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    青藏高原東部22株栽培與野生羊肚菌的分子進(jìn)化分析

    2022-05-09 02:37:18杜軍華姜東伯張津京余建平宋長(zhǎng)新劉甜陳輝陳群吳曉明
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:羊肚菌遺傳多樣性青藏高原

    杜軍華 姜東伯 張津京 余建平 宋長(zhǎng)新 劉甜 陳輝 陳群 吳曉明

    摘要:為了更好地區(qū)分不同羊肚菌菌株,確定其生物多樣性,對(duì)10個(gè)栽培羊肚菌和12個(gè)野生羊肚菌進(jìn)行分析。通過對(duì)5個(gè)基因區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序,借助數(shù)據(jù)庫檢索、多序列比對(duì)和分子進(jìn)化等方法進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)10種栽培樣本屬于3種已知物種:六妹羊肚菌( Morchella sextelata )、梯棱羊肚菌( M. importuna )、七妹羊肚菌( M. septimelata )。同GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中已測(cè)序樣本相比,這些樣本都含有一定程度的序列差異,體現(xiàn)在栽培的樣本也具有遺傳多樣性。12個(gè)野生型樣本同六妹羊肚菌、小海綿羊肚菌( M. spongiola )、 Morchella prava 物種更接近,并顯示出較大的序列差異,其中1株同所有已知羊肚菌品種均有較大的遺傳差異??紤]到這些野生羊肚菌的生長(zhǎng)地域同其他羊肚菌生長(zhǎng)地域的差異,推斷由于獨(dú)特的地理環(huán)境,使野生羊肚菌演化出了特有的基因序列。本研究獲得了青海一些地區(qū)羊肚菌的分類、分子演化和多樣性特征,有助于鑒定、選育適合栽培的羊肚菌菌株。

    關(guān)鍵詞:子囊菌類;羊肚菌;分子進(jìn)化;多序列比對(duì);青藏高原;遺傳多樣性

    中圖分類號(hào): S646.702? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2022)07-0028-07

    收稿日期:2021-06-15

    基金項(xiàng)目:青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究(編號(hào):2018-ZG-790)。

    作者簡(jiǎn)介:杜軍華(1965—),男,河北故城人,副教授,主要從事生物技術(shù)及應(yīng)用研究。E-mail:djh319@126.com。

    通信作者:杜軍華,副教授,主要從事生物技術(shù)及應(yīng)用研究,E-mail:djh319@126.com;吳曉明,博士,副教授,主要從事生物信息研究,E-mail:wxm@mail.xjtu.edu.cn。

    羊肚菌是公認(rèn)的最重要的野生食用、藥用真菌之一,分布于世界各地,特別是在北溫帶地區(qū)[1-2]。其口感脆嫩,風(fēng)味獨(dú)特,富含維生素、人體必需氨基酸和特殊的多糖成分,具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[3-5]。目前我國已報(bào)道的羊肚菌種類較多,其中常見的有圓錐羊肚菌( Morchella conica)、小頂羊肚菌(M. angusticeps)、羊肚菌(M. esculenta)、褐色羊肚菌(M. umbrina ) 等[6]。近年來,人們對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性和物種多樣性研究取得了重大進(jìn)展,一些羊肚菌品種也已被廣泛栽培,顯示出良好的經(jīng)濟(jì)效益[7]。

    目前,僅有13種羊肚菌品系完成全基因組測(cè)序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/organism/5193/),而已知羊肚菌屬(NCBI數(shù)據(jù)庫taxid編號(hào):5193)包含多達(dá)30個(gè)物種,每個(gè)物種都有不同的菌株。目前Index Fungorum數(shù)據(jù)庫(http://www.indexfungorum.org/Names/Names.asp) 也收錄了多達(dá)353種羊肚菌(截至2021年12月)。許多菌株在形態(tài)上相似,難以區(qū)分,利用基因序列準(zhǔn)確鑒定羊肚菌的種類和菌株尤為重要。

