2種常見(jiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)在蘋果中的適用性特征

岳鵬 高海琴 李哲 米志波 鄭博 趙彥敏

摘要：運(yùn)用生物信息學(xué)方法初步分析CRISPR-Cas9和Cpf1在蘋果中的整體適用性特征，以期為蘋果基因組編輯和CRISPR-Cas在蘋果研究中的推廣使用提供一定的參考和便利。結(jié)果表明，蘋果染色體中有數(shù)量可觀的PAM，平均間隔7 bp堿基有1個(gè)5′-NGG、間隔3 bp有1個(gè)5′-TTN;也就是說(shuō)5′-TTN比5′-NGG的出現(xiàn)頻率高。SpCas9、FnCpf1分別有29.0%、26.9%的作用位點(diǎn)幾乎覆蓋了所有染色體基因，個(gè)別不能被SpCas9識(shí)別的基因能被FnCpf1識(shí)別，反之亦然。蘋果的CRISPR靶序列有大量重復(fù)，單一靶序列被視為能被Cas蛋白特異識(shí)別并有效編輯。在靶序列長(zhǎng)度為20 nt時(shí)，99.5%的染色體基因可至少被其中1種Cas蛋白編輯，分別具有不同的可編輯度搭配;其中的237個(gè)基因只能被1種Cas蛋白編輯，填補(bǔ)了另一種Cas蛋白留下的編輯空白，另有220個(gè)染色體基因（0.5%）不能被任一種Cas蛋白編輯，即2種Cas蛋白同時(shí)留下編輯空白，沒(méi)有互補(bǔ)。

關(guān)鍵詞：蘋果;CRISPR-Cas;適用性特征;PAM出現(xiàn)頻率;基因編輯

中圖分類號(hào)：S661.101 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）07-0043-08

收稿日期：2021-06-04

基金項(xiàng)目：中國(guó)成人教育協(xié)會(huì)“十四五”成人繼續(xù)教育科研規(guī)劃重點(diǎn)課題（編號(hào)：2021-323ZB）;河北省張家口市科技項(xiàng)目（編號(hào)：18110300043）;河北省張家口市社會(huì)科學(xué)立項(xiàng)研究課題（編號(hào)：2021121）。

作者簡(jiǎn)介：岳 鵬（1984—），男，河北張家口人，碩士，講師，從事農(nóng)林生命科學(xué)類和開(kāi)放教育研究。E-mail：yppolymerase@foxmail.com。

通信作者：趙彥敏，博士，副教授，從事農(nóng)林生命科學(xué)類和開(kāi)放教育研究。E-mail：zym319@163.com。

蘋果（ Malus domestica ）是世界上主要果樹(shù)作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量易受生物和非生物脅迫的影響[1]。因此，了解抗逆性相關(guān)基因的功能及調(diào)控規(guī)律，對(duì)培育抗逆性強(qiáng)的品種至關(guān)重要[2]。與其他作物相比，果樹(shù)具有高度雜合的多倍體基因組且繁育周期長(zhǎng)，導(dǎo)致傳統(tǒng)的育種研究進(jìn)展緩慢[3];而隨著基因組測(cè)序工作的完成，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、基因通路和基因功能的認(rèn)識(shí)為基因編輯奠定了基礎(chǔ)[4]。高效、易用、省時(shí)、低成本的基因編輯技術(shù)是賦予果樹(shù)重要經(jīng)濟(jì)性狀的捷徑。常間四文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白[CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）-Cas（CRISPR-associated proteins）]系統(tǒng)具備以上優(yōu)勢(shì)，在研究生物多種類的精確分子機(jī)制方面具有極高的應(yīng)用價(jià)值[5]。

