東海烏參多糖制備及其抗氧化活性研究

何卓宏 李運(yùn)超 楊凌杰 聞?wù)?/p>

摘要 [目的]研究不同濃度東海烏參粗多糖的體外抗氧化活性。[方法]利用堿解輔以木瓜蛋白酶解法提取東海烏參粗多糖，再用大孔樹脂對(duì)其脫色后，對(duì)不同濃度的東海烏參粗多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究。[結(jié)果]用AB-8型號(hào)的大孔樹脂脫色后的東海烏參多糖，在0.5～2.0 mg/mL，隨著東海烏參多糖濃度的增加其對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除能力以及還原力逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。[結(jié)論]東海烏參多糖體外抗氧化活性呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，在0.5～2.0 mg/mL，2.0 mg/mL的東海烏參多糖體外抗氧化活性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 東海烏參;多糖;制備;脫色;抗氧化活性

中圖分類號(hào) R 285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）08-0160-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.044

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Preparation and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Acaudina leucoprocta

HE Zhuo-hong， LI Yun-chao， YANG Ling-jie et al

（School of Food Science and Pharmaceutics， Zhejiang Ocean University， Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract [Objective]To study the antioxidant activity in vitro of crude polysaccharides from Acaudina leucoprocta at different concentrations.[Method]The crude polysaccharides of Acaudina leucoprocta were extracted by alkaline hydrolysis supplemented by papain hydrolysis， and then decolorized with macroporous resin. The antioxidant activity in vitro of crude polysaccharides from Acaudina leucoprocta with different concentrations in vitro was studied.[Result] The polysaccharide was decolorized by AB-8 macroporous resin. In the concentration range of 0.5-2.0 mg/mL， the scavenging ability of polysaccharides from Acaudina leucoprocta on hydroxyl radical， DPPH radical and superoxide anion radical， and the reducing capacity enhanced with the increase of polysaccharide concentration. [Conclusion] The antioxidant activity in vitro of polysaccharides of Acaudina leucoprocta show a significant dose-effect relationship. In the concentration range of 0.5-2.0 mg/mL， 2.0 mg/mL of polysaccharides of Acaudina leucoprocta has the strongest antioxidant activity in vitro.

Key words Acaudina leucoprocta; Polysaccharide;Preparation; Decolorization; Antioxidant activity

東海烏參，又稱為白肛海地瓜，屬棘皮動(dòng)物門、海參綱、海地瓜屬，是一種海洋無(wú)脊椎生物 [1]。東海烏參體型呈紡錘形，長(zhǎng)4～12 cm，顏色為棕黑色，因其顏色和體形都與地瓜相仿，因此又名“海地瓜”;其廣泛分布于我國(guó)浙江、福建等沿海海域，資源豐富 [2]。東海烏參有著非常豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、多糖、皂苷、脂肪和氨基酸等活性成分 [3-4]。但因其重金屬含量超標(biāo)，不宜直接食用，因此許多研究者把目光轉(zhuǎn)向了東海烏參的藥用價(jià)值研究。

多糖從來(lái)源上區(qū)分，可大致分為植物多糖和動(dòng)物多糖，大量的試驗(yàn)研究揭示了多糖具有多種有應(yīng)用前景的藥理和生理活性，而目前與植物多糖相關(guān)的活性研究較多，而與動(dòng)物多糖相關(guān)的研究相對(duì)而言較少。如白羽等 [5]研究指出馬齒莧多糖能對(duì)糖尿病大鼠心臟起保護(hù)作用;陳平等 [6]研究表明香菇柄多糖具有抗氧化活性;潘世杰等 [7]研究指出茯苓多糖能對(duì)小鼠急性胃黏膜損傷有保護(hù)作用。海參多糖是海參體壁的一種重要成分，含量約為6% [8]。研究表明，海參多糖具有極高的藥用價(jià)值和生理活性，如蔡彬新 [9]研究顯示海地瓜多糖能顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血脂升高作用;龔燕波等 [10]研究得出海地瓜多糖可以顯著增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的存活時(shí)間，有一定程度的抗衰老作用;錢晉等 [11]臨床研究發(fā)現(xiàn)海參多糖具有抗凝和降低血黏度的功效。在我國(guó)東海烏參資源豐富易獲取，且經(jīng)濟(jì)成本低廉，因此研究海參多糖具有極高的藥用價(jià)值和臨床價(jià)值。筆者研究了不同濃度的東海烏參粗多糖的體外抗氧化活性，為東海烏參多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用打下基礎(chǔ)。6ABFBC21-3921-40E9-A183-6C2C7E489A2B

