葡萄新品種‘南太湖特早’果實發(fā)育過程中特征香氣物質(zhì)的變化規(guī)律

奚昕琰，楊淑娜，王莉，殷益明，賈惠娟*

（1.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院果樹科學研究所，杭州 310058；2.湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心，浙江 湖州 313000）

‘南太湖特早’是‘夏黑’葡萄的芽變新品種，由浙江大學主持選育[1]，于2019 年獲得國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部非主要農(nóng)作物品種登記證書[GPD 葡萄（2019）330044]。通常，‘南太湖特早’較母樹成熟期早10 d左右，果實香味和色澤均優(yōu)于‘夏黑’，二者在果肉中尤為突出。

香氣是衡量葡萄果實品質(zhì)的重要指標之一。果實香氣成分包含多種復雜的化合物，但真正對香味起作用的只有少數(shù)幾種物質(zhì)。香氣活性值（odor activity value,OAV）被認為是衡量香氣物質(zhì)貢獻程度的指標，由該物質(zhì)實際存在濃度與香氣閾值的比值決定，當某物質(zhì)的OAV≥1時，被稱為特征香氣物質(zhì)[2]。影響葡萄香氣的因素很多，除了遺傳因子本身，品種、成熟度、樹齡、砧木等內(nèi)因及氣候條件、栽培技術等外因均會產(chǎn)生影響[3]。

國外多以歐亞種葡萄為研究對象，依據(jù)香氣成分對游離態(tài)萜烯類物質(zhì)的依賴程度將其分為麝香型（單萜依賴型芳香葡萄品種）、非麝香型（可少量檢測到麝香型芳香葡萄品種）和非芳香型（主要香氣成分是直鏈脂肪族類物質(zhì)的葡萄品種）[4]?！暮凇瘜儆凇薹濉禋W美種葡萄，有淡淡的草莓香味[5]，前人的研究多認為‘巨峰’葡萄中貢獻香氣的主要物質(zhì)是乙酸乙酯等脂肪族類物質(zhì)，屬于非芳香型。

果實成熟是一個復雜的、高度協(xié)調(diào)的生長發(fā)育過程，伴隨著一系列的生理反應和生化變化，如顏色、風味、質(zhì)地和香氣等[12]。有學者研究了‘南太湖特早’果實的生長發(fā)育和色澤形成規(guī)律[13]，并鑒定了幾個可能對其色澤起作用的相關基因[14]。然而，較母本‘夏黑’更具有濃郁香味的‘南太湖特早’在發(fā)育過程中香味物質(zhì)遺傳調(diào)控的信息鮮有報道。本研究旨在檢測比較‘夏黑’與‘南太湖特早’成熟果實中的香氣成分，為優(yōu)良品系的推廣及遺傳育種提供科學依據(jù)，并通過分析其發(fā)育過程中香氣物質(zhì)的變化規(guī)律，為香氣的形成機制與調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究于2019 年5—7 月在浙江大學華家池實驗教學基地設施大棚內(nèi)進行，實驗材料‘南太湖特早’和‘夏黑’均為3 年生樹齡、砧木5BB，采用根域限制栽培、‘T’字形整形架勢和短梢修剪模式。株行距2.2 m×8.0 m，通過花穗和果穗修剪整形，每穗質(zhì)量500 g，產(chǎn)量約1 100 kg/667 m2。

1.2 實驗方法

2個供試品種萌芽、開花期基本一致，取樣時間從盛花后24 d（2019 年5 月29 日）開始，每隔7 d 取樣一次，直至成熟（可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)達17%）。每個品種各采摘3 串生長良好、大小一致、無病蟲害的果穗，于低溫環(huán)境下運回實驗室，剪取中部果90 粒并分為3 個生物學重復，用液氮冷凍，于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.1 果實品質(zhì)測定

