溫陽解毒化瘀方對慢加急性肝衰竭大鼠肝組織M1/M2型巨噬細(xì)胞免疫失衡的調(diào)控研究

郝若冰　譚年花　劉子情　陳斌

【摘要】 目的：研究溫陽解毒化瘀方對慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）大鼠肝組織M1/M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響，探討其對ACLF炎癥反應(yīng)可能的調(diào)控機制。方法：將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后，隨機選取6只為空白組，余54只建立ACLF大鼠模型，共成模36只，隨機將其分為模型組（蒸餾水）、中藥組（溫陽解毒化瘀方），各18只。采用牛血清白蛋白致敏法建立免疫性肝纖維化大鼠模型，然后通過D-半乳糖（D-Gal）聯(lián)合脂多糖（LPS）腹腔注射急性攻擊建立ACLF大鼠模型，并分別予以相應(yīng)干預(yù)。觀察各組大鼠急性攻擊后1、12、24 h肝組織病理學(xué)形態(tài)改變及M1/M2型巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)。結(jié)果：與空白組比較，模型組肝組織病理評分在攻擊后1、12、24 h均升高（P<0.05），并且隨著時間的進(jìn)展，肝組織病理學(xué)評分逐漸升高。與模型組比較，中藥組在攻擊后1、12、24 h病理評分均降低（P<0.05）。與空白組比較，模型組CD68、iNOS、Arg-1及CD206在攻擊后1、12、24 h均明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，中藥組在攻擊后各時間點CD68和iNOS均減少，而Arg-1和CD206均增加（P<0.05）。與空白組比較，模型組CD68、iNOS、Arg-1和CD206 mRNA在攻擊后1、12、24 h均顯著上調(diào)（P<0.01）。與模型組比較，中藥組iNOS、CD68 mRNA在攻擊后1、12、24 h均下調(diào)，而Arg-1、CD206 mRNA均上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：ACLF大鼠存在M1/M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)失衡，其失衡程度與肝損傷嚴(yán)重程度相關(guān)。溫陽解毒化瘀方能夠改善ACLF大鼠肝組織損傷，其機制可能與上調(diào)CD206、Arg-1，抑制CD68、iNOS的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化，減輕ACLF炎癥反應(yīng)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 溫陽解毒化瘀方 慢加急性肝衰竭 M1型巨噬細(xì)胞 M2型巨噬細(xì)胞

Regulation of Wenyang Jiedu Huayu Prescription on Immune Imbalance of M1/M2 Macrophages in Liver Tissue of Chronic Acute Liver Failure Rats/HAO Ruobing， TAN Nianhua， LIU Ziqing， CHEN Bin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（11）： 0-028

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Wenyang Jiedu Huayu Prescription on the expression of M1/M2 macrophages in liver tissue of acute on-chronic liver failure （ACLF） rats， and to explore its possible regulatory mechanism on the inflammatory response of ACLF. Method： A total of 60 SD rats were fed adaptively for 6 d， 6 rats were randomly selected as blank group， and the remaining 54 rats were randomly divided into model group （distilled water） and traditional Chinese medicine group （Wenyang Jiudu Huayu Prescription）， 18 rats in each group. The rat model of immune liver fibrosis was established by bovine serum albumin sensitization method， and then ACLF rat model was established by acute attack by D-galactose （D-Gal） combined with lipopolysaccharide （LPS） injection， and corresponding intervention was given respectively. The histopathological morphological changes and polarization status of M1/M2 macrophages were observed at 1， 12 and 24 h after acute attack. Result： Compared with the blank group， the liver histopathological scores of the model group increased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.05）， and the liver histopathological score increased gradually with time. Compared with model group， the liver histopathological scores of traditional Chinese medicine group were decreased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.05）. Compared with blank group， CD68， iNOS， Arg-1 and CD206 in model group were significantly increased at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.01）. Compared with model group， CD68 and iNOS were decreased at each time point after attack， while Arg-1 and CD206 were increased in traditional Chinese medicine group （P<0.05）. Compared with blank group， CD68， iNOS， Arg-1 and CD206 mRNA in model group were significantly up-regulated at 1， 12 and 24 h after attack （P<0.01）. Compared with model group， mRNA of iNOS and CD68 were down-regulated at 1， 12 and 24 h after attack， while mRNA of ARG-1 and CD206 were up-regulated in traditional Chinese medicine group （P<0.05）. Conclusion： The expression imbalance of M1/M2 macrophages is found in ACLF rats， and the degree of imbalance is related to the severity of liver injury. Wenyang Jiedu Huayu Prescription can improve the liver tissue injury of ACLF rats， and the mechanism may be related to the up-regulation of CD206 and ARG-1， the inhibition of CD68 and iNOS expression， the induction of macrophage polarization from M1 to M2， and the alleviation of ACLF inflammation.