當(dāng)前，基因組編輯技術(shù)主要集中在第2類CRISPR-Cas系統(tǒng)[6];它可以使用單個(gè)效應(yīng)蛋白剪切DNA，包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型[7]。其中，Ⅱ型的Cas9及其失去剪切活性的衍生品dCas9被廣泛應(yīng)用于多種生物體的基因組操作，包括靶向基因干擾、轉(zhuǎn)錄激活抑制、表觀遺傳修飾及目標(biāo)堿基對(duì)轉(zhuǎn)換[8-9]。經(jīng)典的Cas9蛋白須識(shí)別銜接在靶序列（+）3′端形如5′-NGG 的前間隔序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM，+），并在PAM上游第3個(gè)堿基處切割雙鏈，形成平頭末端;在人類基因組中約平均間隔8 bp就會(huì)有1個(gè)5′-NGG[10]。不同于此，Ⅴ型的Cpf1（Cas12a）要識(shí)別毗鄰在靶序列（+）5′端形似5′-TTN 的PAM（+），并在PAM下游的同向鏈（+）第18、互補(bǔ)鏈（-）第23堿基處交錯(cuò)切割，形成有5個(gè)突出堿基的黏性末端[11]。作為新型且更小的CRISPR效應(yīng)蛋白，Cpf1的開(kāi)發(fā)利用有利于突破和克服Cas9在使用中的一些限制，尤其是拓寬了CRISPR-Cas系統(tǒng)的識(shí)別范圍，使之能更有效地編輯富含AT堿基的基因組[12]。

CRISPR-Cas9已被大量使用在植物基因功能分析及育種研究中[13-15]，其中包括多種果樹(shù)[14]。有關(guān)蘋果的幾項(xiàng)研究，依次是首次利用CRISPR-Cas9敲除內(nèi)源 PDS （phytoene desaturase）基因[16]，高效傳送CRISPR-Cas9核糖核蛋白到蘋果原生質(zhì)體操縱DIPM1（ DspA/E -interacting proteins of ?M.×domestica ）、DIPM2和DIPM4基因[17]，優(yōu)化CRISPR-Cas9的應(yīng)用條件并敲除PDS和TFL1（terminal flower）基因[3]，運(yùn)用CRISPR-Cas9敲除DIPM4基因的同時(shí)又減少外源DNA的殘留[18]。相對(duì)地，CRISPR-Cpf1的技術(shù)特點(diǎn)更加鮮明，但在2016年首次應(yīng)用于水稻和煙草后[19]，在植物基因組項(xiàng)目中使用的報(bào)道較少，目前還未見(jiàn)于果樹(shù)研究[2]。

已有的研究結(jié)果表明，CRISPR-Cas系統(tǒng)可實(shí)際應(yīng)用于蘋果基因編輯，但只關(guān)注了少數(shù)幾個(gè)基因，且僅限于使用CRISPR-Cas9。本研究對(duì)蘋果全基因組序列進(jìn)行初步分析，嘗試探索2種流行的CRISPR-Cas系統(tǒng)，即CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1，在蘋果基因組編輯中的整體適用性，首次從PAM的數(shù)量和頻率、靶序列的重復(fù)和分布及2種Cas蛋白的互補(bǔ)等幾個(gè)方面開(kāi)展討論，并形成PAM位點(diǎn)和靶序列信息庫(kù)，以期為蘋果基因組編輯和CRISPR-Cas系統(tǒng)在蘋果研究中的推廣使用提供一定的參考和便利。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

蘋果全基因組代表性數(shù)據(jù)ASM211411v1下載自NCBI網(wǎng)站[20]，17條染色體（chromosome，chr）和1條線粒體（mitochondrion，mt）的DNA序列以FASTA格式分別存儲(chǔ)在文本文件中;所有下載的DNA都只有單鏈（+）。相應(yīng)的基因文件也從NCBI網(wǎng)站下載，其中以列表形式記錄基因在DNA序列上的起止位點(diǎn)等信息。最新發(fā)布在NCBI網(wǎng)站上的蘋果基因組數(shù)據(jù)ASM411538v1質(zhì)量更高[21]，但相應(yīng)的基因信息不夠完善，只在本研究中作對(duì)比和補(bǔ)充。在諸多CRISPR-Cas系統(tǒng)中，效應(yīng)蛋白SpCas9[化膿性鏈球菌（ Streptococcus pyogenes ，Sp）]和FnCpf1[弗郎西斯菌（ Francisella novicida ，F(xiàn)n）]識(shí)別的PAM較有代表性，分別為5′-NGG和5′-TTN[10-11];本研究圍繞這2種典型的PAM，嘗試使用個(gè)人計(jì)算機(jī)分析蘋果全基因組。

