果復(fù)雜化[8]。隨著現(xiàn)代病理技術(shù)的發(fā)展，免疫組化和原位雜交技術(shù)雖得到廣泛應(yīng)用，但其他特殊的染色方法仍是實驗研究中不可缺少的方法[9]。

3.2HE染色是最常用的染色方法[10]。其以蘇木素作為堿性染料，主要使嗜堿性細胞和細胞核呈紫藍色。而伊紅是一種酸性染料，主要使嗜酸性細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)成分呈紅色。HE染色能揭示牽張成骨過程中骨的基本結(jié)構(gòu)，如骨小梁、成骨細胞等，還可觀察牽張成骨過程中，牽張成骨區(qū)由無明顯骨小梁結(jié)構(gòu)到幼稚骨小梁，再到更成熟骨小梁的動態(tài)變化。此技術(shù)發(fā)展成熟，操作簡單，成本低廉，但對于膠原纖維和肌纖維區(qū)的區(qū)分度較差。

3.3Masson染色是結(jié)締組織染色的最經(jīng)典方法，可以選擇性地顯示膠原纖維和肌纖維[11]。其染色原理與負離子染料分子的大小及對組織的滲透性有關(guān)，分子的大小反映分子量，分子量小則容易穿透組織致密結(jié)構(gòu)，而分子量大則只能進入松散性組織結(jié)構(gòu)[12]。因此，Masson染色后，細胞質(zhì)、肌纖維和紅細胞為紅色，細胞核、膠原纖維和蛋白質(zhì)為藍色[13]。在其他染色中，肌纖維和膠原纖維均為同一顏色，難以區(qū)分，但在Masson染色中可以清晰分辨。在牽張成骨的動態(tài)過程中，成熟骨質(zhì)呈現(xiàn)紅色，新生骨質(zhì)呈現(xiàn)藍色[14]，區(qū)分成熟骨質(zhì)與新生骨質(zhì)可以更加明確骨質(zhì)礦化中心，這使得Masson染色在評估牽張成骨的成骨效率時具有一定的優(yōu)勢。

3.4改良番紅O-固綠染色常用于區(qū)分軟骨組織和骨組織區(qū)。番紅O是一種結(jié)合陰離子的陽離子染料，與多糖中陰離子集團結(jié)合，嗜堿性的軟骨與堿性染料番紅O結(jié)合而呈紫紅色。改良番紅O-固綠染色在牽張成骨早中期區(qū)分度較差。在牽張成骨后期可見骨小梁邊緣藍色類骨質(zhì)與中心較成熟骨質(zhì)，對比明顯，分界線大致清晰，能較好地呈現(xiàn)骨小梁的正常形態(tài)。但因牽張成骨主要成骨方式是膜內(nèi)成骨[15]，而骨折愈合的主要成骨方式為軟骨成骨[16]，故改良番紅O-固綠染色在研究牽張成骨時未見明顯優(yōu)勢。若要研究牽張成骨與骨折或骨缺損的成骨方式，則可以考慮選擇改良番紅O-固綠染色法。

3.5Von Kossa染色法中銀溶液作用于含有不溶性鈣鹽的切片時，鈣被銀所置換，銀鹽在光的作用下被還原為黑色金屬銀，適用于大量樣本的鈣鹽組織染色。改良茜素紅S染色使用的是茜素紅S和Mayer蘇木素，鈣鹽結(jié)合形成藍紫色沉淀，適用于少量鈣鹽組織的染色[17]。Von Kossa染色法和改良茜素紅S染色法與其他染色相比未見明顯區(qū)別，可能因為組織在脫鈣后才進行脫水包埋切片，鈣鹽流失，鈣鹽染色在此次實驗中效果較差，這兩種染色方法可能更適用于硬組織切片染色。

3.6亞甲基藍-酸性品紅染色主要用于區(qū)分原礦化骨、類骨質(zhì)、新生骨質(zhì)，多用于評估種植體骨界面成骨效果以及血管化程度[18-19]。在牽張成骨組織染色可區(qū)分新生骨質(zhì)與較成熟骨組織，有助于了解牽張成骨過程中骨組織的發(fā)育過程。

3.7許多研究者在選擇染色方法上耗費了大量的時間與精力[20-21]。本研究通過對牽張成骨早期、中期、后期的牽張區(qū)域行6種染色，結(jié)果顯示在牽張成骨的整個過程中，Masson染色對比最鮮明，雖然操作相對繁瑣費時，但能夠根據(jù)組織的疏密程度不同將新生骨質(zhì)、成熟骨質(zhì)、膠原纖維、肌纖維等組織的形態(tài)進行鮮明的對比，各部分結(jié)構(gòu)更為清晰，且藍色膠原纖維、紅色結(jié)締組織以及藍褐色細胞核等可使圖片更加鮮艷美觀。改良番紅O-固綠和亞甲基藍-酸性品紅染色不太適宜用于牽張成骨早中期的染色。若要對比處理因素對于牽張成骨后期成骨的影響，可以根據(jù)處理因素作用的不同，選擇Masson染色、改良番紅O-固綠和亞甲基藍-酸性品紅染色。鈣鹽染色在此次實驗中效果較差，若需評估牽張成骨區(qū)組織的礦化程度，建議選擇硬組織切片法切片。

本研究比較了6種染色方法在牽張成骨早期、中期、后期的應(yīng)用效果，為牽張成骨領(lǐng)域以及成骨相關(guān)領(lǐng)域研究者選擇合適的染色方法提供了理論依據(jù)及實驗經(jīng)驗。