    羊肚菌屬的分類研究已有多年,其子囊體的外觀常隨環(huán)境、氣候等外界條件的變化而變化,在形狀和大小上具有高度的多態(tài)性。雖然子實(shí)體的微觀結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,但從屬類群的定義非常困難,菌株之間的定義也不明確,影響了該類群資源的合理利用和開發(fā)[8-9]。對(duì)于分類學(xué)家和野外真菌學(xué)家來說,羊肚菌屬于一個(gè)非常復(fù)雜的屬。由于形態(tài)差異不明顯,同一種類的羊肚菌由于生存環(huán)境和營養(yǎng)條件的差異往往表現(xiàn)出形態(tài)多樣性,根據(jù)外觀和形態(tài)對(duì)羊肚菌進(jìn)行分類往往存在一定偏差。

    基于多基因位點(diǎn)進(jìn)行分析已經(jīng)成為推斷羊肚菌物種的新方法。使用ITS-RPB1-RPB2-EF1-α組合數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因分析,人們已經(jīng)將羊肚菌分為黑羊肚菌分支( Elata clade )、黃羊肚菌分支( Esculenta clade )、變紅羊肚菌分支( Rufobrunnea clade )[10-11]。拉丁二項(xiàng)命名法也已用于羊肚菌命名,即用 Mes(E. clade)或Mel(E. clade) 跟上一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字表示,自2012年以來也被廣泛使用。迄今為止,已經(jīng)利用系統(tǒng)發(fā)生分析的方法,確定了68個(gè)羊肚菌品種的關(guān)系,包括38個(gè)屬于黑羊肚菌、28個(gè)屬于黃羊肚菌、2個(gè)變紅羊肚菌[3,12-13]?;谶@些已知物種的命名,有助于準(zhǔn)確地進(jìn)行其他羊肚菌品種的鑒定。

    在青海地區(qū)高緯度和寒冷的氣候條件下,動(dòng)植物已經(jīng)進(jìn)化出了獨(dú)特的生長(zhǎng)模式。該地區(qū)的土壤特性和生態(tài)系統(tǒng),也成為野生羊肚菌的良好生長(zhǎng)環(huán)境。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,適合栽培的羊肚菌新品種也需要不斷被篩選出來,以促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。為了更好地了解青海地區(qū)羊肚菌的菌株類型、分布特點(diǎn)、分子標(biāo)記和進(jìn)化特征,筆者對(duì)22個(gè)樣本進(jìn)行分類相關(guān)基因的測(cè)序,通過序列比較的方法,以確定菌株特點(diǎn)及其遺傳特征。

    1 材料與方法

    1.1 樣品收集

    本研究于2020年5月,在大巴山東部地區(qū)北山農(nóng)場(chǎng)共收集了107個(gè)樣本。經(jīng)過基于形態(tài)的初步篩選,選取其中有代表性的12個(gè)野生菌株,繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行分子水平的分析和鑒定。同時(shí),筆者也從青海省西寧市周圍的羊肚菌栽培基地,選取了10個(gè)栽培品種,進(jìn)行菌株的亞種鑒定。樣本信息見表1、表2。

    1.2 DNA測(cè)序區(qū)域的選擇

    為對(duì)10個(gè)栽培品種和12個(gè)野生品種進(jìn)行進(jìn)化分析和分子鑒定,本研究對(duì)5個(gè)突變率較高的基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行了測(cè)序。這些區(qū)域是rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its1~its4 (ITS)、編碼RNA聚合酶Ⅱ的最大亞基(RPB1)、編碼RNA聚合酶Ⅱ的第二大亞基(RPB2)、翻譯延伸因子 (EF1-α)、核糖體大亞基(LSU)。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行DNA提取分離后,將凝膠中的DNA樣品切割純化,回收目的片段,用相應(yīng)的引物和合適的條件進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增(表3、表4),擴(kuò)增程序根據(jù)引物退火與片段大小做適當(dāng)調(diào)整,擴(kuò)增后的分子進(jìn)行測(cè)序,最終共獲得122條序列。

    1.3 生物信息學(xué)分析

    為了獲取樣本測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的相似序列,本研究利用基于局部比對(duì)算法的搜索工具(BLAST)進(jìn)行同源序列檢索,利用MUSCLE多序列比對(duì)程序確定各條序列的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系,利用MEGA等軟件分析樣品序列的親緣關(guān)系。

