基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀的研制

張亞兵，戴 博

（上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093）

引 言

酶標(biāo)儀又名酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，是對(duì)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)醫(yī)學(xué)儀器。免疫蛋白檢測(cè)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)等[1-2], 是近些年來(lái)普遍應(yīng)用于心血管疾病[3]等早期疾病診斷的以蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法[4-5]。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過(guò)結(jié)合在抗原或抗體上的酶催化顯色底物發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果以顏色的深淺進(jìn)行顯示，溶液顏色的深淺值對(duì)應(yīng)吸光度值的大小，以此來(lái)判斷溶液樣本中待測(cè)抗體或者待測(cè)抗原的濃度[6]。酶標(biāo)儀廣泛應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。ELISA是一種定性和定量的檢測(cè)方法，其中檢測(cè)機(jī)制為可溶性的抗原或抗體會(huì)因?yàn)榭乖涂贵w結(jié)合的專一性發(fā)生免疫反應(yīng)，而抗體或抗原會(huì)先與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合。BCA蛋白濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)則是基于溶液顏色深淺相對(duì)應(yīng)的吸光度值來(lái)計(jì)算溶液中蛋白質(zhì)的濃度[7]。酶標(biāo)儀本質(zhì)上是一臺(tái)簡(jiǎn)單的光電比色計(jì)，工作原理和酶標(biāo)儀一樣都是由濾光片或單色器將光源發(fā)出的光轉(zhuǎn)換成一束單色光，該單色光進(jìn)入酶標(biāo)板微孔板中的待測(cè)樣本中，由于待測(cè)樣本為溶液，會(huì)吸收一部分單色光，而其他的光會(huì)透過(guò)待檢測(cè)溶液，經(jīng)過(guò)不同濃度微孔板中的溶液后，光電檢測(cè)器將不同微孔板中的不同強(qiáng)度的光信號(hào)進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換，通過(guò)上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。酶標(biāo)儀通過(guò)衍射光柵或?yàn)V光片選擇不同波長(zhǎng)的光與待測(cè)溶液的吸光度相對(duì)應(yīng)的某一波長(zhǎng)的光，使用由電機(jī)控制的光電探測(cè)元件來(lái)逐一掃描酶標(biāo)板上的微孔[8-9]。傳統(tǒng)酶標(biāo)儀光學(xué)系統(tǒng)笨重且復(fù)雜，加上機(jī)器內(nèi)部的機(jī)電轉(zhuǎn)換裝置，導(dǎo)致儀器的體積大，成本高，檢測(cè)效率低，衍射光柵或?yàn)V光片價(jià)格昂貴[10]，且只有專業(yè)的人員才能完成精密儀器的操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。

本文研制了基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀，分別進(jìn)行了PTX3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和BCA蛋白濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)具有不同的檢測(cè)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中使用超廣角鏡頭捕獲到實(shí)驗(yàn)的待測(cè)樣本圖片后，使用基于圖像處理的比色算法對(duì)圖片進(jìn)行處理與分析，能夠快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)380～750 nm波段蛋白濃度的檢測(cè)，同時(shí)降低了儀器使用濾光片或光柵的昂貴成本，通過(guò)與商用酶標(biāo)儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證了全波段蛋白檢測(cè)儀的可行性。

1 基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀

1.1 硬件系統(tǒng)

圖1（a）、（b）分別為全波段蛋白檢測(cè)儀的外部結(jié)構(gòu)圖和內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。儀器的檢測(cè)機(jī)制為將含有樣本的酶標(biāo)板放入全波段蛋白檢測(cè)儀中，打開(kāi)LED光源，光透射經(jīng)過(guò)樣本，一部分被溶液吸收，另一部分光經(jīng)反射鏡改變光路，由廣角鏡頭和CCD捕獲。CCD將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳輸至上位機(jī)，上位機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)圖像處理，將圖片中的溶液顏色信息轉(zhuǎn)換為待檢測(cè)樣本的蛋白濃度信息。

圖1 全波段蛋白檢測(cè)儀的內(nèi)外部結(jié)構(gòu)Fig. 1 Internal and external structure of a full band protein detector