[Key words] Wenyang Jiedu Huayu Prescription Acute-on-chronic liver failure M1 macrophages M2 macrophage

First-author’s address： Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.11.006

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure， ACLF）是在慢性肝病的基礎(chǔ)上產(chǎn)生嚴(yán)重肝功能失代償?shù)囊环N臨床綜合征，在其發(fā)展過程中，機體的免疫系統(tǒng)被激活，免疫微環(huán)境紊亂，大量肝細(xì)胞變性、壞死，肝功能失常[1]。課題組前期經(jīng)大量臨床實踐及研究證實溫陽解毒化瘀方能顯著改善肝衰竭腸源性內(nèi)毒素血癥和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，具有較好的臨床應(yīng)用前景[2-3]。而肝臟巨噬細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞）作為肝臟局部免疫的重要組成部分，參與著肝臟免疫內(nèi)環(huán)境的變化過程，依肝臟微環(huán)境的改變，表現(xiàn)出促炎M1型和抗炎M2型不同的極化狀態(tài)，二者平衡調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)，其平衡傾向決定了炎癥是持續(xù)進(jìn)展還是可逆恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)對減輕肝衰竭炎癥反應(yīng)、控制病情進(jìn)展發(fā)揮著重要作用，但其作用機制有待深入研究。本研究基于M1/M2型巨噬細(xì)胞極化的理論角度，通過構(gòu)建ACLF大鼠模型，探討溫陽解毒化瘀方治療肝衰竭炎癥反應(yīng)的免疫學(xué)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 60只健康SD雄性大鼠，體重130～150 g，采購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠集中喂養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度19～23 ℃（最大日溫差距<4 ℃），相對濕度55%～70%，進(jìn)食普通飼料，飲用蒸餾水。

1.2 藥物與試劑 中藥溫陽解毒化瘀方，所有中藥材均購來自華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，方中茵陳30 g（批號：2006006C），丹參30 g（批號：2005005S），赤芍60 g（批號：2012003C），白術(shù)30 g（批號：2008003C），薏苡仁30 g（批號：2009002S），附片10 g（批號：1911003C）。D-半乳糖（D-Gal）、脂多糖（LPS）、弗氏不完全佐劑（Sigma公司，批號：420K0521、111C033、1002453350），無水乙醇、二甲苯、正丁醇、中性樹膠、三氯甲烷、異丙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：100092683、10023418、100052190、10004160、10006818、80109218），檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液、牛血清白蛋白、正常兔血清、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、組化試劑盒DAB顯色劑、Servicebio RT First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green qPCR Master Mix（none ROX）（Servicebio公司，批號：G1202、G5001、G1209、G1004、G1309、G1340、G1211、G3330、G3320），RNA提取液（ambion公司，批號：15596-026），HyPureTMMolecular Biology Grade Water（HyClone公司，批號：SH30538.02）。

1.3 儀器 電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀（Roche Diagnostics Gmbh， cobas 8000型）;脫水機（DIAPATH，型號：Donatello）;包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB-P5型）;病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016型）;凍臺（武漢俊杰電子有限公司，JB-L5型）;組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，KD-P型）;烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司，DHG-9140A型）;蓋玻片（江蘇世泰實驗儀器有限公司，10212432C型）;脫色搖床（Servicebio，TSY-B型）;渦旋混合器（Servicebio，MX-F型）;組化筆（Servicebio，D1008E型）;顯微鏡（Nikon，E100型）;成像系統(tǒng)（日本尼康，Nikon DS-U3）;熒光定量PCR儀（Bio-rad，CFX型）;超微量分光光度計（Thermo，NanoDrop2000型）;標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司，F(xiàn)BZ2001-up-p型）。