    1.3.1 數(shù)據(jù)庫同源序列獲取

    為了檢測(cè)已測(cè)序片段與已知序列的相似性,并確定其同源序列,使用序列相似性搜索程序BLASTN[14],設(shè)置查詢參數(shù),從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取同源序列。對(duì)搜索結(jié)果中同一樣本的不同片段進(jìn)行合并以剔除重復(fù)結(jié)果,只保留物種屬于羊肚菌屬的序列進(jìn)行進(jìn)化分析。對(duì)于 ITS 基因,從SD樣本和DM樣本共檢索到422個(gè)不同物種的序列。另外3個(gè)基因RPB1、RPB2、EF1-α檢索到的同源序列分別為142、156、127條。

    1.3.2 基于索引號(hào)的羊肚菌測(cè)序序列獲取

    一些研究人員從事羊肚菌相關(guān)研究,其樣本的測(cè)序序列也已被上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫[4,15-18],總共獲得162個(gè)序列ID。筆者使用shell腳本編程,并借助查詢工具E-utilities (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/tools/)下載相關(guān)的序列,過濾后,共得到110個(gè)樣本,包含所有4個(gè)基因序列。

    1.3.3 多序列比對(duì)

    使用MUSCLE[19]來進(jìn)行多序列比對(duì);使用BioEdit 7.2.6進(jìn)行序列編輯操作;使用Gblock(http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/)進(jìn)行位點(diǎn)選擇[3]。

    1.3.4 序列替代模型選擇

    用IQ-tree中的ModelFinder[20]來找到最佳核苷酸替換模型。該模型基于Bayesian信息準(zhǔn)則(BIC)進(jìn)行模型參數(shù)的篩選。ITS-rpb1-rpb2-ef1α的最佳DNA替換模型為K2P+G4,表示堿基的轉(zhuǎn)換、顛換有不同的頻率。進(jìn)化樹的構(gòu)建和可視化采用MEGA軟件[21]。

    1.3.5 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

    采用基于Tamura-Nei模型[22]的最大似然方法進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析。算法根據(jù)一個(gè)初始樹進(jìn)行啟發(fā)式搜索,保留似然性較好的系統(tǒng)發(fā)生樹作為最終結(jié)果。根據(jù)每個(gè)位置的替換次數(shù)得到樹中的分支長(zhǎng)度,并用1 000次bootstrap重復(fù)估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生樹中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的一致性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基于RPB1基因的羊肚菌親緣關(guān)系

    對(duì)22個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序,成功獲得ITS、RPB1、RPB2、EF1-α、LSU序列。對(duì)低質(zhì)量測(cè)序結(jié)果過濾后,共得到122個(gè)片段,總長(zhǎng)度為76 kb。

    RPB1基因在每個(gè)樣品中都被成功測(cè)序,用它查詢NCBI數(shù)據(jù)庫,得到多個(gè)羊肚菌屬的同源序列。經(jīng)過篩選,并對(duì)于每個(gè)羊肚菌品系保留1~2條序列,然后用MUSCLE程序構(gòu)建多序列比對(duì)。利用MEGA和最大似然法進(jìn)行進(jìn)化分析,最終得到了1棵包含22個(gè)樣本和111個(gè)已知物種或菌株同源序列的羊肚菌系統(tǒng)發(fā)生樹。初步確定了樣品與已知羊肚菌品種之間的進(jìn)化關(guān)系,并使用FigTree 1.4.4 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)來顯示進(jìn)化樹,體現(xiàn)品種之間的類別關(guān)系(圖1)。

    如圖1所示,在區(qū)域1中可以發(fā)現(xiàn)樣本DMBJD039、DMBXY044和DMBXY049具有非常高的同源性關(guān)系,與sp._Mel-29和sp._Mel-28非常接近。從形態(tài)上,這3個(gè)品種區(qū)分為尖頂羊肚菌和小羊肚菌。

    在區(qū)域2中,含有DMBBY003、DMBHH076、DMBHM034的分支被鑒定為六妹羊肚菌。栽培株SDQYXZ001(圖2)、SDQYNS006、SDQYMK009、SDQYDB005和SDQYBS010也存在于該分支。這些栽培株來自西藏林芝、湖北恩施、青海班瑪、甘肅迭部、青?;ブ鹊?,表明此品種羊肚菌具有較高的適應(yīng)性。