1.2 PAM計(jì)數(shù)和間距計(jì)算

對(duì)蘋果各DNA序列出現(xiàn)的5′-NGG或 5′-TTN 計(jì)數(shù)，并記錄中間堿基在DNA序列上的位點(diǎn)作為PAM位點(diǎn);還需要同時(shí)累計(jì)5′-CCN或 5′-NAA，以實(shí)現(xiàn)對(duì)互補(bǔ)鏈的搜索。計(jì)數(shù)期間，單獨(dú)計(jì)算N所代表的各種堿基占比，并用PAM位點(diǎn)數(shù)量與DNA長(zhǎng)度的比值表示序列的PAM密度。除線粒體外，合計(jì)染色體DNA的各項(xiàng)數(shù)據(jù)以考量全基因組。

同樣地，分別計(jì)算各DNA序列和全基因組的PAM出現(xiàn)頻率。將每2個(gè)相鄰PAM位點(diǎn)之差作為間距（用字母 d 表示），其意義為間隔 d 個(gè)堿基對(duì)存在1個(gè)PAM，代表PAM的出現(xiàn)頻率;并累計(jì)每個(gè) d的出現(xiàn)次數(shù)（用字母n表示），再把全部d升序排列（以t為排列序號(hào)），記錄不同d的數(shù)量（用字母m 表示）。PAM出現(xiàn)頻率的均值（ d? mean）和中值（ d? median）計(jì)算如下：

d? mean=∑ mi=1d in i∑mi=1n i;若∑ti=1n i≥∑mi=1n i2>∑t-1i=1n i，d? median =d t 。

1.3 計(jì)算剪切位點(diǎn)

在DNA序列上從5′-NGG前溯3個(gè)堿基或從5′-CCN后推3個(gè)堿基，獲得Cas9剪切位點(diǎn)。通過(guò)判斷剪切位點(diǎn)是否處于基因的起止位點(diǎn)之間，將對(duì)應(yīng)的PAM位點(diǎn)劃入相應(yīng)的基因范疇;不屬于任何基因范疇的PAM位點(diǎn)不做標(biāo)記。

依據(jù)Cpf1的剪切特征，在DNA序列上從5′-TTN后推18個(gè)堿基或從5′-NAA前溯23個(gè)堿基，獲得同向剪切位點(diǎn)，用來(lái)判斷相應(yīng)的PAM位點(diǎn)是否屬于同向鏈基因;從5′-TTN后推23個(gè)堿基或從 5′-NAA 前溯18個(gè)堿基，獲得逆向剪切位點(diǎn)，用來(lái)判斷相應(yīng)的PAM位點(diǎn)是否屬于互補(bǔ)鏈基因。

1.4 靶序列的截取

根據(jù)2種PAM的特點(diǎn)，在DNA序列上分別截取長(zhǎng)度為20 nt（不含PAM）的靶序列（target），用PAM位點(diǎn)命名，以FASTA格式儲(chǔ)存;PAM在互補(bǔ)鏈上的，還需要按照堿基配對(duì)原則轉(zhuǎn)換堿基并逆序。對(duì)具有同種PAM的靶序列進(jìn)行重復(fù)性搜索，找到單一序列（singleton）和相同序列簇（cluster）;簇中的PAM位點(diǎn)有屬于染色體基因的計(jì)1分，有屬于染色體基因間隔的計(jì)2分，有屬于線粒體基因的計(jì)4分，有屬于線粒體基因間隔的計(jì)8分，4種分值任意組合可將所有簇歸入15個(gè)重復(fù)類（用repeat ?N 命名， N 為不大于15的正整數(shù)）。重點(diǎn)關(guān)注靶序列單一且屬于基因范疇的PAM位點(diǎn)，其數(shù)量與基因長(zhǎng)度的比值表示基因的可編輯度;按照“基因ID-PAM位點(diǎn)-靶序列”的模式建立簡(jiǎn)易信息庫(kù)，找到可編輯度最高和最低的基因。