光學(xué)成像系統(tǒng)包括LED光源、勻光板、前表面鍍膜反射鏡、超廣角鏡頭、CCD。LED光源是由96個(gè)LED燈組成，且與酶標(biāo)板的96微孔一一對(duì)應(yīng)，LED燈的光譜可以全面覆蓋380～750 nm的可見(jiàn)光范圍，峰值波長(zhǎng)為481 nm，LED光源通過(guò)勻光板使光強(qiáng)更加均勻、穩(wěn)定，勻光板采用雙面磨砂1.2 mm厚度，透射率為90%，透射霧度為98%。反射鏡采用前表面鍍膜技術(shù)，保護(hù)膜的厚度為250 nm，反射率為99.67%，采用焦距為12 mm，視場(chǎng)角為100°的鏡頭。在成像系統(tǒng)中，為了提高成像的視場(chǎng)范圍，往往會(huì)造成較大的光程，從而造成較低的空間利用率。全波段蛋白檢測(cè)儀采用反射式光學(xué)檢測(cè)的方式進(jìn)行成像[11]，將一維成像光程擴(kuò)展為二維，提高維度減少空間，同時(shí)提高視場(chǎng)范圍，光程從原來(lái)100 cm減小到60 cm，使系統(tǒng)更加緊湊，架構(gòu)更穩(wěn)定，成像系統(tǒng)的光路模擬圖如圖2所示。

圖2 成像系統(tǒng)光路模擬圖Fig. 2 Optical path simulation of the imaging system

電路系統(tǒng)是由USB HUB、GPIO （generalpurpose input/output）控制器、繼電器和電源組成。電路系統(tǒng)控制光源和成像系統(tǒng)，并通過(guò)上位機(jī)軟件進(jìn)行操控，實(shí)現(xiàn)點(diǎn)亮光源、攝像機(jī)拍照的功能，以獲取酶標(biāo)板微孔板中樣本溶液顏色信息圖來(lái)進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)圖像處理功能。機(jī)械部分是由外殼、底座、酶標(biāo)板安裝架、鏡面支撐架、相機(jī)固定架構(gòu)成。儀器外殼采用3D打印技術(shù)使用環(huán)氧樹(shù)脂材料，其他部分均使用鋁合金材質(zhì)。酶標(biāo)板固定架通過(guò)伸縮彈簧和限位螺絲保證酶標(biāo)板的放入彈出以及位置的固定。

1.2 軟件算法

全波段蛋白檢測(cè)儀獲取到檢測(cè)樣本圖片后，將圖片傳輸至上位機(jī)，上位機(jī)將獲取的圖片轉(zhuǎn)換為歸一化的RGB顏色空間，減少光照強(qiáng)度對(duì)成像的影響。Human Pentraxin 3/TSG-14酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)完成后溶液顏色為藍(lán)色，加入終止液后變?yōu)辄S色，光的吸收檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，所以選擇藍(lán)色通道來(lái)對(duì)顯色溶液后的圖片通過(guò)基于圖像處理的比色算法來(lái)獲取圖片中溶液的質(zhì)量濃度信息。BCA蛋白濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的溶液顏色為紫色，溶液對(duì)應(yīng)的光吸收度的檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm，因此選擇歸一化的綠色通道分析[12-13]。

PC端的程序是由Visual Studio 2019軟件來(lái)實(shí)現(xiàn)的，程序的功能包括對(duì)全波段蛋白檢測(cè)儀的光源以及成像模塊的控制以及OD （Optical Density）值、濃度信息的獲取及界面顯示。圖像處理比色算法流程如圖3所示，首先，獲取酶標(biāo)板中96孔微孔板的中心，并求得每個(gè)微孔的像素均值，由于每個(gè)微孔加入的樣本體積是一致的，因此以中心區(qū)域的像素均值作為樣本濃度的指標(biāo)。微孔板中的像素取值范圍為0～255，使用微孔的像素均值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)，以待測(cè)樣本濃度作為橫坐標(biāo)使用基于四參數(shù)擬合模型來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)分析未知樣本的濃度信息。