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。

東海烏參原材料購(gòu)自浙江寧波海鮮市場(chǎng)。

1.1.2

試劑。無(wú)水乙醇（20170413）、硫酸（10021618）、三氯甲烷（191108558F）、正丁醇（20210508）、苯酚（20171020）均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度規(guī)格均為分析純;DPPH自由基清除能力試劑盒（K1629061，南京建成生物工程研究所）;鄰苯三酚（EK290154，安耐吉）;H2O2（B1826048，阿拉?。?。

1.1.3

儀器。中藥粉碎機(jī)（103型，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）;大容量低速離心機(jī)（TD5K，長(zhǎng)沙旺東實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;冷凍干燥機(jī)（FD-1E，北京德天佑科技發(fā)展有限公司）;恒溫水浴鍋（HH-S，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）;SB-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）;電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司）;Multiskan FC全自動(dòng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 東海烏參多糖的提取。

東海烏參清洗干凈后去除內(nèi)臟，接著將東海烏參放入烘箱中50 ℃充分烘干，然后用粉碎機(jī)將烘干后的東海烏參粉碎成細(xì)粉狀，最后將細(xì)粉過(guò)80目篩得到的東海烏參干粉備用。稱取100 g東海烏參干粉，加入400 mL 6%NaOH溶液在4 ℃浸提24 h。然后使用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6.5，接著再添加5 g木瓜蛋白酶在55 ℃條件下酶解5 h后，置于100 ℃滅酶。冷卻后3 000 r/min離心10 min，離心后取用上清液。往上清液里加入1/5體積Sevage溶液進(jìn)行脫蛋白，磁力攪拌40 min后，接著3 000 r/min離心10 min，然后棄去溶液的蛋白層和有機(jī)試劑，只留取上清液，再往上清液中加入Sevage溶液，重復(fù)該步驟多次，直至溶液離心分層后再無(wú)蛋白層。最后進(jìn)行醇沉操作，即加入4倍體積的無(wú)水乙醇溶液于上清液中，靜止24 h后離心取沉淀，加水溶解后于-45 ℃凍干，得東海烏參粗多糖。

1.2.2 多糖脫色率和保留率的測(cè)定。

在300～600 nm對(duì)還未脫色的東海烏參多糖進(jìn)行掃描，以確定未脫色的東海烏參多糖的最大吸收波長(zhǎng)為380 nm，因此用380 nm處的吸光度來(lái)表征東海烏參多糖溶液的色值，根據(jù)公式（1）計(jì)算脫色率。采用苯酚-硫酸法對(duì)東海烏參多糖的含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式（2）計(jì)算多糖保留率。

脫色率=脫色前吸光度-脫色后吸光度脫色前吸光度×100%（1）

多糖保留率=脫色后多糖含量脫色前多糖含量×100%（2）

1.2.3 大孔樹脂預(yù)處理。

試驗(yàn)前讓大孔樹脂在無(wú)水乙醇溶液完全浸泡24 h，將浸泡好的大孔樹脂裝柱后用乙醇溶液淋洗，直至淋洗的流出液與水按1∶5的比例混合后不發(fā)生渾濁。接著將乙醇溶液換成純水繼續(xù)淋洗，直到淋洗至無(wú)醇味。然后用配制好的5% HCl溶液流經(jīng)樹脂柱，使樹脂柱完全浸泡在5% HCl溶液中2～4 h，接著用純水淋洗至中性后，再用配制好的2% NaOH溶液通過(guò)樹脂柱，使其完全浸泡在2% NaOH溶液中2～4 h，最后用純水淋洗至中性后，備用。

1.2.4 大孔樹脂篩選。

稱取處理好的3種樹脂D101、AB-8和732陽(yáng)離子樹脂各50 g裝柱，對(duì)東海烏參多糖溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。樹脂裝柱平衡后，將東海烏參多糖配制成50 mg/mL 的溶液，加入10 mL過(guò)柱，上樣流速為2 BV/h，上樣后待吸附完全后，用純水以2 BV/h的流速洗脫，直至層析柱流出液未檢測(cè)出糖為止。

1.2.5 東海烏參多糖的體外抗氧化活性研究。

1.2.5.1 羥基自由基清除能力的測(cè)定。

將體積為1 mL 0.03%過(guò)氧化氫溶液分別與1 mL 9 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液、1 mL 9 mmol/L 水楊酸的50%乙醇溶液和1 mL不同濃度的東海烏參粗多糖溶液37 ℃條件下精確反應(yīng)1 h，然后等到所有溶液冷卻至室溫，再于510 nm處測(cè)定溶液吸光度，將該吸光度記為A1;用蒸餾水替換東海烏參粗多糖溶液來(lái)設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)該組測(cè)得的吸光度記為A2;將水楊酸的50%乙醇溶液換成50%乙醇溶液設(shè)為樣品對(duì)照組，該組測(cè)得的吸光度記為A3。羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

