加味三核顆粒質量控制研究*

李慧峰 孟 霜 馮振宇 周曉榮 王鑫鑫 裴妙榮※ 趙建平

（1.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030013；3.山西中醫(yī)藥大學研究生學院，山西 晉中 030619）

前列腺增生癥是引發(fā)中老年男性排尿障礙的一種常見良性疾病，在50 歲人群中發(fā)病率為40%，在80 歲以上人群中發(fā)病率接近90%，90 歲以后人群發(fā)病率幾乎100%。我們目前逐步進入人口老齡化階段，前列腺增生癥患者逐年增加，嚴重影響老年人的生活質量，甚至還可能傷及腎臟，造成腎功能不全等后果[1]。加味三核顆粒是國醫(yī)大師王世民教授由經典古方加味而成，由橘核、山楂核、荔枝核、黃柏、水紅花子等多味中藥組成的中藥制劑，治療前列腺增生療效顯著，極大地減輕了患者的病痛。本論文就加味三核顆粒的薄層定性鑒別、含量測定、方法學考察進行研究，建立加味三核顆粒的完整、全面的質量控制方法，為加味三核顆粒的質量控制研究奠定一定的基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters 2998 紫外檢測器，Empower 工作站；CAMAG TLC VISUALIZER 薄層成像儀；CAMAG LINOMAT 5 半自動點樣儀；瑞士METTLERA B135-S 電子天平；SB-800 DTD超聲波清洗機。

1.2 試劑 乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201915）；黃柏對照藥材（批號：121510-201807）；補骨脂對照藥材（批號：121056-201605）；蛇床子對照藥材（批號：121030-201808），以上標準品均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃柏的薄層鑒別 將樣品研磨成細粉狀，取3 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機超聲30 min 后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘渣后得到的溶液即為供試品溶液。另取黃柏對照藥材2.0 g，制備方法同供試品溶液，作為對照藥材溶液。再取黃柏陰性樣品3 g，制備方法同供試品溶液，即得缺黃柏的陰性對照溶液[2，3]。參照2020 版《中華人民共和國藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個批次供試品、黃柏對照藥材以及缺少黃柏的陰性對照溶液各吸取1 μ L，應用薄層色譜點樣儀，分別點于同一硅膠G 薄層板上，點好的薄層板在內含乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，通風處晾干，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結果發(fā)現3 個批次供試品薄層色譜圖與黃柏對照藥材薄層色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點顯現，圖譜顯色清晰，陰性對照未見干擾。結果見圖1。

圖1 黃柏薄層色譜圖

2.1.2 補骨脂的薄層鑒別 將樣品研磨成細粉狀，取2 g于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機超聲45 min 后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘渣后得到的溶液即為供試品溶液。另取0.5 g 補骨脂對照藥材、2 g 補骨脂陰性樣品分別制備對照藥材和缺補骨脂的陰性對照溶液，方法同上[3，5]。參照2020 版《中華人民共和國藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個批次供試品、補骨脂對照藥材以及缺少補骨脂的陰性對照溶液各吸取2 μ L，應用薄層色譜點樣儀分別點置于同一個硅膠G 板上，點好的薄層板在內含乙酸乙酯-正己烷（3∶1）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，通風處晾干，以10%氫氧化鉀甲醇溶液作為顯色劑，將其均勻的噴灑于展好的薄層板上，105 ℃ 恒溫處理，結果發(fā)現3 個批次供試品色譜圖與補骨脂對照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的斑點顯現，圖譜顯色清晰，陰性對照未見干擾。結果見圖2。

圖2 補骨脂薄層色譜圖

2.1.3 蛇床子的薄層鑒別 將樣品研磨成細粉狀，取2 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機超聲40 min 后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘渣后得到的溶液即為供試品溶液。另取2 g 蛇床子對照藥材、2 g 蛇床子陰性樣品分別制備對照藥材和缺蛇床子的陰性對照溶液，方法同上[3，5]。參照2020 版《中華人民共和國藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個批次供試品、蛇床子對照藥材以及缺蛇床子的陰性對照溶液各吸取2 μ L，應用薄層色譜點樣儀分別點置于同一硅膠G 薄層板上，點好的薄層板在內含二氯甲烷-乙酸乙酯-正己烷（2∶3∶2）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄層板從展開槽中取出，避光處晾干，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結果發(fā)現3 個批次供試品色譜圖與蛇床子對照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點顯現，圖譜顯色清晰，陰性對照未見干擾。結果見圖3。

