一株秸稈降解耐冷細菌的分離及其主要生物活性

王靖然 董珊珊 侯雨昕 韓梅

摘要 [目的]從自然生境中篩選低溫降解秸稈的優(yōu)良菌株，為提高冷涼條件下秸稈腐解效率提供菌種資源。[方法]16? ℃下，以玉米秸稈唯一碳源繼代富集培養(yǎng)，以CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基初篩，以玉米秸稈唯一碳源發(fā)酵復篩。[結果]從蘑菇渣中篩選獲得1株在16～25 ℃時產(chǎn)纖維素酶和秸稈降解能力最強的菌株mgz-5，經(jīng)形態(tài)學和16S rDNA序列分析等鑒定為雞糞蒼白桿菌（Ochrobactrum? gallinifaecis sp.）。[結論]菌株的低溫適應能力強，對數(shù)期長，繁殖速度快，低溫產(chǎn)酶活性高，應用潛力大。

關鍵詞 秸稈腐解;低溫菌;篩選;纖維素酶

中圖分類號 S 182? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）08-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.023

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and Identification of 1 Strain of Low Temperature and High Efficiency Cellulose Degradation Bacteria and Biological Activity of the Strain

WANG Jing-ran， DONG Shan-shan，HOU Yu-xin et al （College of Land and Environment， Shenyang Agricultural University， Key Laboratory of Arable Land Conservation （Northeast China）， Ministry of Agriculture， National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources， Shenyang， Liaoning 110866）

Abstract [Objective]Filter low temperature and high efficiency straw degrading strain from natural habitat，provide strain resources for improving the decomposition efficiency of straw under cold climate. [Method]Under 16 ℃， enriched culture in the medium with corn straw as the only carbon source， primary screen in the isolation medium with Sodium Carboxymethyl Cellulose and Congo Red， second screen in the medium with corn straw as the only carbon source. [Result]The strain（mgz-5） with the strongest cellulase production and straw degradation ability was isolated from mushrooms， it was identified as Ochrobactrum gallinifaecis sp. by morphology and 16S rDNA sequence analysis. [Conclusion]The strain has strong adaptability to low temperature， long logarithmic phase， fast reproduction speed， high enzyme activity under low temperature and high potential application value.

Key words Straw decomposition;Psychrophiles;Filter;Cellulase

秸稈的主要成分為纖維素和半纖維素，其利用的途徑之一是還田，作為肥料為下茬作物提供營養(yǎng)物質(zhì)。秸稈腐解實際上是靠某些微生物分泌纖維素酶的水解作用實現(xiàn)的，產(chǎn)纖維素酶的微生物以真菌居多，細菌較少。纖維素酶是復合酶，一般包括內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶（Cx）、外切-1，4-β-葡聚糖酶（C1）和β-葡萄糖苷酶（CB）3種組分，其中Cx為關鍵酶，3種酶協(xié)同降解纖維素 [1] 。

溫度是影響生物生存的限制因素，所有微生物均具有特征性的最適生長溫度，在適宜溫度下微生物具有最大的生長和繁殖速率 [2]。根據(jù)最適生長溫度，微生物可被分為高溫菌、中溫菌和低溫菌3類。其中，低溫菌又分為耐冷菌和嗜冷菌，耐冷菌的最適生長溫度在20～25 ℃ [3]，嗜冷菌的最適生長溫度<16 ℃，上限為20 ℃。同時，微生物還具有一定的溫度耐受范圍，低于或高于這一溫度范圍，它們就會因新陳代謝失活而不能生長。通常低溫菌產(chǎn)低溫酶，中高溫和耐高溫菌產(chǎn)高溫酶，低溫酶最適作用溫度為5～40 ℃，中高溫酶最適作用溫度為45～65 ℃ [4-5]。我國北方地區(qū)秸稈資源豐富，但冷涼期長，秸稈自然腐解速率慢，限制了秸稈中養(yǎng)分釋放和下季播種，因此開展低溫高效秸稈腐解菌劑的研究，挖掘適合當?shù)貧夂驐l件的菌種資源，對于促進秸稈腐解、提高秸稈利用率和培肥地力具有重要的現(xiàn)實意義 [6-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌源材料。