1.5 程序?qū)崿F(xiàn)

以上操作已被整合到幾個(gè)Perl腳本中，并盡量?jī)?yōu)化算法降低時(shí)間復(fù)雜度和空間復(fù)雜度[22]。其中，為避免耗費(fèi)大量時(shí)間，在判斷PAM位點(diǎn)是否影響基因時(shí)，用數(shù)組模擬DNA序列，數(shù)組索引表示位點(diǎn)，基因區(qū)間內(nèi)的數(shù)組元素由基因ID填充，其他為未定義（undef）值;當(dāng)剪切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的數(shù)組元素為基因ID時(shí)，將PAM位點(diǎn)劃入此基因范疇。為避免占用大量?jī)?nèi)存空間導(dǎo)致程序卡頓，在搜索重復(fù)靶序列時(shí)，把總文件分割成大小合適的幾個(gè)子文件，使用散列快速剔除子文件內(nèi)的相同序列;然后利用每個(gè)子文件中序列唯一的特點(diǎn)，使用散列剔除子文件間的相同序列，最終合并成沒(méi)有重復(fù)序列的總文件。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAM含量分析

蘋果基因組（ASM211411v1）中5′-NGG總量為48 368 223，chr15的數(shù)量最多（4 179 083），chr01的最少（2 291 346），各染色體間差異較大;再結(jié)合序列長(zhǎng)度估算序列的PAM密度，基因組是0.074，chr10最高（0.078），chr06最低（0.069），相差不大（表1）。在基因組中，CGG、GGG、AGG和TGG在NGG總量中的比例分別為11.9%、21.4%、30.4%、36.3%（圖1-A）;在各染色體中的比例與此一致，略有微小波動(dòng)（表1）。線粒體中的5′-NGG含量為 46 468，但密度達(dá)到0.117，高于基因組最高值;CGG、GGG、AGG和TGG的比例分別為19.2%、259%、30.2%、24.7%，與基因組中的同項(xiàng)數(shù)據(jù)也有明顯差異（圖1-B）。

基因組中5′-TTN的總數(shù)為127 635 154，同樣是chr15最多（11 092 974），chr01最少（5 902 134）;估算基因組的密度是0.194，依然是chr10最高（0206），chr06最低（0.180），兩者比較接近（表2）。在基因組中，TTC、TTA、TTG和TTT在TTN總量中的比例分別為19.6%、21.2%、22.2%、37.0%（圖1-C）;同樣，在各染色體中的比例與此一致（表2）。線粒體中5′-TTN含量為69 296，密度只有0.174 6，低于基因組最低值;TTC、TTA、TTG和TTT的比例分別為28.4%、18.7%、20.7%、32.2%，與基因組中的同項(xiàng)數(shù)據(jù)也差異明顯（圖1-D）。

作為對(duì)比，另一基因組數(shù)據(jù)（ASM411538v1）的5′-NGG密度為0.084，CGG、GGG、AGG和TGG的比例分別為11.7%、21.5%、30.6%、36.3%;5′-TTN的密度為0.219，TTC、TTA、TTG和TTT的比例分別是19.6%、21.2%、22.4%、36.8%。使用2個(gè)不同版本的基因組數(shù)據(jù)計(jì)算出的結(jié)果很接近，特別是NGG和 TTN的構(gòu)成比例幾乎完全一致，可以用同一組餅狀圖表示（圖1-A、圖1-C）。