參照李海燕[15]的方法，取30顆果粒測定單果質(zhì)量、縱徑和橫徑、總可溶性固形物含量（total soluble solid content, TSS）、可滴定酸含量（titratable acid content,TA），并計算固酸比（TSS/TA）。

1.2.2 香氣物質(zhì)的萃取及測定

參考ZHANG等[16]的方法并加以調(diào)整，利用頂空萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定香氣物質(zhì)含量。

陳新德（1967-），男，教授級高級工程師，主要從事生物質(zhì)高值化利用、非金屬礦高值化利用、石油化工相關工藝優(yōu)化。

稱取2 g 葡萄果皮或5 g 果肉，加入3 mL 200 mmol/L乙二胺四乙酸溶液、3 mL 20%CaCl2溶液和20 μL 0.8 mg/mL 2-辛醇溶液，充分渦旋（30～60 s）。

氣相色譜-質(zhì)譜測定條件：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀使用J &W HP-5ms 毛細管柱（30 cm×0.25 mm，0.25 μm，美國Agilent公司），填料是5%苯基甲基聚硅氧烷，溫度限值為－60～325 ℃。儀器進樣口溫度250 ℃，升溫程序為初始溫度40 ℃，保持3 min，然后以3 ℃/min的速度升溫至100 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持5 min。質(zhì)譜載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，采用電子轟擊方式電離，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，全離子、選擇離子質(zhì)量掃描范圍50～550 Da。

定性分析：依據(jù)色譜保留時間、質(zhì)譜信息、NIST 08 和RTLPEST 3 譜庫檢索及文獻[17-18]進行定性分析。

定量分析：采用內(nèi)標法進行相對定量，選擇2-辛醇作為內(nèi)標進行相對含量計算，公式如下。

w（香氣組分）/（μg/kg）=Sx/S0×20/1 000×0.8×106/m.式中：Sx為組分峰面積；S0為內(nèi)標峰面積；m為樣品質(zhì)量，g；20 為內(nèi)標體積，μL；0.8 為內(nèi)標質(zhì)量濃度，mg/mL；1 000和106為量綱轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，采用SPSS 23.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實生長發(fā)育調(diào)查

如圖1所示，2個品種果實發(fā)育過程中質(zhì)量變化和糖酸積累存在差異，‘南太湖特早’第1 次膨大期結(jié)束早，轉(zhuǎn)色期較‘夏黑’提早7 d，其各時期固酸比均高于‘夏黑’，成熟期較‘夏黑’提早7 d左右。

圖1 ‘南太湖特早’和‘夏黑’果實生長發(fā)育曲線Fig.1 Berry growth and development curves of‘Nantaihutezao’and‘Summer Black’

2.2 成熟果實中香氣物質(zhì)種類與含量

葡萄屬于非呼吸躍變型果實，只有在果實充分成熟時才能表現(xiàn)出其特有的風味。由表1可見，從2個品種的成熟果實中測得了7 大類共52 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。相較于‘夏黑’，‘南太湖特早’果皮和果肉中的總香氣物質(zhì)含量顯著增加，分別增加了53.02%和39.27%，香氣物質(zhì)種類也分別增加了7種和2種。

在2 個品種中，除酮類物質(zhì)在果肉中的總含量高于果皮外，各類揮發(fā)性化合物的總含量都是果皮大于果肉。其中：醛類物質(zhì)是最主要的揮發(fā)性成分，多貢獻草本香氣，在‘夏黑’中達80%以上，顯著高于‘南太湖特早’；萜烯類物質(zhì)貢獻了主要的花果香氣，在‘南太湖特早’果肉中的相對含量達31.81%，顯著高于‘夏黑’；醇、酮、酯、酚及其他物質(zhì)的相對含量均不超過7.5%（表1）。

表1 ‘南太湖特早’和‘夏黑’成熟果實中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)Table 1 Volatile aroma compounds in the ripe berries of‘Nantaihutezao’and‘Summer Black’