圖3 圖像處理比色算法Fig. 3 Colorimetric algorithm

2 實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證

2.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中所用的試劑及儀器包括：Human Pentraxin 3/TSG-14檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)DPTX35）；Pierce? BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒（Thermo Fisher，產(chǎn)品編23225）; 稀釋液（PBST，Thermo Fisher）；基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀；移液槍（Eppendorf AG）；Infinite M200 商用酶標(biāo)儀（Tecan）；超純水機(jī)（上海和泰公司）；TRIO TM-2N振蕩器（ASONE）。

2.2 PTX3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

先用移液槍向96孔酶標(biāo)板的每個(gè)微孔中加入200 μL一抗，在20 ℃的室溫下，將裝有待測(cè)樣本的酶標(biāo)板放入振蕩器中培養(yǎng)60 min。培養(yǎng)60 min后，向微孔中加入400 μL的PBST重復(fù)洗滌微孔2次，洗滌完成后，移出多余的PBST，并將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)，將殘留的PBST拍出，然后向需要的微孔中加入100 μL的測(cè)定稀釋劑RD-156和20 μL 的待測(cè)樣本，使用試劑盒中的透明封板紙密封酶標(biāo)板，在室溫下培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)完成后使用PBST重復(fù)洗滌微孔4次，向相應(yīng)的微孔中加入200 μL酶標(biāo)檢測(cè)抗體，室溫下培養(yǎng)2 h。孵育完后將微孔洗滌4次，并將酶標(biāo)板翻轉(zhuǎn)，將殘留的PBST拍出，向酶標(biāo)板的每個(gè)微孔中加入200 μL結(jié)合液，并將酶標(biāo)板放在避光20 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)30 min。最后，向?qū)?yīng)的微孔中加入50 μL終止液，在15 min內(nèi)測(cè)量反應(yīng)產(chǎn)物。PTX3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)采用96孔透明酶標(biāo)板，制作兩列相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每列設(shè)置8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，兩列標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度遞減，質(zhì)量濃度范圍為0～20 ng/mL；并檢測(cè)16個(gè)未知樣本中的PTX3蛋白濃度，實(shí)驗(yàn)完成后采集的圖像如圖4所示。

圖4 PTX3實(shí)驗(yàn)圖像Fig. 4 PTX3 experimental result

2.3 BCA蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)

使用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行BCA蛋白測(cè)定實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中做出兩列濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)品，其中包含2個(gè)空白對(duì)照孔。BCA蛋白濃度實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)40份未知樣本的蛋白濃度。按照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)中的表格進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，并依次稀釋出一組有質(zhì)量濃度梯度的BCA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，其中，質(zhì)量濃度范圍為20～2 000 μg/mL。把試劑盒中的試劑A和試劑B按照說(shuō)明書(shū)的比例即50∶1，混合均勻制作工作液。然后使用移液槍向每個(gè)微孔中加入25 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或未知樣本，并依次向每個(gè)微孔中加入200 μL的工作液。將酶標(biāo)板放在振蕩器上使用400 r/min 震蕩30 s，將樣本和工作液充分混合，將混合后的酶標(biāo)板放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，待96孔酶標(biāo)板冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀換入562 nm的濾光片檢測(cè)酶標(biāo)板微孔中蛋白濃度。使用商用酶標(biāo)儀檢測(cè)完成后，用同樣的方式采集全波段蛋白檢測(cè)儀獲取BCA實(shí)驗(yàn)后的圖像如圖5所示

圖5 BCA蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)圖像Fig. 5 The experimental result of BCA protein testing

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

Human Pentraxin 3/TSG-14酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和BCA蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)均適用于合四參數(shù)擬合模型[14-15]，而未知樣本質(zhì)量濃度和響應(yīng)的關(guān)系用四參數(shù)擬合模型可表示為

式中：y為樣本在藍(lán)色通道下的響應(yīng)值；x為質(zhì)量濃度；a為下漸近線估值，b為曲線斜率值，c為質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)于最小響應(yīng)與最大響應(yīng)估計(jì)值之間的中間值；d為曲線的上漸近線估值。