2.2 PAM出現(xiàn)頻率

在蘋果基因組（ASM211411v1）中，相鄰5′-NGG的間距最小為1 bp，出現(xiàn)次數(shù)最多（圖2-A）;最大為1 347 bp，出現(xiàn)在chr07的19 065 740～19 067 087位點(diǎn)間（表1）。間距中值是7 bp，表示平均約間隔7 bp堿基就有1個(gè)5′-NGG，也說(shuō)明半數(shù)以上的間距不大于7 bp;間距均值為12.0 bp，是受到最大值的影響而產(chǎn)生了偏移（圖2-a）。各染色體情況與此高度一致（表1）。而在線粒體中，間距中值和均值分別為5、8.5 bp，與基因組完全不同（圖2-b）。

基因組中，相鄰5′-TTN的間距最小為1 bp，出現(xiàn)次數(shù)最多（圖2-c）;最大為1 022 bp，出現(xiàn)在chr07的26 831 153～26 832 175位點(diǎn)間（表2）。間距中值是3 bp，表示平均約間隔3 bp堿基就有1個(gè) 5′-TTN，也說(shuō)明半數(shù)以上的間距不大于3 bp;受最大值影響，間距均值是4.5 bp（圖2-c）。同樣，各染色體情況與此一致（表2）。線粒體的間距中值和均值分別為4、5.7 bp，也與基因組完全不同（圖2-d）。使用另一版本的基因組數(shù)據(jù)（ASM411538v1）計(jì)算，可得出類似的結(jié)果：5′-NGG的間距中值和均值分別為7、11.9 bp，5′-TTN的間距中值和均值分別為3、4.5 bp;所展示出的變化趨勢(shì)也可以繪成同樣的圖像（圖2-a、圖2-c）。

2.3 PAM的基因歸屬

在蘋果基因組中，29.0%的5′-NGG和26.9%的5′-TTN能影響到基因，基本覆蓋了全部43 464個(gè)基因（表3）。其中，chr06上ID為114825448的基因含5′-NGG最多，有14 620個(gè);chr16的114822391（表示基因ID，下同）和chr09的114827208基因不含5′-NGG。chr06的114825448基因含5′-TTN最多，有36 069個(gè);chr16的108169786、chr12的108174957、chr11的108174696、chr02的114823832、chr03的114824289和108171505基因都不含5′-TTN。

在線粒體中，15.6%的5′-NGG能作用于全部70個(gè)基因，13.5%的5′-TTN覆蓋了98.6%的基因（表3）。其中，ID為13630194的基因含5′-NGG最多，有1 186個(gè);13630239（121 892～121 913位點(diǎn)）和13630229基因含5′-NGG最少，只有5個(gè)。13630194基因含5′-TTN最多，有1 337個(gè);13630239基因（121 892～121 913位點(diǎn)）不含5′-TTN。與各染色體相比，線粒體中屬于基因間隔的PAM占比明顯更大（表3）。

2.4 靶序列的重復(fù)簇

蘋果的CRISPR靶序列有大量重復(fù)，共計(jì)15種重復(fù)簇（表4）。其中，重復(fù)序列只屬于染色體基因的簇劃入repeat1，只屬于染色體基因間隔的為repeat2，只屬于線粒體基因的為repeat4，只屬于線粒體基因間隔的為repeat8，repeat15是重復(fù)的靶序列同時(shí)出現(xiàn)在上述4個(gè)區(qū)域中。可以發(fā)現(xiàn)，帶有 5′-NGG 的靶序列，染色體基因的648條與線粒體基因中的620條重復(fù);帶有5′-TTN的靶序列，染色體基因中的1 038條與線粒體基因中的966條重復(fù)（表4，repeat5、7、13、15）。只屬于染色體基因的，帶有5′-NGG的重復(fù)靶序列共有3 883 583條，帶有5′-TTN的重復(fù)靶序列共有84 71 496條（表4，repeat1、3、5、9、7、11、13、15括號(hào)中的數(shù)字）;而在線粒體基因中，這2個(gè)數(shù)值分別為980、1 087（表4，repeat4、5、6、12、7、13、14、15括號(hào)中的數(shù)字）。