2.3 成熟果實中揮發(fā)性特征香氣物質(zhì)

在檢測到的揮發(fā)性化合物中，并非每種物質(zhì)都對葡萄的香氣有貢獻，各物質(zhì)對香氣的貢獻取決于它是否以高于感知閾值的濃度存在。只有OAV≥1的化合物才被認為對香氣有貢獻，OAV值越大表明這種物質(zhì)對香氣的貢獻程度越大。本研究檢測到葡萄成熟果實中對香氣有貢獻的揮發(fā)性香氣物質(zhì)共有13種（表2）。其中，提供花果香氣的酮類、萜烯類（除果肉中的芳樟醇）物質(zhì)和苯乙醛均在‘南太湖特早’中有更高的OAV。

2.4 果實發(fā)育過程中揮發(fā)性特征香氣物質(zhì)含量與種類的變化

如圖2 所示，在2 個品種的果實發(fā)育過程中共測得78種香氣物質(zhì)。其中：有5種醇類、9種酯類、4種醛類、5 種萜烯類、3 種酮類只出現(xiàn)在未成熟的果實中；在成熟果實中檢測到13種特征香氣物質(zhì)。隨著果實的發(fā)育，果皮中特征香氣物質(zhì)含量呈現(xiàn)先快速上升后緩慢下降的變化趨勢。其中，‘南太湖特早’果皮中醛類物質(zhì)的快速積累出現(xiàn)在盛花后45 d，比‘夏黑’提早14 d。果皮中萜烯類物質(zhì)均在盛花后59 d 達到峰值，果實成熟時‘南太湖特早’中萜烯類物質(zhì)的含量比‘夏黑’高91.14%。果肉中特征香氣物質(zhì)的積累沒有明顯規(guī)律，但2 個品種間萜烯類物質(zhì)含量變化有較大差異。在盛花后45～66 d，2 個品種果肉中萜烯類物質(zhì)總含量持續(xù)降低，其在‘夏黑’果肉中的含量比‘南太湖特早’高2 倍以上。但在盛花后73 d時，‘南太湖特早’果肉中萜烯類物質(zhì)含量激增，達198.1 μg/kg，成為成熟果實中的重要呈香物質(zhì)；‘夏黑’果肉中萜烯類物質(zhì)含量則很少，僅有12.6 μg/kg。

酮類物質(zhì)中最重要的呈香物質(zhì)是1-辛烯-3-酮和β-大馬酮，由于香氣閾值低，二者對‘南太湖特早’和‘夏黑’果實的香氣貢獻最大（表2）。從圖3A～B 中可以發(fā)現(xiàn)，這2 種物質(zhì)在‘南太湖特早’果肉中含量的變化相似，整體呈現(xiàn)先降后升的趨勢。盛花后52～66 d，‘夏黑’果肉中這2 種物質(zhì)的含量都顯著高于‘南太湖特早’，但盛花66 d后開始快速下降，成熟時僅分別有4.78和1.30 μg/kg，均低于‘南太湖特早’。

表2 ‘南太湖特早’和‘夏黑’成熟果實中特征香氣物質(zhì)的香氣活性值Table 2 Odor activity value(OAV)of characteristic aroma compounds in the ripe berries of‘Nantaihutezao’and‘Summer Black’

萜烯類物質(zhì)具有令人愉悅的花香和果香，本研究中最重要的萜烯類物質(zhì)是芳樟醇、檸檬烯和香茅醇。從圖3C～E中發(fā)現(xiàn)：芳樟醇和香茅醇在果皮中的含量先上升后下降，在盛花后59 d 時達到峰值；芳樟醇和檸檬烯含量在‘夏黑’果肉中波動下降。值得注意的是，‘南太湖特早’果肉中芳樟醇從盛花后66 d開始便檢測不到。檸檬烯在2個品種果肉中的含量變化符合圖2中萜烯類物質(zhì)總含量的變化趨勢，即盛花后45～66 d 在‘夏黑’中含量更高，但成熟時在‘南太湖特早’中積累更多。

