好的 氧化石墨烯液體創(chuàng)可貼對創(chuàng)面愈合的研究

韋曉?龔獲權(quán)?馮玉燕?吉忻

摘要：利用低濃度氧化石墨烯（GO）作為以PVA-124為成膜基質(zhì)的新型液體創(chuàng)可貼的抑菌成分，測試最佳抑菌濃度以及對大鼠創(chuàng)面愈合VEGF表達(dá)及創(chuàng)面愈合的影響。研究表明GO含量為120 mg/mL抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌效果較佳。各組不同時間創(chuàng)面愈合率均無明顯差異（P>0.05），各組不同時間之間VEGF陽性占比比較無顯著差異P>0.05，氧化石墨烯對于創(chuàng)面愈合作用影響不大，對于創(chuàng)面VEGF表達(dá)沒有影響。

關(guān)鍵詞：氧化石墨烯;VEGF;液體創(chuàng)可貼

【中圖分類號】 R943 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）08--03

Abstract：Low-concentration graphene oxide （GO） was used as the antibacterial component of a new type of liquid band-aid with PVA-124 as film-forming matrix.Test optimal bacteriostatic concentrations and effects on VEGF expression and wound healing in rats.The results showed that the GO content of 120 mg/mL had a better effect on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa.Graphene oxide has little effect on wound healing and no effect on VEGF expression in wound.

前言：

涂膜劑是一種涂抹于創(chuàng)面或患處后形成一層保護(hù)膜的外用液體制劑，基本原理是將藥物溶解或分散在含有成膜材料的溶劑中，液體創(chuàng)可貼是涂膜劑的一種，其主要是用于皮膚表面創(chuàng)傷，涂抹于創(chuàng)傷皮膚表面能快速形成完整而無氣泡、防水、防滲且具有一定的柔韌性和透氣性的保護(hù)薄膜，其能保護(hù)創(chuàng)面免受細(xì)菌的感染、異物入侵、避免與衣物的再擦傷等功能，雖然目前已經(jīng)有大量用于皮膚創(chuàng)面的涂膜劑上市，相較于傳統(tǒng)的敷料定的優(yōu)勢，但對于傷口感染防治效果欠佳，不利于傷口愈合。PVA[1] [2]是涂膜劑中常用的成膜材料，是唯一能夠被微生物降解的高分子材料，具有較佳的生物相容性。

氧化石墨烯是石墨烯的衍生物之一，結(jié)構(gòu)與石墨烯基本相同，在單層碳原子結(jié)構(gòu)的基面上含有豐富的含氧基團(tuán)[3]。豐富含氧官能團(tuán)的引入使得原來石墨烯所擁有的非常獨(dú)特優(yōu)異的光、電、磁、等物理和化學(xué)性質(zhì)大大降低，但增強(qiáng)了氧化石墨烯的反應(yīng)活性和親水性，因此為其自身帶來了廣泛的應(yīng)用前景。2010年中黃慶林[3]課題組首次提出氧化石墨烯抑菌作用，其抗菌原理仍未明確，Liwei Hui[4]提出鹽水中氧化石墨烯為200 μg/ mL時產(chǎn)生<1%的細(xì)菌存活率，從眾多報(bào)道中其可能存在的抗菌原理可簡單總結(jié)為物理破壞理論、氧化應(yīng)激理論、磷脂分子抽提破壞理論三個方面[5]，基于GO良好的生物相容性，有研究表明高濃度氧化石墨烯會對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生毒性，具有顯著遺傳毒性特性并導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA損傷[6-10]，VEGF（血管生長內(nèi)皮生長因子）在創(chuàng)面愈合早期能促進(jìn)創(chuàng)面新生血管的形成為創(chuàng)面愈合提供營養(yǎng)物質(zhì)[11-13]。

1儀器與試劑

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

XSR205DU型分析天平（Mettler-Toledo Gmbh）、TSJ-Ⅱ型脫水機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）、BMJ-Ⅲ型包埋（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）、RM2016型切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）、BA410型顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、BMJ-A型冷凍臺（常州市中盛電子儀器有限公司）、PHY-Ⅲ型漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公）、DHG-9148A型干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、A80400011型修復(fù)儀（Thermo Shandon Limited ）、HY-5型脫色搖床（上海程捷儀器設(shè)備有限公司）、XK80-A型漩渦混勻儀（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、S1010E型掌上離心機(jī)（美國SCLOGEX）、超凈工作臺（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SW-CJ-2F）、恒溫培養(yǎng)箱（天呈TS-100B）、YE3K176096型20-200 μl移液槍（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司，）HWS-28型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、