1.4 分組、造模與干預(yù) 將60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后，隨機選取其中6只為空白組，余54只建立ACLF大鼠模型。（1）建立免疫性肝纖維化大鼠模型：參考文獻(xiàn)[4]通過牛血清白蛋白致敏法建立免疫性肝纖維化大鼠模型，分4次使用0.5 mL牛血清白蛋白乳化液（牛血清白蛋白含量4 mg）分別于第1、15、25、35天皮下多點注射致敏，繼而使用尾靜脈注射，每周2次，共12次，牛血清白蛋白劑量從2 mg/次開始逐漸遞增，每次遞增

0.5 mg/次，至4 mg/次后保持，持續(xù)6周。在牛血清白蛋白致敏階段死亡18只，共成模36只，隨機將其分為模型組（蒸餾水）、中藥組（溫陽解毒化瘀方），各18只。（2）灌胃干預(yù)：根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，大鼠與人的給藥劑量系數(shù)為6.17，計算得到中藥組生藥用量為19.538 g/kg，換算成大鼠每日顆粒劑量為3.57 g/kg，將中藥顆粒配置為0.338 g/mL的溶液，按照1.056 mL/100 g進(jìn)行中藥灌胃干預(yù)，1次/d，共持續(xù)1周至急性攻擊前。其余兩組使用等劑量蒸餾水灌胃。（3）急性攻擊建立ACLF大鼠模型：取

D-Gal+LPS液（含D-Gal 400 mg/kg，LPS 100 μg/kg）

對模型組和中藥組進(jìn)行腹腔注射急性攻擊建立ACLF大鼠模型，并對空白組注射等量0.9%NaCl溶液，1 h處死空白組并采集肝組織標(biāo)本，其余兩組分別于腹腔攻擊后1、12、24 h處死并采集肝組織標(biāo)本，共成功采集空白組標(biāo)本6只，模型組、中藥組1、12、24 h標(biāo)本各6只。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 肝組織HE染色 依次將大鼠肝組織切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ內(nèi)分別浸泡20 min，后放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ內(nèi)分別浸泡5 min，75%酒精內(nèi)浸泡5 min，用水沖洗后置于蘇木素染液染5 min，水洗后使用分化液分化，再次水洗，使用返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗后依次放入85%、95%酒精脫水5 min，伊紅染色液中染色5 min后脫水封片。參考文獻(xiàn)[6-8]評分，按肝組織損傷程度及范圍的不同，肝組織結(jié)構(gòu)正常計0分;肝細(xì)胞點狀壞死計1分;肝細(xì)胞呈灶狀或片狀壞死，占小葉1/3以內(nèi)計2分;肝細(xì)胞呈廣泛壞死伴出血，占小葉1/3～2/3計3分;肝細(xì)胞壞死占小葉2/3以上計4分。

1.5.2 免疫組化法檢測肝組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（iNOS、CD68）和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（Arg-1、D206）的表達(dá) 將大鼠肝組織標(biāo)本置入二甲苯浸泡15 min，三次后依次在100%、85%和75%乙醇浸泡5 min，隨后蒸餾水清洗。完成脫蠟后將組織切片置于裝有檸檬酸抗原修復(fù)液（pH 6.0）的修復(fù)盒中熱抗原修復(fù)，自然冷卻后使用PBS液（pH 7.4）洗滌3次。隨后將切片置于3%雙氧水溶液中，室溫下避光孵育25 min后置玻片于PBS液（pH 7.4），使用脫色搖床晃蕩清洗3次，各5 min。使用山羊非免疫血清封閉30 min后甩去封閉液，在切片上滴加50 μL一抗稀釋液，4 ℃過夜孵育，室溫復(fù)溫40 min，PBS洗滌3次，每張切片滴加50 μL與一抗相應(yīng)種屬的二抗稀釋液，避光狀態(tài)下室溫孵育50 min，PBS洗滌3次。隨后滴加DAB顯色液50 μL顯色，后使用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水、封片后使用顯微鏡鏡檢，使用NIS-Elements AR Analysis 4.50.00 軟件采集免疫熒光標(biāo)本圖像并計數(shù)。