2.5 基因可編輯度

在蘋果各染色體中，帶有5′-NGG的單一靶序列數(shù)量為26 778 571，其中屬于基因的有9 436 659，其余都處于基因間隔中;帶有5′-TTN的單一靶序列數(shù)量為73 337 956，屬于基因的有240 838 78（表4）。SpCas9對(duì)chr04上的103432805基因有最高的可編輯度，為0.226，含有PAM最多的114825448基因的可編輯度僅為0.020（圖3）;另有372個(gè)基因的可編輯度為0。FnCpf1對(duì)chr08上的114826681基因有最高的可編輯度，為0.344，含有PAM最多的114825448基因的可編輯度僅為0.049（圖3）;另有305個(gè)基因的可編輯度為0。

在線粒體中，帶有5′-NGG的單一靶序列數(shù)量為34 535，屬于基因的有4 344;帶有5′-TTN的單一靶序列數(shù)量為49 191，屬于基因的有5 220（表4）。SpCas9對(duì)13630239基因（121892～121913位點(diǎn)）可能有最高的可編輯度，為0.227，含有PAM最多的13630194基因的可編輯度為0.092（圖3）;有4個(gè)基因的可編輯度為0。FnCpf1對(duì)13630216基因可能有最高的可編輯度，為0.224，含有PAM最多的13630194基因的可編輯度為0.095（圖3）;有6個(gè)基因的可編輯度為0。

2.6 Cas蛋白的編輯互補(bǔ)

蘋果中的大多數(shù)基因可同時(shí)被2種Cas蛋白編輯， 分別具有不同的可編輯度搭配（圖3）。 可編輯度為0的基因在全部基因中的占比較小，在各DNA序列上均有分布;其中，chr04上的數(shù)量最多，有66個(gè)不能被SpCas9編輯、有62個(gè)基因不能被FnCpf1編輯（圖4）。經(jīng)過(guò)篩選，共有237個(gè)（0.5%）染色體基因、2個(gè)（2.9%）線粒體基因能被1種Cas蛋白編輯，填補(bǔ)了另一種Cas蛋白留下的編輯空白（圖4，part Ⅰ、part Ⅲ）;共有220個(gè)染色體基因（0.5%）、4個(gè)（5.7%）線粒體基因不能被任一種Cas蛋白編輯，即2種Cas蛋白同時(shí)留下編輯空白，沒(méi)有互補(bǔ)（圖4，part Ⅱ）。

3 討論

作為重要的基因編輯工具[23]，CRISPR-Cas系統(tǒng)在蘋果基因組中有較好的整體適用性，主要表現(xiàn)在3個(gè)方面。一是有數(shù)量可觀的PAM分散在蘋果DNA序列的各個(gè)角落，出現(xiàn)頻率很高，平均間隔很短。二是Cas蛋白的作用位點(diǎn)幾乎覆蓋了所有基因，個(gè)別不能被SpCas9識(shí)別的基因卻含有FnCpf1的識(shí)別位點(diǎn)，反之亦然。三是擁有單一靶序列的基因占大多數(shù)，99.5%的染色體基因和94.3%的線粒體基因都能至少被其中1種Cas蛋白編輯。蘋果DNA序列的測(cè)序結(jié)果表明，AT堿基的含量高于CG堿基[20-21]，導(dǎo)致5′-TTN的數(shù)量遠(yuǎn)超5′-NGG、5′-TTN 的出現(xiàn)頻率更高、帶有5′-TTN的單一靶序列數(shù)量更多，也就是說(shuō)Cpf1在蘋果基因編輯中有更大的可挖掘潛力。

各染色體的PAM密度、組成和出現(xiàn)頻率幾乎一致，可視作蘋果基因組的整體特征之一。雖然也存在于蘋果細(xì)胞中，但線粒體通常被認(rèn)為是有益的共生生物[24]，其DNA不被計(jì)入基因組;這一點(diǎn)在本研究中也有突出體現(xiàn)，即與染色體的同項(xiàng)數(shù)據(jù)相比，線粒體都有明顯差異。目前，對(duì)蘋果線粒體基因的編輯還未見(jiàn)報(bào)道，其操作過(guò)程是否與基因組相同還需要更深入的研究驗(yàn)證，在本研究中僅是預(yù)測(cè)性的初步探討;且線粒體DNA體量小、基因少[20]，對(duì)基因組編輯的影響不大，在特定環(huán)境中可不做考慮。葉綠體也有類似情況[25]，可在條件成熟時(shí)進(jìn)一步研究討論。