全波段蛋白檢測(cè)儀通過(guò)四參數(shù)擬合模型繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線與商用酶標(biāo)儀的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估儀器的性能。

通過(guò)圖6可知，PTX3實(shí)驗(yàn)中，全波段蛋白檢測(cè)儀根據(jù)OD值擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合優(yōu)度(R2)為0.999 6，而商用酶標(biāo)儀根據(jù)OD值擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合優(yōu)度為0.999 8。圖7為BCA顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，根據(jù)OD值擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合優(yōu)度為0.999 7，而商用酶標(biāo)儀根據(jù)OD值擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合優(yōu)度為0.999 8。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明全波段蛋白檢測(cè)儀使用比色算法繪制的PTX3 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及BCA蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與商用的酶標(biāo)儀繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本一致，且擬合優(yōu)度較高，全波段蛋白檢測(cè)儀性能達(dá)到檢測(cè)要求，并能夠完成多波段的生物顯色實(shí)驗(yàn)。

圖6 PTX3標(biāo)準(zhǔn)曲線 實(shí)線代表標(biāo)準(zhǔn)曲線：商用酶標(biāo)儀虛線代表標(biāo)準(zhǔn)曲線：全波段蛋白檢測(cè)儀Fig. 6 PTX3 standard curve. Solid line: standard curve measured from the commercial microplate reader. Dotted line:standard curved measured from the full-band protein detection system.

圖7 BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線 實(shí)線代表標(biāo)準(zhǔn)曲線：商用酶標(biāo)儀虛線代表標(biāo)準(zhǔn)曲線：全波段蛋白檢測(cè)儀Fig. 7 BCA standard curve. Solid line: standard curve from the commercial microplate reader. Dotted line: standard curve measured from the full-band protein detection system

3.2 未知樣本分析

實(shí)驗(yàn)用42份未知樣本進(jìn)行PTX3實(shí)驗(yàn)和40份未知樣本進(jìn)行BCA蛋白濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)與之相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣本的濃度。圖8和圖9為全波段蛋白檢測(cè)儀與商用酶標(biāo)儀測(cè)出的參考質(zhì)量濃度值的線性關(guān)系。兩種不同檢測(cè)波長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀與商用酶標(biāo)儀檢測(cè)出的結(jié)果具有很好的一致性，PTX3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和BCA蛋白濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的兩者的樣本質(zhì)量濃度誤差在5%以內(nèi)。

圖8 全波段蛋白檢測(cè)儀與商用酶標(biāo)儀檢測(cè)PTX3未知樣本質(zhì)量濃度對(duì)比圖Fig. 8 Comparison of concentration of unknown PTX3 samples detected by the full-band protein detection system and the commercial microplate reader

圖9 全波段蛋白檢測(cè)儀與商用酶標(biāo)儀檢測(cè)BCA未知樣本質(zhì)量濃度對(duì)比圖Fig. 9 Comparison of concentration of BCA unknown samples detected by full-band protein detection system and the commercial microplate reader

4 結(jié) 論

在PTX3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)及BCA蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用圖像處理比色處理算法，研制出了基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測(cè)儀。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于不同波長(zhǎng)的顯色實(shí)驗(yàn)，在采集圖片之后利用比色算法和四參數(shù)擬合模型繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線與商用酶標(biāo)儀繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果基本一致（PTX3:R2=0.999 6，BCA:R2=0.999 7），證明了基于反射式光路的全波段蛋白檢測(cè)儀能夠完成檢測(cè)。通過(guò)反射式的光路設(shè)計(jì)將一維成像光程擴(kuò)展為二維，提高維度減少空間，同時(shí)延長(zhǎng)光程提高視場(chǎng)范圍，使儀器架構(gòu)更加緊湊，同時(shí)采用比色算法在3 s內(nèi)完成檢測(cè)，而商用酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)間大多為10 s，大大減少了檢測(cè)所需時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)降低了使用濾光片或光柵的昂貴成本。