圖2 果實發(fā)育過程中4類特征香氣物質(zhì)含量的變化Fig.2 Changes in the contents of four types of characteristic aroma compounds during the berry development

醛類物質(zhì)通常具有花、葉清香，在果實的整個發(fā)育過程中都是含量最高的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。未轉(zhuǎn)色時期，果皮中順式-3-己烯醛的含量很高，占香氣物質(zhì)總含量的42%以上，但在轉(zhuǎn)色后的果實和未轉(zhuǎn)色時期的果肉中均未檢測到該物質(zhì)。反式-2-己烯醛和己醛含量在果實發(fā)育過程中表現(xiàn)為不同的變化趨勢。從圖3F～G中可知：‘南太湖特早’果皮中反式-2-己烯醛在未轉(zhuǎn)色至盛花后52 d期間快速積累，之后緩慢下降；‘夏黑’果皮中反式-2-己烯醛含量則在盛花后66 d達到峰值。‘南太湖特早’果皮中己醛在盛花后45 d 出現(xiàn)并達到最高值，之后下降；‘夏黑’果皮中己醛則在盛花后59 d出現(xiàn)。轉(zhuǎn)色至成熟期間，反式-2-己烯醛和己醛在果肉中未表現(xiàn)出明顯的積累規(guī)律。

圖3 7種主要特征香氣物質(zhì)在果實發(fā)育過程中的含量變化Fig.3 Changes in the contents of seven main characteristic aroma compounds during the berry development

觀察這7種特征香氣物質(zhì)在果皮中的含量變化可以發(fā)現(xiàn)，除酮類外，其余5種物質(zhì)的含量都在盛花后45～66 d達到峰值，且其峰值在‘南太湖特早’中出現(xiàn)的時間普遍比‘夏黑’早7～14 d，與‘南太湖特早’轉(zhuǎn)色期與成熟期的提前保持一致。

3 討論

葡萄果實中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類包括酯類、醛類、醇類、酮類、萜烯類等，不同品種間各類物質(zhì)含量差異明顯。前人的研究認為，‘巨峰’葡萄屬于歐美雜交種，果實中酯類物質(zhì)的含量及種類較豐富[19-20]；‘夏黑’具有‘巨峰’血統(tǒng)，但果實中醛類物質(zhì)含量較高[18,21]，酯類物質(zhì)含量很少，萜烯類物質(zhì)含量較高，這與在北方栽培的‘夏黑’研究結(jié)果[21]有較大的差異，但與上海栽培的研究結(jié)果[18]相近。推測是浙江與上海一帶的氣候條件及避雨栽培技術對乙酸乙酯等物質(zhì)代謝途徑的強度變化有影響。

與母本‘夏黑’相比，‘南太湖特早’成熟果實中香氣物質(zhì)的種類基本沒有改變，各類香氣物質(zhì)的含量均有提升。果肉中的積累差異主要體現(xiàn)在盛花后45～66 d。結(jié)合果實的糖酸積累、轉(zhuǎn)色情況（相關數(shù)據(jù)未發(fā)表）和特征香氣物質(zhì)總含量的變化可知，在盛花后45～66 d，‘南太湖特早’主要積累花青素苷，‘夏黑’主要積累香氣物質(zhì)。果實發(fā)育后期受溫度、水分等氣候因子的影響，‘夏黑’中高含量的香氣物質(zhì)持續(xù)分解，花青素苷積累緩慢?！咸卦纭ぶ懈黝愊銡馕镔|(zhì)的含量與‘夏黑’相比均較高，最終表現(xiàn)出花果香濃郁、著色好的品種優(yōu)勢。推測新品種‘南太湖特早’由于糖類碳源充足，促進了相關次生代謝產(chǎn)物的積累。從特征香氣物質(zhì)含量來看，推測2 個品種中差異較大的是異戊二烯代謝途徑和脂肪酸代謝途徑。