    在區(qū)域3中,栽培菌株SDQYSC004和SDQYTL008分別來自四川金堂和青海西寧。它在進(jìn)化上與同七妹羊肚菌相似,具有較高的同源性。

    在區(qū)域4中,3個(gè)栽培株SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002和2個(gè)野生菌株DMBHH052、DMBHM088與梯棱羊肚菌具有較高的同源性。SDQYLM007、SDQYTS003、SDQYZX002分別來自青海西寧、甘肅天水、甘肅卓尼。這表明梯棱羊肚菌也適宜在2 000 m的高海拔地區(qū)栽培。

    區(qū)域5中,DMBBY014、DMBMM064、DMBCB101和DMBMM005與sp._Mes-5和sp._Mes-6最接近,但分支較長(zhǎng),表現(xiàn)出種間的差異。從形態(tài)上,4個(gè)品種有所區(qū)別,被認(rèn)為是半圓羊肚菌、羊肚菌、粗柄羊肚菌等,因此,有必要進(jìn)一步確定其種類信息。

    由于RPB1基因在多數(shù)樣本中具有較高同源性,一些樣本不能很好地區(qū)分,需借助更多基因序列進(jìn)行鑒定。

    2.2 基于多基因序列組合的樣本親緣關(guān)系分析

    本研究對(duì)SD樣本(表1)和DM樣本(表2)均進(jìn)行多基因測(cè)序,以此進(jìn)行多基因綜合分析。對(duì)所有樣本先進(jìn)行多序列比對(duì)(multiple sequence alignment,簡(jiǎn)稱MSA),再將單個(gè)基因MSA結(jié)果合并成多基因MSA結(jié)果,以確定樣本之間的關(guān)系。

    10個(gè)SD樣本擴(kuò)增出RPB1和 EF1-α 基因,并獲得了測(cè)序結(jié)果。因此,筆者構(gòu)建了包含這2個(gè)基因的MSA,并選擇Tamura-Nei模型作為DNA替代模型構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果如圖3所示。

    單基因分析提供的分辨率不高,很難區(qū)分物種之間的詳細(xì)差異,而通過雙基因進(jìn)化分析,可以清楚地看到樣本之間存在差異。在圖3中,這棵樹可以分為3個(gè)分支,分別屬于3個(gè)不同的物種。各分枝間樣品間也存在一定的進(jìn)化距離,說明在青海成功培植的羊肚菌種也有種間差異。

    對(duì)于野生型DM樣本,所有樣本中成功測(cè)序的基因有3個(gè),分別是RPB1、RPB2、LSU。利用這些基因的MSA構(gòu)建進(jìn)化樹,如圖4所示。

    12個(gè)DM樣品在形態(tài)上有很大差異,說明它們屬于不同的物種。從進(jìn)化樹中可以看到4個(gè)分支,每個(gè)分支與其他分支之間的距離都很大,所以筆者認(rèn)為其中有超過4個(gè)不同的物種。特別是,樣本DMBMM064有一個(gè)更長(zhǎng)的分支,這意味著該樣本與其他樣本差異更大。

    2.3 基于多基因數(shù)據(jù)庫搜索的樣本品系推測(cè)

    通過在數(shù)據(jù)庫中搜索單個(gè)基因序列來識(shí)別物種,將會(huì)由于序列相似性而檢索出多個(gè)不同結(jié)果,這給確定樣本的種類帶來了巨大困難。因此,本研究結(jié)合了各樣本中多個(gè)基因的序列相似性搜索結(jié)果以及形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了樣本推斷。使用BLAST來進(jìn)行同源序列搜索,在查詢參數(shù)中,設(shè)置物種限定為羊肚菌屬( Morchella ),然后提取每個(gè)查詢結(jié)果的物種信息,并根據(jù)每個(gè)樣本的多基因搜索結(jié)果確定羊肚菌品種,獲得最接近的物種(表5、表6)。

    2.4 同已文獻(xiàn)報(bào)道羊肚菌品系的關(guān)系

    為了研究青海羊肚菌與其它報(bào)道品種之間的關(guān)系,從文獻(xiàn)檢索到序列的索引號(hào),并從GenBank提取了162個(gè)樣本的基因序列。在本研究的樣本中,有20個(gè)包含同文獻(xiàn)匹配的4個(gè)基因序列區(qū)域。經(jīng)過序列比對(duì)和分子進(jìn)化分析,得到進(jìn)化樹(圖5)。

