HPLC-DAD法同時測定仙茸壯陽口服液中4種成分的含量

李 珊,王曉燕,王艷偉,趙一擎,蔣蘆荻

河南省食品藥品檢驗(yàn)所,國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450018

仙茸壯陽口服液是由鹿茸（去毛）、仙茅、淫羊藿、巴戟天（鹽制）、肉蓯蓉、枸杞、刺五加浸膏、何首烏（制）共8味藥材制成的紅棕色黏稠狀的口服液,味甜、微苦、咸,具有補(bǔ)腎壯陽的功效,用于體虛、陽痿、腎寒等的治療[1]。針對該口服液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有2個,分別是《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第二冊（WS3-B-0249-90）和國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z],其中WS3-B-0249-90中的標(biāo)準(zhǔn)過于簡單,沒有鑒別和含量測定項(xiàng)目,而WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z中雖然增加了含量測定項(xiàng)目,但也只通過淫羊藿苷一個指標(biāo)性成分的含量控制該制劑的質(zhì)量,旨在控制淫羊藿藥材的質(zhì)量。淫羊藿是仙茸壯陽口服液中十分重要的藥材,具有抗疲勞[2-3]、調(diào)節(jié)免疫[4-8]、抗衰老[9]、抗腫瘤[10-17]、抗炎[18-22]等作用。由于市場上淫羊藿藥材的質(zhì)量參差不齊且存在偽品[23-25],故關(guān)注制劑中淫羊藿藥材的質(zhì)量非常必要。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),目前針對仙茸壯陽口服液質(zhì)量控制的文獻(xiàn)多只以淫羊藿苷1種成分為指標(biāo),對其淫羊藿藥材投料的質(zhì)量進(jìn)行研究[26-27],難以全面地反映生產(chǎn)過程中所投入的淫羊藿藥材的質(zhì)量狀況。本研究建立了同時測定仙茸壯陽口服液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分含量的高效液相色譜-二極管陣列檢測器法,為仙茸壯陽口服液中淫羊藿藥材投料的質(zhì)量問題提供含量測定方法,旨在為進(jìn)一步提高仙茸壯陽口服液的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）;KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;XPE205 萬分之一電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.2 試藥

朝藿定A 對照品（批號RF200811-04,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.84%,杭州斯坦?；び邢薰荆?朝藿定B 對照品（批號RF201014-03,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.24%,杭州斯坦福化工有限公司）;朝藿定C（批號111780-201905,質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.3%,中國食品藥品檢定研究院）;淫羊藿苷（批號110737-202017,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%,中國食品藥品檢定研究院）;乙腈（色譜純,德國默克股份兩合公司）;超純水為自制;其余試劑均為分析純。

18批仙茸壯陽口服液（編號為S1～S18）來自2021年國家藥品抽檢計劃樣品,由6個不同的廠家（編號為A～F）生產(chǎn),樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

以下8味藥材經(jīng)雷留成主任藥師鑒定均為正品:鹿茸（去毛,批號20181101,通化）;仙茅（批號1807001,云南）;巴戟天（鹽制,批號1903001,廣東）;肉蓯蓉（批號T001-180602,內(nèi)蒙古）;枸杞（批號181208,寧夏）;刺五加浸膏（批號200801,黑龍江林海雪原藥業(yè)有限公司）;何首烏（制,批號1806001,四川）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱。流動相為乙腈（A）-水（B）,梯度洗脫:0～30 min,76%～74%B;30～31min,74%～55%B;31～45min,55%～53%B。流速為1.0 mL·min-1。檢測波長為270 nm。柱溫為30℃。進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果見圖1。各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于12 000。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品儲備液的制備

分別精密稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度分別為140.272、101.780、93.920、122.664μg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取仙茸壯陽口服液樣品2 mL,置于10 mL量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液適量,超聲（200 W、40 k Hz）提取10 min,加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容,用0.22μm 微孔濾膜過濾,即得。

2.4 缺淫羊藿陰性對照溶液的制備

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分均來自處方中的淫羊藿,故需制備缺淫羊藿的陰性對照溶液。取何首烏、巴戟天、枸杞、肉蓯蓉、仙茅用體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇溶液回流提取2次,第1次6 h,第2次4 h,合并提取液,過濾,將濾液濃縮至適量,加乙醇適量,攪拌,靜置,過濾,濾液置于水浴鍋中蒸至稠膏狀;將鹿茸置于鍋內(nèi)蒸30～40 min,取出切片,用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液適量溫浸12 h以上,再回流提取4次,依次為3、3、2、2 h,合并提取液,過濾,將濾液濃縮至適量,加乙醇適量,攪拌,靜置,過濾,濾液置于水浴鍋中蒸至稠膏狀,沉淀用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液洗至無色,洗液靜置,回收乙醇,濃縮至適量,合并2次回收乙醇的濃縮液,加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇至50 mL,使含醇量為20%～30%;另取煉制蜜蜂250 g、蔗糖250 g制成單糖漿,加入上述鹿茸液、刺五加浸膏、何首烏等稠膏,混勻,加入防腐劑適量及枸櫞酸鈉6 g,攪拌均勻,加水至1 000 mL,靜置,過濾,即得缺淫羊藿陰性對照溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