還田玉米秸稈（htjg）和還田土（htt）采自沈陽農(nóng)業(yè)大學北山試驗基地，腐熟玉米秸稈堆肥（jgdf）采自沈陽農(nóng)業(yè)大學北山試驗基地堆肥場，常青藤落葉下土壤（lyt）采自沈陽農(nóng)業(yè)大學軟棗獼猴桃試驗基地圍墻外，蘑菇渣（mgz）采自沈陽農(nóng)業(yè)大學食用菌廠，玉米秸稈高留茬土（lct）和免耕土（mgt）采自遼寧省農(nóng)業(yè)科學院試驗基地，腐解松針土（szt）和風景樹下土（sxt）采自沈陽市東陵公園。

1.1.2 玉米秸稈。采自沈陽農(nóng)業(yè)大學北山試驗基地，晾干，去葉鞘，截短，于陰涼通風處晾干和存放。

1.1.3 培養(yǎng)基。

富集培養(yǎng)基：以赫奇遜（Hutchinson）培養(yǎng)基為基礎，以玉米秸稈為唯一碳源，替代原配方中碳源。培養(yǎng)基其他成分：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，CaCl2·6H2O 0.10 g，蒸餾水1 L，每100 mL培養(yǎng)基加1.00 g秸稈段（需準確稱量），自然pH。

CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 1.5 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 L，瓊脂粉13～15 g，自然pH。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO4 13.3 g，KH2PO4 4.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO4 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，秸稈粉5.0 g，自然pH [8]。

CMC-Na產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO4 13.3 g，KH2PO4 4.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2SO4 0.5 g，蒸餾水1 L，CMC-Na 10.0 g，自然pH。

秸稈降解培養(yǎng)基：同富集培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑。

DNS顯色劑：3，5-二硝基水楊酸3.05 g，NaOH 6.7 g，50 ℃下恒溫攪拌待完全溶解，加入四水酒石酸鉀鈉101 g，50 ℃下溶解苯酚2.5 mL，加蒸餾水定容至500 mL，儲存于棕色瓶中，保存?zhèn)溆?[9]。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖溶液：C6H8O7·H2O 4.83 g，C6H5O7·Na3·2H2O 7.94 g，蒸餾水定容1 L，pH 4.8。

1% CMC-Na溶液：1.0 g羧甲基纖維素鈉溶于檸檬酸緩沖溶液，并定容至100 mL。

0.5%水楊素溶液：0.5 g水楊素溶于檸檬酸緩沖溶液，并定容至100 mL。

PCR擴增體系：通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），50 μL反應體系，DNA模版5 μL，上下游引物各2 μL，Taq混合酶25 μL，ddH2O加至50 μL。

1.2 試驗方法

1.2.1 秸稈預處理。取玉米秸稈截成長約1 cm的段，用蒸餾水浸泡24 h，去除可溶性有機物，沖洗數(shù)次，45 ℃烘干;另取適量經(jīng)浸泡烘干的秸稈段，用粉碎機粉碎成20目秸稈粉，備用。

1.2.2 樣品采集。在10 ℃以下自然環(huán)境中采集菌源樣品適量，裝入無菌自封袋帶回實驗室，4 ℃冷藏。

1.2.3 繼代富集培養(yǎng)。

取10.0 g菌源樣品于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩20 min，充分靜置，吸取上清液1 mL于100 mL富集培養(yǎng)基中，16 ℃下靜止培養(yǎng)，每天觀察、搖動1次，待秸稈段松散變軟，培養(yǎng)液顏色變深，以5%接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的富集培養(yǎng)基上，如此重復繼代培養(yǎng)5次。

1.2.4 菌株的初篩。

采用透明圈法。對第5代富集培養(yǎng)液進行10倍梯度稀釋，取各稀釋度溶液0.1 mL，分別涂布于CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基上，16 ℃下培養(yǎng)，挑取有明顯透明圈的單菌落在新的分離培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，多次純化，直至獲得純培養(yǎng)，4 ℃保存。

1.2.5 菌株的復篩。通過透明圈直徑和菌落直徑比值（D/d）、纖維素酶活、秸稈降解率等對初篩分離物進一步篩選。

（1）種子液的制備。用接種環(huán)挑取初篩分離物1～2環(huán)，接入100 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，于16 ℃下培養(yǎng)5 d，備用。

（2）D/d值的測定。取種子液涂布于分離培養(yǎng)基上，于16 ℃下培養(yǎng)，待菌落長出并產(chǎn)生明顯的透明圈，用直尺測量透明圈直徑D和菌落直徑d，計算D/d比值。