1.5.3 RT-qPCR法測定肝組織M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（iNOS、CD68）和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（Arg-1、D206）的基因表達(dá) 取大鼠肝組織約100 mg，加入1 mL的RNA提取液并置入勻漿管中，使用勻漿儀充分研磨充分后離心取上清;加入250 μL三氯甲烷，充分混勻后靜置3 min，低溫離心10 min;后將400 μL上清加入0.8倍體積的異丙醇混勻，與-20 ℃下靜置15 min，低溫離心10 min后棄上清;1.5 mL 75%乙醇清洗沉淀，離心5 min，棄上清;將沉淀置于室溫干燥5～10 min;使用15 μL無RNA酶的水將沉淀溶解，多功能酶標(biāo)儀測定濃度及純度，并按照合適比例稀釋濃度過高的RNA，使得其最終濃度為100～500 ng/μL。然后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在Bio-rad公司CFX熒光定量PCR儀上進(jìn)行實時熒光定量PCR，引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，計量資料用（x±s）表示，釆用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，使用LSD-t檢驗法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 D-Gal+LPS液急性攻擊后，模型大鼠出現(xiàn)精神不振，行動遲緩，部分大鼠食量、活動量減少，對刺激的反應(yīng)減弱。模型組與中藥組均于攻擊后24 h各死亡1只（發(fā)現(xiàn)死亡時立即取材，標(biāo)本采集順利），死亡率均為5.6%（1/18）?？瞻捉M無死亡，毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)良好。

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)比較 空白組可見大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列有序，界限較清，形態(tài)正常;中央靜脈清晰可見，肝血竇正常;未見肝細(xì)胞壞死及炎性浸潤等。模型組可見大鼠肝組織結(jié)構(gòu)遭到廣泛破壞，小葉結(jié)構(gòu)不明顯，部分肝細(xì)胞已消失，胞質(zhì)嗜酸性減少，并被大量增生的纖維組織及炎性細(xì)胞代替。假小葉形成，出現(xiàn)大量變性、壞死的肝細(xì)胞。門管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤，伴部分小膽管及纖維組織增生，隨著時間進(jìn)展，肝組織壞死及炎性浸潤逐漸加重;其變化符合ACLF病理診斷[9]。中藥組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)破壞程度較ACLF大鼠有所減輕，肝組織內(nèi)少量纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞變性，壞死，壞死區(qū)域較少，以點狀壞死為主，肝小葉結(jié)構(gòu)保留，隨著時間進(jìn)展，肝組織壞死及炎性浸潤有所減輕。見圖1。

2.3 各組肝組織病理學(xué)評分變化 與空白組比較，模型組肝組織病理評分在攻擊后1、12、24 h均升高（P<0.05），并且隨著時間的進(jìn)展，肝組織病理學(xué)評分逐漸升高。與模型組比較，中藥組在攻擊后1、12、24 h病理評分均降低（P<0.05）。見表2。

2.4 各組iNOS、CD68和Arg-1、CD206表達(dá)情

況 與空白組比較，模型組CD68、iNOS、Arg-1及CD206在攻擊后1、12、24 h均明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，中藥組在攻擊后各時間點CD68和iNOS均減少，而Arg-1和CD206均增加（P<0.05）。見表3、4。

2.5 各組iNOS、CD68和Arg-1、CD206基因表達(dá)情況 與空白組比較，模型組CD68、iNOS、Arg-1和CD206 mRNA在攻擊后1、12、24 h均顯著上調(diào)（P<0.01）。與模型組比較，中藥組iNOS、CD68 mRNA在攻擊后1、12、24 h均下調(diào)，而Arg-1、CD206 mRNA均上調(diào)（P<0.05）。見表5、6。