1.2試劑：

氧化石墨烯（蘇州碳豐科技）、PVA124（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190703）、無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190605）、甘油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20130105）、LB瓊脂培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司，批號：20200802）、80%苯扎氯銨（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10238825）、4%多聚甲醛通用型組織固定液（biosharp，批號：69120900）、氯化鈉注射液（貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號：D21010705），CMCC（B）10104銅綠假單胞菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、CMCC（B）26003金黃色葡萄球菌均購自上海魯微科技有限公司、9cm細(xì)菌培養(yǎng)皿（biosharp BS-90D，批號：200518）

1.3實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物SPF級SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（桂）2019-0001。實(shí)驗(yàn)大鼠于SPF級動物實(shí)驗(yàn)房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境12 h明暗交替，溫度（22 ± 2）℃，相對濕度（50 ± 10）%

2、方法

2.1氧化石墨烯（GO）液體創(chuàng)可貼制備工藝

按處方量用分析天平稱取PVA124并用10倍量的水溶脹2 h后，90℃水浴邊攪拌邊加熱使其完全溶解后靜止放冷后，按處方量加入甘油、苯扎氯銨（含量為0.017%）、和無水乙醇攪拌均勻后再加入一定量氧化石墨烯（GO）水溶液（2 mg/mL），之后用純水定容至100 ml。

2.2 不同濃度氧化石墨烯（GO）液體創(chuàng)可貼制備

按2.1制法制備出氧化石墨烯（GO）含量分別為50、85、120、155、190微克每毫升的液體創(chuàng)可貼。

2.3不同濃度氧化石墨烯液體創(chuàng)可貼抑菌

用接種環(huán)分別挑取金黃色葡萄球、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌菌落置于裝有生理鹽水的滅菌是試管中作為菌原液，按麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ苽?×108 cfu/ml菌懸液。用移液槍吸取100微升菌懸液涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上后將分別浸泡在不同濃度液體創(chuàng)可貼10 min的7 mm藥敏試紙表面多余的液體除凈后將藥敏試紙輕輕放置于培養(yǎng)基表面后將培養(yǎng)皿置于37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后觀察抑菌圈大小。

2.4 氧化石墨烯（GO）液體創(chuàng)可貼對創(chuàng)面愈合的影響

2.4.1 SD大鼠全層皮膚缺損模型的造模：

隨機(jī)選15只體重在250 g[14] [15]左右的SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后觀察健康狀況等良好后隨機(jī)分成5組，每組3只，一組為空白組（只除毛不涂藥），其余組按天數(shù)分組;大鼠在造模前禁食禁水8 h，稱重后，腹腔注射10 %水合氯醛按0.3 mg/100 g麻醉除去大鼠脊柱兩側(cè)的鼠毛（兩側(cè)除毛面積為0.6×0.6 cm），在除毛處使用酒精消毒后（使用眼科剪按標(biāo)記剪出皮膚全層0.6×0.6 cm左右進(jìn)行皮膚全切（真皮）給藥示意圖如圖1：

2.4.2 檢測指標(biāo)取樣

大鼠造模后，分別于造模后第3、7、10、14天隨機(jī)挑選一組老鼠脫頸處死后用薄膜在傷口處描繪傷口面積后取傷口組織用4%多聚甲醛固定液固定。

2.4.3 創(chuàng)面愈合率計(jì)算

大鼠真皮皮膚全切后使用薄膜在傷口處描繪傷口面積后用質(zhì)地均勻的紙板剪出相應(yīng)的面積大小后用分析天平稱量后換算面積大小;愈合率 = （ 原創(chuàng)面面積 - 第n天創(chuàng)面面積） /原創(chuàng)面面積× 100% 。