    可以看出,本研究的樣品與報(bào)道的羊肚菌的遺傳距離較大。這也說明青海互助縣北山野生羊肚菌具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化系統(tǒng),且存在種群隔離的趨勢(shì)。DM樣品是野外采集的野生樣品,可以看出DM樣品之間的差異大于SD樣品。

    2.5 典型的序列差異

    為了識(shí)別樣本序列和現(xiàn)有已知羊肚菌品種的序列差異,筆者進(jìn)行了序列比較。對(duì)于RPB1基因,合并了133個(gè)羊肚菌同源序列,它們是SD樣本、DM樣本和從數(shù)據(jù)庫檢索得到的同源序列。MSA比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),DMBMM064與其他序列有相對(duì)較大的遺傳差異。將此序列與最接近的樣本序列JQ322139.1進(jìn)行了比較,獲得點(diǎn)陣圖分析結(jié)果如圖6所示,紅圈中的線是不連續(xù)的,這意味2個(gè)樣本中的RPB1基因序列不同,表明2個(gè)樣本有很大的進(jìn)化距離。

    如圖7所示,該樣本序列同數(shù)據(jù)庫序列的比對(duì)結(jié)果,是匹配度最高的結(jié)果,尚且存在一些差異,顯示出本樣本獨(dú)特,其功能和特征還需進(jìn)一步的探索。

    3.6 形態(tài)和地理分布

    本研究發(fā)現(xiàn),青海野生羊肚菌有較高的序列多樣性,與其他已知的羊肚菌品種相比,包含DMBBY014、DMBMM064和DMBMM005的分支,有更高的序列差異和較長(zhǎng)的進(jìn)化距離,可能包含新的品系和菌株,較高的品系多樣性,為羊肚菌的栽培和推廣提供較好的遺傳資源。

    3 討論與結(jié)論

    在本研究收集了22個(gè)羊肚菌樣本,并為每個(gè)樣本進(jìn)行了5個(gè)基因區(qū)域的測(cè)序。根據(jù)樣本的測(cè)序結(jié)果,結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的同源序列,并進(jìn)行進(jìn)化分析,探索它們之間的差異。結(jié)果表明,栽培樣本包括3個(gè)主要品種,分別是六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌,這些品種均屬于黑色羊肚菌支系,是我國食用菌栽培行業(yè)發(fā)展迅速的一類真菌,具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值[23]。栽培樣本的DNA序列同數(shù)據(jù)庫已有條目相比,存在一定程度的序列變異,表明具有一定序列變異的品種,已能夠很好地適應(yīng)當(dāng)?shù)胤N植環(huán)境,某些位點(diǎn)的變化不會(huì)影響羊肚菌生長(zhǎng)的適應(yīng)性。

    對(duì)于野生羊肚菌樣本,它們同已知的物種有更高的序列位點(diǎn)差異,在野生品種之間也有較大的遺傳距離,這表明它可能含有新的羊肚菌菌株或新的羊肚菌品種。與此同時(shí),這些野生樣本收集自較小范圍的特定地理區(qū)域,該區(qū)域同其他羊肚菌的生長(zhǎng)區(qū)域相隔很遠(yuǎn),這也體現(xiàn)出特定的環(huán)境有助于進(jìn)化出這些新的羊肚菌菌株。

    序列比較也發(fā)現(xiàn)了樣本序列和數(shù)據(jù)庫條目之間的一些差異。例如,DMBMM064與所有已知物種的遺傳距離相對(duì)較大,這表明它經(jīng)歷了較長(zhǎng)的分化時(shí)期,可能是新的羊肚菌品種。多方面的全面分析將非常有必要。全基因組測(cè)序和基因功能研究將有助于發(fā)現(xiàn)新品種及其功能特征,這對(duì)培養(yǎng)野生的新菌株也非常重要。

    本研究初步鑒定了22個(gè)適合在中國北方生長(zhǎng)的羊肚菌樣本,擴(kuò)大了筆者對(duì)羊肚菌屬的多樣性和分布特點(diǎn)的了解,這對(duì)于選育和栽培羊肚菌新品種,獲得經(jīng)濟(jì)效益,更深入、全面的分子水平分析將非常有幫助。

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