清除率=（1-A1-A3A2）×100%（3）

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定。

加入2 mL的DPPH（1，1-二苯基-2-苦苯肼）溶液于干凈的玻璃試管中，接著往試管中加入1 mL的無(wú)水乙醇，將試管內(nèi)的溶液充分混勻后，置于避光條件下充分反應(yīng)30 min，最后在519 nm處測(cè)定溶液的吸光度，將該溶液的吸光度記為A1。量取2 mL的DPPH溶液加入至干凈的玻璃試管中，接著向試管中分別加入不同濃度的東海烏參多糖溶液0.5 mL，然后再加入0.5 mL無(wú)水乙醇溶液，將試管內(nèi)的溶液充分混勻后，同樣置于避光條件下完全反應(yīng)30 min，測(cè)定該溶液517 nm處吸光度，將其記為A2。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

清除率=A1-A2A1×100%（4）

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定。

將配制好的0.1 mol/L 的Tris-HCl溶液（pH=8.2）按2.25 mL加入到各試管內(nèi)，在25 ℃下水浴20 min后，繼續(xù)向試管內(nèi)分別加入不同濃度東海烏參多糖溶液500 μL和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液250 μL，將試管置于室溫下反應(yīng)5 min后取出，接著向試管中加入2 mol/L的HCl溶液0.5 mL。靜置一段時(shí)間后，最后于325 nm處測(cè)定該溶液的吸光度，將其記為A1?？瞻捉M的設(shè)置則為用等體積的去離子水替換樣品溶液，將其記為A2。超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式如下：6ABFBC21-3921-40E9-A183-6C2C7E489A2B

清除率=A2-A1A2×100%（5）

1.2.5.4 還原力。

配制濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 4個(gè)梯度的東海烏參多糖樣品溶液，分別量取2 mL的東海烏參多糖溶液于干凈的玻璃試管中，接著向試管內(nèi)加入2 mL的0.2 mol/L pH 6.6的PBS溶液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，將試管內(nèi)的溶液充分混合均勻，再將試管置于50 ℃條件下，恒溫水浴20 min，水浴完成后向試管內(nèi)加入2 mL的10% 三氯乙酸（TCA）溶液，將試管內(nèi)溶液充分混合，最后于700 nm處測(cè)定該溶液的吸光度。通過(guò)吸光度的大小來(lái)判斷東海烏參多糖的還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 東海烏參多糖的脫色率和保留率

樹脂D101、AB-8和732對(duì)東海烏參多糖溶液的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)的結(jié)果如表1所示，由三者結(jié)果比較可知，樹脂AB-8的脫色效果最佳，其得到的多糖保留率為82.8%，脫色率為64.7%。因此，用AB-8樹脂脫色后的東海烏參多糖進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)研究。

2.2 東海烏參多糖的抗氧化活性

2.2.1 羥基自由基清除能力。

羥基自由基的化學(xué)活性強(qiáng)，易與氨基酸、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子發(fā)生反應(yīng)，并且也可以有效地誘發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)。因此，去除羥基自由基可能是機(jī)體對(duì)抗各種疾病最有效的防御手段之一。從不同濃度東海烏參多糖對(duì)羥基自由基的清除能力（圖1）可以看出，在濃度為0.5～2.0 mg/mL，東海烏參多糖的濃度越高，則其對(duì)羥基自由基的清除能力越強(qiáng);在2.0 mg/mL濃度下，東海烏參多糖對(duì)羥基自由基的清除能力達(dá)到50%。

2.2.2 DPPH自由基清除能力。

DPPH已廣泛用于抗氧化活性分析，該測(cè)試體系可用于初步表征化合物的清除能力。從圖2可以看出，東海烏參多糖樣品濃度越高，其對(duì)DPPH自由基清除能力越強(qiáng)。當(dāng)東海烏參多糖濃度從0.5 mg/mL增加至2.0 mg/mL時(shí)，東海烏參多糖對(duì)DPPH自由基的清除率也從30%增加至45%。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除能力。

超氧陰離子自由基通常首先在細(xì)胞氧化反應(yīng)中形成。超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)形成自由基的重要來(lái)源，雖然其本身活性不高，但通過(guò)多種反應(yīng)超氧陰離子自由基可以產(chǎn)生活性較高的過(guò)氧化氫和羥基自由基，使氧化反應(yīng)更易發(fā)生。從不同濃度東海烏參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力（圖3）可以看出，東海烏參多糖樣品濃度越高，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力越強(qiáng)。當(dāng)東海烏參多糖濃度為2.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為26%。

2.2.4 還原力。

抗氧化活性可以通過(guò)還原力反映，還原力越強(qiáng)，抗氧化活性越強(qiáng)。700 nm 吸光度越高，東海烏參多糖的還原性越強(qiáng)。從圖4可以看出，溶液吸光度與東海烏參多糖濃度呈正相關(guān)，東海烏參多糖濃度越高，其還原力越強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)堿提法提取東海烏參體壁中的多糖，分別用樹脂D101、AB-8和732對(duì)東海烏參多糖進(jìn)行脫色處理，樹脂AB-8得到的多糖保留率為82.8%、脫色率為64.7%，為3種樹脂中最佳。