（3）粗酶液的制備。取5 mL種子液接入100 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，于16 ℃培養(yǎng)5 d，4 ℃下8 000 r/min離心15 min，收集上清液，備用。

（4）纖維素酶活力的測定。采用DNS顯色法 ?[10-11]。除測定3種纖維素酶Cx、C1和CB外，同時測定濾紙酶（FPA）的活性，F(xiàn)PA代表3種纖維素酶協(xié)同作用的總活力。1 mL酶液于一定溫度下進行酶解反應，1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖的纖維素酶含量定義為1個酶活力單位，以 U/mL表示。

（5）秸稈降解率的測定。采用失重法 [12]。取種子液5 mL，接入100 mL秸稈降解培養(yǎng)基，于16 ℃下培養(yǎng)，期間經(jīng)常觀察和搖動，至30 d時取出秸稈段，烘干稱重，計算處理前后秸稈段的失重率作為降解率，按下式計算：

秸稈降解率=（W1-W2）/W1×100%

式中，W1和 W2分別為降解前和降解后的秸稈質(zhì)量。

1.2.6 菌株鑒定。

取種子液接于不加剛果紅的CMC-分離培養(yǎng)基上，16 ℃培養(yǎng)5 d，收集菌苔，提取16S rDNA，PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳提純，送交上海生工測序，結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，采用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.7 最適生長溫度的測定。采用比色法 [13]。以5%的接種量，取種子液接于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于16、20、25、28 ℃下靜置培養(yǎng)，每隔24 h取樣，測定OD540值，至OD值下降3個點停止測定。以空白培養(yǎng)基為對照。

1.2.8 菌株生長曲線和代時（G）的測定。

采用稀釋平板計數(shù)法。以5%的接種量取種子液接于300 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，置于最適生長溫度下靜置培養(yǎng)，每24 h準確取0.1 mL培養(yǎng)液，涂布于分離培養(yǎng)基上，可做適當稀釋，置于最適生長溫度下培養(yǎng)，7 d左右計數(shù)菌落，計算1 mL培養(yǎng)液的活菌數(shù)，以時間為橫坐標，活菌對數(shù)值為縱坐標繪制生長曲線。取對數(shù)期內(nèi)2點t1和t2時的活菌數(shù)N1和N2，代入公式n=lg（N2/N1）/lg2和G=△t/n，計算G。式中，n為繁殖代數(shù)，△t=t2-t1。

1.2.9 最適產(chǎn)酶溫度的測定。采用DNS顯色法。以5%的接種量，取種子液接于CMC-Na產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，于35、30、25、20、16、10、7、4 ℃培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液測定纖維素酶活。以溫度為橫坐標、酶活力為縱坐標作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩 在16 ℃下菌源樣品繼代富集培養(yǎng)5代，取第5代培養(yǎng)物，采用CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基以稀釋平板計數(shù)法，經(jīng)多次分離純化，分離獲得具有纖維素降解能力的分離物11個：lct-1、htjg-2、htt-7、jgdf-3、lyt-3、jgdf-6、szt-1、mgz-3、mgt-2、sxt-2、mgz-5。

2.2 菌株的復篩

2.2.1 D/d值。初篩分離物在CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生的透明圈直徑D和菌落直徑d的比值見表1。由表1可知，菌株mgz-5的D/d最大，達2.71;jgdf-3、szt-1次之，分別為2.31和2.43。

2.2.2 纖維素酶活力。

在16 ℃下，以玉米秸稈為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中各菌株4種纖維素酶活力見圖1。由圖1可知，mgz-5的4種纖維素酶活均高于其他菌株，且差異顯著（P<0.05），其Cx、C1、CB和FPA的酶活力依次為11.066、12.387、7.160和22.594? U/mL;其次為jgdf-3。

2.2.3 秸稈降解率。在16 ℃下，玉米秸稈處理30 d的降解率見圖2。由圖2可知，mgz-5和jgdf-3的秸稈降解率較高，且差異顯著（P<0.05）。在培養(yǎng)過程中也觀察到二者的培養(yǎng)液顏色變深，絮狀物析出的速度較其他處理快，秸稈段軟化更加明顯。??? 經(jīng)過初篩和復篩，以及多項指標綜合考察，篩選出較優(yōu)菌株mgz-5。