圖3 蛇床子薄層色譜圖

2.1.4 水紅花子的薄層鑒別 將樣品研磨成細粉狀，取3 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機超聲30 min 后過濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加20 mL 蒸餾水溶解殘渣后得到的溶液用20 mL 的乙酸乙酯萃取2 次，合并并濃縮乙酸乙酯液，水浴蒸干萃取液，加1 mL 分析純甲醇溶解殘渣后得到的溶液即為供試品溶液。另取1 g 水紅花子對照藥材、3 g水紅花子陰性樣品分別制備對照藥材和缺水紅花子的陰性對照溶液，方法同上[3，6]。參照2020 版《中華人民共和國藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個批次供試品、水紅花子對照藥材以及缺水紅花子的陰性對照溶液各吸取5 μ L，點于同一張聚酰胺薄膜上，點好的薄膜置于含氯仿-甲醇（3∶2）展開劑的展開槽中展開完全后，將薄膜從展開槽中取出，通風處晾干，將10%三氯化鋁乙醇溶液均勻噴在薄膜上，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結果發(fā)現3 個批次供試品色譜圖與水紅花子對照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點顯現，圖譜顯色清晰，陰性對照未見干擾。結果見圖4。

圖4 水紅花子薄層色譜圖

2.2 含量測定[7，8]

2.2.1 色譜條件 固定相：Gemini C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μ m）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000 mL 加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.32 mg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別稱取除黃柏以外的其余藥味，按照加味三核顆粒的制備工藝制成陰性樣品，按2.2.3 項下供試品溶液的制備方法制作，制備成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性實驗 分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μ L，按2.2.1 項下所述的色譜條件進行測定。結果表明：陰性樣品溶液在鹽酸小檗堿的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。結果見圖5。

圖5 加味三核顆粒HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品6.40mg，置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；再分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得不同濃度對照品溶液，分別進樣10 μ L，測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X，ng）作圖，得一直線回歸方程：Y＝2883.1X+44363，R2＝0.9996，r＝0.9998，故鹽酸小檗堿進樣量在640～6400 ng 進樣范圍內，濃度與色譜峰峰面積呈良好線性。

2.2.7 精密度實驗 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液（0.32 mg/mL）10 μ L，連續(xù)進樣6 次，測定鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD 為0.60%（n=6）。結果表明：該高效液相色譜儀的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液（批號20200820）在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進樣10 μ L，測定樣品中鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD 為0.97%。結果表明：供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性實驗 精密稱取同一批號（批號20200820）的加味三核顆粒6 份，按3 項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μ L，進樣，測定峰面積積分值并計算含量。結果樣品中鹽酸小檗堿的平均質量分數為3.9977 mg/g，RSD＝1.06%。結果表明該方法重復性良好。

2.2.10 回收率實驗 精密稱取已知含量批次樣品（批號20200820，3.9977 mg/g）6 份，分別精密添加鹽酸小檗堿對照品適量，按“供試品溶液制備”項下的方法制備供試品溶液，測定峰面積積分值，計算回收率。結果鹽酸小檗堿的平均回收率為100.56%，RSD 為1.46%，表明該方法測定結果的準確度較高。結果見表1。

表1 加樣回收率實驗測定結果

2.2.11 樣品含量測定 取3 批樣品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算樣品中鹽酸小檗堿的含量。結果見表2。

表2 樣品中鹽酸小檗堿含量測定結果

3 討論

本文采用TLC 法對加味三核顆粒中黃柏、補骨脂、蛇床子、水紅花子進行定性鑒別，結果供試品樣品與對照藥材相對應的位置有相同顏色的斑點，斑點清晰，陰性對照無干擾，實驗專屬性強，可以作為加味三核顆粒的定性鑒別方法。

黃柏是加味三核顆粒的君藥，其中鹽酸小檗堿為黃柏的主要藥效成分，故選擇鹽酸小檗堿作為控制本品質量的指標性成分。實驗參照《中華人民共和國藥典》一部、四部及文獻報道，采用HPLC 法對鹽酸小檗堿進行含量測定。為獲得最佳的分離效果，依據參考文獻進行條件摸索，最終選擇檢測波長為265 nm[8]，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1 L 流動相中加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g）[4，9]。流動相在配置的過程中先配置乙腈-0.1%磷酸溶液，再加十二烷基苯磺酸鈉，這樣操作可以避免大量氣泡的產生。本方法簡便，容易操作，結果準確，可用于加味三核顆粒的質量控制。