羥基自由基清除能力的測(cè)定可為抗氧化活性提供了有力的參考，高羥基自由基清除能力增強(qiáng)了其抗氧化能力和保護(hù)羥基自由基損傷的能力 [12]。該研究結(jié)果表明，東海烏參多糖濃度在0.5～2.0 mg/mL，其濃度與羥基自由基的清除能力有明顯的量效關(guān)系，2.0 mg/mL濃度下，東海烏參多糖對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，清除率高達(dá)50%。試驗(yàn)結(jié)果顯示了東海烏參多糖對(duì)羥基自由基有較好的清除能力。

大多數(shù)自由基活性高，存在時(shí)間短。DPPH自由基是在室溫下仍能保持穩(wěn)定的少量自由基之一。DPPH自由基在517 nm處具有很好的吸光度，吸光度水平的減少代表著抗氧化性的增加，如果用清除率來(lái)表示，則清除率越大抗氧化性就越強(qiáng) [13]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，東海烏參多糖隨濃度的增加對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，具有明顯地抑制DPPH自由基的能力，有較強(qiáng)的抗氧化性。

超氧陰離子自由基及其衍生物均具有細(xì)胞損傷性，可對(duì)DNA和細(xì)胞膜造成損傷。因此，清除超氧陰離子自由基對(duì)生

命體來(lái)說(shuō)至關(guān)重要 [14]。該研究結(jié)果表明，東海烏參多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量依賴，濃度為2.0 mg/mL時(shí)，清除率最高。

該試驗(yàn)檢測(cè)了東海烏參多糖的還原力，從試驗(yàn)結(jié)果可知，東海烏參多糖的還原力與其濃度呈正相關(guān)。

綜上可知，經(jīng)AB-8樹脂脫色后的東海烏參多糖具有抗氧化活性，在一定范圍內(nèi)，其抗氧化能力與濃度呈正相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果為東海烏參多糖的進(jìn)一步活性研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 廖玉麟.中國(guó)動(dòng)物志：棘皮動(dòng)物門 海參綱[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[2] 羅先群，王新廣，楊振斌.海地瓜的開(kāi)發(fā)和利用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2000，21（3）：34-35.

[3] 蘇永昌，劉淑集，劉秋鳳，等.海地瓜營(yíng)養(yǎng)成分的分析及評(píng)價(jià)[J].漁業(yè)研究，2016，38（4）：288-294.

[4] 伏緯華，吳鳳梧，戚寶鳳，等.海地瓜與海參營(yíng)養(yǎng)成分的比較[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1991，8（3）：46-47.

[5] 白羽，王燕，張心雨，等.馬齒莧多糖對(duì)糖尿病心肌病大鼠的影響[J].中成藥，2021，43（10）：2858-2862.

[6] 陳平，江崇弘.香菇柄多糖的提取純化及抗氧化活性研究[J].科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，2021（30）：47-49.

[7]? 潘世杰，丁麗婷，胡婕倫，等.茯苓多糖對(duì)乙醇致小鼠急性胃黏膜損傷的輔助保護(hù)作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2021，42（17）：1-6.6ABFBC21-3921-40E9-A183-6C2C7E489A2B

[8] QIN Y J，YUAN Q X，ZHANG Y X，et al.Enzyme-assisted extraction optimization，characterization and antioxidant activity of polysaccharides from sea cucumber Phyllophorus proteus[J].Molecules，2018，23（3）：1-19.

[9] 蔡彬新.海地瓜多糖提取純化及其降血脂活性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

[10] 龔燕波，方崇波，邵青.海地瓜多糖的抗衰老生物活性研究[J].基層中藥雜志，2001（5）：17-18.

[11] 錢晉，過(guò)鑫昌，王學(xué)鋒，等.玉足海參酸性粘多糖對(duì)冠心病患者血凝、血液粘度及血脂的影響[J].上海醫(yī)學(xué)，1997，20（6）：342-344.

[12] JE J Y， PARK P J， KIM S K.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack（Theragra chalcogramma）frame protein hydrolysate[J].Food research international，2005，38（1）：45-50.

[13] GHRIBI A M，SILA A，PRZYBYLSKI R，et al.Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysate of chickpea （Cicer arietinum L.）protein concentrate[J].Journal of functional foods，2015，12：516-525.

[14] XIE Z J， HUANG J R， XU X M，et al.Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate[J].Food chemistry，2008，111（2）：370-376.6ABFBC21-3921-40E9-A183-6C2C7E489A2B