2.3 菌株的鑒定

通過對mgz-5進行16SrDNA提取、PCR擴增和序列分析表明，16S rDNA的大小在1 496 bp，確證mgz-5為細菌。mgz-5的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，其PCR擴增產(chǎn)物條帶清晰，帶型完整、無雜帶，說明擴增產(chǎn)物較純。測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，發(fā)現(xiàn)mgz-5與Ochrobactrum屬的序列相似性最高，同源性均在95%以上，用MEGA 7.0構建mgz-5的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。? 由圖4可見，mgz-5與Ochrobactrum gallinifaecis strain Iso 196 位于同一分支上，說明二者同源，因此，可以確定mgz-5為雞糞蒼白桿菌屬（Ochrobactrum gallinifaecis sp.）。

2.4 最適生長溫度 不同溫度下菌液的OD540隨時間變化曲線見圖5。由圖5可知，mgz-5在25 ℃下OD540最高，表明在該溫度下細胞繁殖最快，最適合菌株生長繁殖。

2.5 生長曲線 在最適生長溫度25 ℃下，mgz-5的1 mL活菌數(shù)對數(shù)值隨時間的變化情況見圖6。由圖6可知，菌株無明顯延滯期，接種后幾乎直接進入對數(shù)期，5 d為對數(shù)期末，6～13 d為穩(wěn)定期，穩(wěn)定期維持時間較長（8 d），對于收獲酶和菌體等發(fā)酵產(chǎn)物極為有利。

2.6 菌株的代時（G） 對數(shù)期內(nèi)的微生物個體生物學特性比較穩(wěn)定，故計算代時需要采用對數(shù)期內(nèi)任意2點的活菌數(shù)計算。菌株mgz-5的對數(shù)期在0～5 d，故可取t1=24 h和t2=48 h 2點，查得對應的活菌數(shù)為 N1=3.54×10 8 CFU/mL和 N2=1.23×10 9 CFU/mL，故代入 n 和G 的計算公式，求得G=13.3 h。

2.7 菌株最適產(chǎn)酶溫度 溫度是影響微生物生長和代謝的限制性因素。在4～35 ℃下測得mgz-5的3種纖維素酶活以及濾紙酶活，結果見圖7。由圖7可知，在所測較低溫度范圍內(nèi)，4種纖維素酶均具有一定的活性。其中，25 ℃時4種酶活性具有最高值，分別為Cx 39.518 U/mL，C1 89.687 U/mL，CB 51.499 U/mL，F(xiàn)PA 63.423 U/mL，且均與其他溫度下的酶活力差異顯著。而且，作為關鍵組分的Cx 在25～16 ℃區(qū)間存在一個近平臺期，即39.52～36.48? U/mL，表明Cx在該溫度區(qū)間能保持較高酶活力;此外，C1、CB和FPA在該溫度區(qū)間亦分別有較高的酶活，表明該菌株具有較好的低溫降解秸稈的潛質(zhì)。

3 結論與討論

目前國內(nèi)對于纖維素降解菌的研究以中高溫菌居多，低溫纖維素降解菌的研究相對較少，李春艷等 [14]從生活垃圾土壤中分離得到1株，該菌株的最高Cx酶活性為14.12 U/mL，王勇等 [15]從常年堆積枯枝落葉的腐殖土壤中篩選出1株真菌，該菌株最高Cx酶活性為8.47 U/mL，孟建宇等 [16]從土壤中篩選得到1株，其最高Cx酶活性為11.6 U/mL。高云航等 [17]從長白山凍土中篩選到1株，其最高Cx酶活性為59.7 U/mL。該研究結果表明，Mgz-5的最高Cx酶活性為39.518 U/mL，對比其他低溫纖維素降解菌，mgz-5的最高Cx酶活性處于中上水平，且在25至16 ℃都具有較高的Cx酶活性。mgz-5的低溫生長具有對數(shù)期長、無明顯延滯期和代時短的特點，可以較好地適應低溫環(huán)境。mgz-5作為1株優(yōu)質(zhì)高效低溫秸稈降解菌具有較好的應用前景。后續(xù)研究將圍繞mgz-5進行低溫纖維素菌系的構建，菌系中加入產(chǎn)CB酶能力強的菌株，使mgz-5產(chǎn)Cx酶強的優(yōu)點得以充分發(fā)揮，為我國東北部冷涼地區(qū)的秸稈降解提供技術支持。

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