3 討論

肝衰竭屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名詞，其發(fā)病機制復(fù)雜，且病情危重，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)依據(jù)其黃疸表現(xiàn)大多從陰陽辨證，將其歸于“瘟黃”“黃疸”“急黃”等概念[10]。但在肝衰竭疾病進(jìn)展過程中，尤其是病程進(jìn)展至后期，臨床表現(xiàn)逐漸由“濕熱瘀毒”等單純的標(biāo)實表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為濕、熱、瘀、毒與陽虛、氣虛并存，脾虛、陽虛的表現(xiàn)逐漸顯現(xiàn)，呈現(xiàn)出“陰陽黃”的狀態(tài)[11-12]。課題組在長期臨床實踐中基于“陽黃-陰陽黃-陰黃”的理論體系，在清熱解毒，涼血利濕的診療思路上，辨證地加用溫陽健脾、益氣和胃之法早期干預(yù)，將肝衰竭的中醫(yī)治法逐漸優(yōu)化為“清溫并用法”，并創(chuàng)溫陽解毒化瘀方。前期已有許多相關(guān)研究證實其能夠有效降低肝衰竭的病死率，效果優(yōu)于單純的清熱化濕法[13-14]。并發(fā)現(xiàn)溫陽解毒化瘀方治療肝衰竭的作用機制可能與調(diào)節(jié)ACLF發(fā)病過程中抑炎與促炎作用失衡有關(guān)。參與炎癥反應(yīng)的巨噬細(xì)胞具有較強的可塑性，可被不同炎癥因子誘導(dǎo)分化，在不同微環(huán)境的刺激影響下，極化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞;其中M1型巨噬細(xì)胞具有產(chǎn)生促炎因子、增強機體適應(yīng)性免疫的作用;M2型巨噬細(xì)胞可以大量釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、精氨酸酶-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β和IL-10等細(xì)胞因子，在血管生成、分泌抗炎因子、促進(jìn)組織損傷修復(fù)及重塑方面起著重要作用[15-18]。近年來巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)研究逐步深入，已有研究證實肝臟巨噬細(xì)胞是肝損傷急性發(fā)病機制的核心[19]，巨噬細(xì)胞極化及其細(xì)胞因子的分泌在肝衰竭發(fā)病機制中占據(jù)重要地位，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化則成為肝臟炎性疾病治療的重要機制。

本研究以牛血清白蛋白致敏法聯(lián)合D-半乳糖胺+脂多糖急性攻建慢加急性肝衰竭大鼠為模型，造模后與空白組比較，模型組大鼠HE染色顯示模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)廣泛性破壞，肝細(xì)胞大量變性、壞死，出現(xiàn)彌漫性炎癥浸潤及纖維組織增生，肝組織病理評分、CD68、iNOS、CD206、Arg-1表達(dá)均明顯上升。經(jīng)清溫并用法治療后，與模型組比較，大鼠肝組織破壞程度及炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，肝組織病理評分、CD206、Arg-1表達(dá)上升，CD68、iNOS表達(dá)下調(diào)，M1/M2型極化向M2型偏移。從研究結(jié)果分析顯示，ACLF發(fā)生時肝臟的炎性微環(huán)境能夠促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，這一結(jié)果與王俊[20]的研究結(jié)果基本一致，其認(rèn)為ACLF發(fā)生時，免疫系統(tǒng)被過度激活，肝臟浸潤的巨噬細(xì)胞分泌大量促炎因子和趨化因子使巨噬細(xì)胞向M1型極化，經(jīng)過反復(fù)級聯(lián)，機體免疫微環(huán)境內(nèi)穩(wěn)態(tài)嚴(yán)重失衡，從而造成全身炎癥反應(yīng)綜合征，并致使ACLF病情進(jìn)一步加重。而溫陽解毒化瘀方可改善肝衰竭大鼠肝損傷，可能與促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化有關(guān)。

綜上所述，溫陽解毒化瘀方能夠改善慢加急性肝衰竭大鼠肝臟炎癥反應(yīng)，減輕肝損傷，機制可能與其能上調(diào)CD206、Arg-1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化有關(guān)，此項研究在中醫(yī)藥防治肝衰竭領(lǐng)域提供新的治療思路，但是否還存在其他調(diào)控方式仍有待更進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-03-04） （本文編輯：田婧）