異戊二烯類香氣是葡萄果實中花果香氣的重要來源。異戊二烯代謝的主要前體物質(zhì)是異戊烯焦磷酸和烯丙基異構體二甲基烯丙基焦磷酸[22]，單萜幾乎完全通過甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（methylerythritol 4-phosphate, MEP）途徑合成[23-24]，倍半萜則多由甲羥戊酸途徑合成[9]。降異戊二烯類物質(zhì)種類多、合成途徑復雜，對葡萄花果香氣貢獻較大，目前研究最多的C13-降異戊二烯類物質(zhì)來源于類胡蘿卜素的降解，底物由MEP途徑合成[25]。本研究中關注的芳樟醇、檸檬烯、香茅醇均屬于單萜類香氣物質(zhì)，來源于MEP 途徑中香葉醇的轉(zhuǎn)化[9]，其在果實生長發(fā)育中的含量變化規(guī)律與前人的研究結(jié)果[26-28]類似，表現(xiàn)為幼果期含量減少，轉(zhuǎn)色期增加，在盛花后59 d最高，之后降低。這可能是由于萜烯類物質(zhì)代謝反應略滯后于果實的快速生長期，進入轉(zhuǎn)色期后，萜烯類物質(zhì)降解或轉(zhuǎn)化為糖苷形態(tài)存在[24,26]?！咸卦纭庵械臋幟氏┖吭谑⒒ê?3 d 突然升高，推測與其合成的關鍵基因VvPin后期表達活躍或自由態(tài)單萜轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)單萜的代謝減緩有關。β-大馬酮屬于C13-降異戊二烯類物質(zhì)，其含量變化在‘夏黑’中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)色期上升，后期快速下降；在‘南太湖特早’果肉中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)色前期快速下降，盛花后45 d 開始緩慢上升，這與張克坤等[26]、MATHIEU 等[29]的研究結(jié)果都不一致，可以在此基礎上研究相關基因是否存在品種間的表達差異。

脂肪酸代謝的主要前體物質(zhì)是亞麻酸和亞油酸，脂氧合酶、脂氫過氧化物裂解酶、乙醇脫氧酶和?；D(zhuǎn)移酶基因家族參與脂肪酸代謝過程中香氣合成的調(diào)控[30]。C6醛含量在整個發(fā)育期都處于高水平狀態(tài)，壬醛、反式-2-壬烯醛等C9化合物則出現(xiàn)較晚。與前人的研究[26,31-32]相比，本研究中反式-2-己烯醛、己醛的含量雖然都表現(xiàn)為幼果發(fā)育期有所減少、轉(zhuǎn)色期增加、果實發(fā)育后期又減少的波動變化趨勢，但C6醛的含量始終處于較高水平，醇類、酯類物質(zhì)含量較少。推測是由脂肪酸裂解支路活躍，而醇脫氫酶和醇?；D(zhuǎn)移酶活性較低造成的。而過多的C6化合物不利于保持葡萄的呈香型特征，其相關機制有待進一步探究。

4 結(jié)論

香氣是葡萄新品種選育中備受關注的重要性狀。與‘夏黑’相比，‘南太湖特早’的果實成熟早、固酸比更高、香氣物質(zhì)種類相似，但香氣物質(zhì)總含量顯著升高，特別是具有花果香的萜烯類和酮類物質(zhì)含量在果肉中提升了233%，遠高于果皮（提升162%）。其中，1-辛烯-3-酮、β-大馬酮和檸檬烯的含量變化規(guī)律在2個品種果肉中有明顯差異：在‘夏黑’中這3類物質(zhì)在果實發(fā)育中期保持高含量，后期快速降解；在‘南太湖特早’中則在中期以低水平增長，后期降解較少，因此，賦予了‘南太湖特早’果實濃郁的花香風味。