已有的測(cè)序結(jié)果含有未知堿基，在數(shù)億堿基的蘋果DNA序列中比例微小，對(duì)多項(xiàng)計(jì)算結(jié)果的影響可忽略不計(jì)[20-21]。但如果2個(gè)PAM之間存在未知堿基且結(jié)合上下游無(wú)法判斷是否存在另一個(gè)PAM，就在確定PAM頻率時(shí)摒棄這2個(gè)PAM的間距，避免出現(xiàn)超長(zhǎng)間距的同時(shí)，也保證了是在計(jì)算相鄰2個(gè)PAM的間距。對(duì)比人類基因組取間距中值作為PAM的出現(xiàn)頻率，本研究也采用了同樣的取值方法;蘋果基因組平均間隔7 bp堿基就有1個(gè)5′-NGG，頻率高于人類基因組的8 bp[10]。

一般，判斷PAM是否屬于基因依據(jù)的是其位點(diǎn)是否在基因起止位點(diǎn)間，臨近基因邊緣的PAM就有可能實(shí)際作用到了間隔區(qū)。不同于此，本研究將判斷依據(jù)改進(jìn)為剪切位點(diǎn)是否在基因起止位點(diǎn)間，既避免了上述問(wèn)題，也充分挖掘了隱藏的基因PAM。在此基礎(chǔ)上截取的靶序列都具有明確的基因歸屬。靶序列的長(zhǎng)度按常規(guī)被設(shè)定為20 nt，初步分析了因序列重復(fù)導(dǎo)致的脫靶情況;根據(jù)序列越短重復(fù)率越高的共識(shí)，可適當(dāng)增加靶序列的長(zhǎng)度提高基因的可編輯度。此外，脫靶的原因還包括相似匹配和種子序列的長(zhǎng)度[11]，可在未來(lái)的研究中做更深入的分析。

基因可編輯度與單一靶序列的數(shù)量成正比，與基因自身的長(zhǎng)度成反比，表示的是單位長(zhǎng)度內(nèi)含有的備選靶序列密度。可編輯度為0的基因，小部分是因?yàn)椴缓蠵AM，大多數(shù)是在屏蔽了重復(fù)靶序列后，備選數(shù)量為0。本研究采用了較嚴(yán)格的屏蔽標(biāo)準(zhǔn)，凡是在蘋果DNA序列中出現(xiàn)的重復(fù)靶序列均計(jì)入重復(fù)簇;重復(fù)簇的類別劃分較細(xì)，15個(gè)類別涵蓋了靶序列所在4個(gè)區(qū)域的所有搭配，方便在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)有側(cè)重地取舍。在蘋果全部基因中，2種Cas蛋白都有占比很小的編輯盲區(qū)，F(xiàn)nCpf1要好于SpCas9。盲區(qū)重疊的部分所含的224個(gè)基因不適宜使用這2種Cas蛋白編輯，可考慮換用識(shí)別不同PAM的其他Cas蛋白;其中超過(guò)半數(shù)的基因（139個(gè)）編碼多種RNA，通常在實(shí)際研究中較少涉及到。

在Perl腳本的幫助下，各步驟的運(yùn)算結(jié)果都在文本文件中詳細(xì)列表構(gòu)成了信息庫(kù)，可直接打開(kāi)查詢感興趣的信息;也可導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)加以專業(yè)化的管理和維護(hù)，成為網(wǎng)絡(luò)服務(wù)平臺(tái)的構(gòu)建基礎(chǔ)，這是開(kāi)展下一步研究的一個(gè)重要方向。

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