取混合對照品儲備液0.5、1、2、5、10 mL,加甲醇稀釋后定容至10 mL,得到系列混合對照品溶液。取儲備液及系列混合對照品溶液適量,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,以系列混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）,進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 仙茸壯陽口服液中4種成分的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationship of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對照品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次,記錄峰面積。計算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積的RSD 值分別為0.63%、0.72%、0.56%、0.85%,表明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一仙茸壯陽口服液（S8）供試品6份,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,計算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的含量。結(jié)果見表3,RSD 值分別為0.81%、1.47%、1.04%、0.97%,表明該方法的重復(fù)性良好。

表3 仙茸壯陽口服液中4種成分的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=6）Tab.3 Experimental results of repeatability of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=6）

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取仙茸壯陽口服液（S8）供試品溶液,分別于0、2、4、6、12、16、24、36 h進(jìn)樣測定。計算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積的RSD 值分別為1.01%、1.7%、0.96%、1.13%,表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知成分含量的仙茸壯陽口服液（S8）供試品6份,各1 mL,分別精密加入朝藿定A 對照品溶液（質(zhì)量濃度51.8μg·mL-1）、朝藿定B對照品溶液（質(zhì)量濃度162.7μg·mL-1）、朝藿定C對照品溶液（質(zhì)量濃度124.4μg·mL-1）、淫羊藿苷對照品溶液（質(zhì)量濃度307.5μg·mL-1）各1 mL,按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。計算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均加樣回收率分別為97.07%、96.70%、97.64%、97.73%,RSD值分別為1.74%、1.26%、2.68%、1.99%,表明該方法的準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見表4。

表4 仙茸壯陽口服液中4種成分的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Experimental results of sample recovery of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=6）

2.10 樣品含量測定

取18批仙茸壯陽口服液樣品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定3次,計算樣品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分的含量。結(jié)果見表5。

表5 仙茸壯陽口服液中4種成分的含量測定結(jié)果 （n=3）Tab.5 Determination results of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=3）

3 討論

3.1 提取條件的選擇

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷均屬于黃酮類物質(zhì),此類物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解性較好,制備供試品時,考察了甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液、乙醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液4種提取溶劑,10、20、50 mL 3 種不同溶劑用量,超聲和回流2種不同提取方法,5、10、20 min 3種不同提取時間對提取效率的影響,最終確定提取條件為應(yīng)用10 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液超聲提取10 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究比較了選用5種不同色譜柱[Agela-Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm,5μm）;Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;SHIMADZU Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm,5μm）;Waters-Symmetrm C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm]及不同流動相系統(tǒng)對提取效率的影響,最后以乙腈作為流動相A,水作為流動相B,梯度洗脫,通過比較理論塔板數(shù)、分離度、信噪比等,最終確定選用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色譜柱,該色譜柱可使4種成分獲得最佳的分離效果。

3.3 檢測波長的選擇

采用DAD 檢測器在200～400 nm 波長范圍內(nèi)對4種對照品和仙茸壯陽口服液樣品進(jìn)行掃描,綜合考慮不同波長下色譜峰的數(shù)量、紫外吸收、分離度、峰面積大小,最終將270 nm 作為檢測波長。

3.4 測定結(jié)果分析

仙茸壯陽口服液中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷均來源于淫羊藿。由表4可知,18批仙茸壯陽口服液中4種成分的含量差異很大,朝藿定A 的質(zhì)量濃度為0.019 1～0.061 4 mg·mL-1,朝藿定B的質(zhì)量濃度為0.017 4～0.153 9 mg·mL-1,朝藿定C的質(zhì)量濃度為0.026 5～0.265 0 mg·mL-1,淫羊藿苷的質(zhì)量濃度為0.062 2～0.315 3 mg·mL-1;4種成分總含量的差異也較大,在0.204 6～0.692 9 mg·mL-1之間。這可能與不同廠家生產(chǎn)工藝不同、不同批次淫羊藿藥材投料差異等因素有關(guān)?！吨腥A人民共和國藥典》2020版是以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4種成分的總量來評價淫羊藿藥材的質(zhì)量,而在仙茸壯陽口服液的2個現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中,WS3-B-0249-90缺乏含量測定項(xiàng)目,WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z只以淫羊藿苷的含量控制制劑的質(zhì)量,且將淫羊藿苷含量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定設(shè)定為質(zhì)量濃度0.15 mg·mL-1。由表4可知,18批仙茸壯陽口服液中淫羊藿苷的含量能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的樣品,即淫羊藿苷的質(zhì)量濃度大于0.15 mg·mL-1的只有10批,可見單獨(dú)以淫羊藿苷的含量控制制劑中淫羊藿投料的質(zhì)量并不合理,存在將樣品誤判為不合格樣品的風(fēng)險,建議以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的總含量控制該制劑中淫羊藿投料的質(zhì)量。