2.4.4 VEGF（大鼠血管內(nèi)表皮生長因子）陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

固定后的組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋、切片后采用免疫組化法染色后對每張切片進(jìn)行 VEGF 檢測，本次免疫組化均由專業(yè)的病理醫(yī)師使用顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再分別采集200倍顯微圖像，共采集3張，Halo數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計(jì)算每張圖像陽性面積占比（% DAB Positive Tissue）。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示; 多組間計(jì)量資料比較符合正態(tài)分布采用單因素設(shè)計(jì)方差分析，多組間計(jì)量資料比較不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1各不同濃度液體創(chuàng)可貼抑菌情況

表1：液體創(chuàng)可貼可知含有石墨烯（GO）的液體創(chuàng)可貼抑菌強(qiáng)度較沒有氧化石墨烯（GO）抑菌效果好，含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創(chuàng)可貼抑大腸埃希氏菌菌和銅綠假單胞菌效果較其他濃度好，通過與基質(zhì)組的對比發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯對銅綠假單胞菌有一定的抑菌作用。含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創(chuàng)可貼綜合評分較高，后以含氧化石墨烯（GO）120 ug/mL的液體創(chuàng)可貼做創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)。

3.2創(chuàng)面面積及愈合率

第10天和第14天愈合率為嚴(yán)重偏態(tài)分布因此采用非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果表示不同時間各組之間愈合率比較無顯著差異P>0.05。

3.3創(chuàng)面組織VEGF陽性占比

由表3分析知GO組和曼敦組在第三天時VEGF的表達(dá)較基質(zhì)組和生理鹽水組強(qiáng)，通過GO組與基質(zhì)組的比較，GO組早期對于創(chuàng)面VEGF的表達(dá)有一定的影響，可能在早期促進(jìn)VEGF的表達(dá)，在第三天時各組VEGF表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)，在第三天之后各組VEGF表達(dá)均呈減少趨勢。

討論

低濃度的氧化石墨烯（GO）有抑菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌）作用，抑金黃色葡萄球菌的作用較強(qiáng)，大腸埃希氏菌次之，對于銅綠假單胞菌的抑菌作用較弱，但較含0.017%苯扎氯銨佳。低濃度氧化石墨烯（GO）對于創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用不大，但在創(chuàng)面愈合初期使用氧化石墨烯液體創(chuàng)可貼時其VEGF表達(dá)較生理鹽水處理的創(chuàng)面高的原因可能是其成膜后對創(chuàng)面起到保護(hù)作用并且其抑制細(xì)菌繁殖，預(yù)防創(chuàng)傷感染，因此在創(chuàng)傷初期對于VEGF的表達(dá)可能有促進(jìn)作用。

GO 是一種優(yōu)質(zhì)的新型材料，在眾多領(lǐng)域中運(yùn)用廣泛，隨著GO的廣泛應(yīng)用，其表現(xiàn)出對生態(tài)環(huán)境、生物遺傳等方面存在一定風(fēng)險。根據(jù)有關(guān)報(bào)道GO 具有生態(tài)毒性[16] [17]，通過機(jī)械損傷、氧化應(yīng)激等影響動植物細(xì)胞調(diào)控，產(chǎn)生病理毒性和遺傳毒性，對小鼠肝臟、脾肺產(chǎn)生濃度依賴性的不同程度的毒性[18] [19]，對于GO在醫(yī)療領(lǐng)域的使用應(yīng)確保其對人體無害，不產(chǎn)生遺傳毒性以及生殖毒性，規(guī)范GO的用量。本研究利用含氧化石墨烯190 μg/mL的液體創(chuàng)可貼進(jìn)行抗菌測試，190 μg/mL的液體創(chuàng)可貼均有抑金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌作用，氧化石墨烯抑革蘭氏陽性菌強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，其中120 μg/mL綜合抑菌作用較佳。對創(chuàng)面的愈合無促進(jìn)作用。戴清儀公開發(fā)表的專利中提到含0.5 mg/mL以及2 mg/mL氧化石墨烯液體創(chuàng)可貼均能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但2 mg/mL對細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，李龍劍公開發(fā)表的蘆薈苷氧化石墨烯凝肢的制備及其對創(chuàng)傷修復(fù)作用的研究提到其凝膠中含有0.125 μg/mL產(chǎn)生一定的抑菌效果，使蘆薈苷更能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

[項(xiàng)目基金]：2020年大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：202010600010

作者簡介：韋曉（2000年-），廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥工程專業(yè)，在讀本科。

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