蝦青素保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞損傷的最適濃度篩選

任欣慧 ，姚強(qiáng) ，黃慶年 ，朱彥彬 ，王琳 ，張月瑩 ，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心；3.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院）

近年來，隨著公眾對食品衛(wèi)生安全問題的關(guān)注，有關(guān)霉菌毒素污染的問題亟待解決。黃曲霉在自然界中是一種常見的腐生真菌[1]，多見于發(fā)霉的花生，玉米，小麥，油菜籽等農(nóng)作物中[2]，隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，動物飼料中也經(jīng)常能檢測到黃曲霉的存在。一般來說，長期處于濕熱環(huán)境且營養(yǎng)價值豐富的食物更易被黃曲霉污染，且不易去除，滋生毒素危害健康。黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFs）是黃曲霉等一系列霉菌的次級代謝產(chǎn)物[3]，其中AFB1 是已知黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)，并且有著超強(qiáng)的致癌性，其毒性約為 HCN 的 10 倍，As2O3的 68 倍，致癌效應(yīng)約為 N，N-二甲基亞硝胺的 75 倍，1，2，3-三嗪-2，4，6-三胺的416 倍，奶黃油的900 倍[4]，是目前研究最為廣泛且危害最強(qiáng)的一種真菌毒素[5]。AFB1 對人和動物內(nèi)臟器官都有影響，尤其對于肝臟的破壞能力極強(qiáng)，長期低劑量的攝入AFB1 更會誘發(fā)肝癌的產(chǎn)生。有研究表明，AFB1 是引起肝臟壞死、空泡變性、脂肪變性、巨噬細(xì)胞增多和肝細(xì)胞雙核化等組織病理學(xué)改變的最強(qiáng)肝毒劑，此外，還觀察到膽管增生和門靜脈周圍纖維化[6]。隨著研究的不斷深入，霉菌毒素污染得到了初步的控制，但在玉米等農(nóng)作物、獸用飼料中檢測出AFB1 的新聞依舊屢見不鮮[7]，因此，尋找有效手段干預(yù)AFB1 中毒已成為亟待解決的問題。

據(jù)研究表明，AFB1 對肝臟細(xì)胞內(nèi)部會產(chǎn)生損傷，包括肝細(xì)胞的脂質(zhì)損傷和線粒體損傷，嚴(yán)重會導(dǎo)致肝癌，可以發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可能是AFB1 導(dǎo)致肝損傷的一個重要潛在致病因素[8]。另外曾有研究提出，通過在飼料中添加抗氧化劑來提高機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，可以緩解霉菌毒素造成的機(jī)體損傷[9]。因此我們推測，強(qiáng)效抗氧化劑的應(yīng)用可以有效緩解AFB1 對機(jī)體造成的損傷。查閱大量資料后發(fā)現(xiàn)，蝦青素（AST）作為一種脂溶性的物質(zhì)，通常以蛋白質(zhì)、酯化、游離三種形式存在，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)勁的天然抗氧化劑。隨著對蝦青素研究的深入，越來越多的國家同意并批準(zhǔn)了蝦青素可在日常生活中使用，并且發(fā)現(xiàn)，蝦青素的淬滅單線態(tài)氧的能力是其他抗氧化物無法比擬的[10]。蝦青素在進(jìn)入體內(nèi)后，會在組織中積累，并無毒性作用[11]。在大量的體外研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素的強(qiáng)抗氧化能力離不開其穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)，其分子的極性末端可以橫跨細(xì)胞膜，降低膜的通透性，由于提高了細(xì)胞膜的機(jī)械強(qiáng)度，使過氧化物啟動子無法輕易的進(jìn)入胞內(nèi)，從而緩解細(xì)胞的氧化損傷[12]。

研究通過CCK-8 實驗篩選蝦青素和AFB1 最適藥物濃度及時間，建立AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷模型，以此探究蝦青素預(yù)保護(hù)對于AFB1 誘導(dǎo)的AML12 損傷的保護(hù)作用，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

AML12 小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞系，來自實驗室保藏細(xì)胞，經(jīng)鑒定后使用。

1.2 主要儀器試劑

主要儀器：Thermo 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、水浴鍋、高速離心機(jī)、KQ-600DB 型超聲波破碎儀、ELx800 型酶標(biāo)儀、倒置顯微鏡、生物安全柜、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

主要試劑：蝦青素（批號：0000091156，純度＞97%，美國 Sigma 公司），AFB1（批號：2J1J17，純度＞99%，Pribolab 公司），DMEM-F12 培養(yǎng)基（Hyclone 公司），100×青鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、磷酸鹽緩沖液（Biosharp 公司），二甲基亞砜（Solarbio試劑公司），胎牛血清（Clark 公司），胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Gibco 公司），地塞米松（納川生物技術(shù)公司），CCK-8 試劑盒、臺盼藍(lán)溶液（Beyotime 公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

配制完全培養(yǎng)基，500 mL 的DMEM-F12 中內(nèi)包含地塞米松 40 ng·mL-1、10%的 FBS、1%的 ITS 以及1%的100×青鏈霉素混合液。取出液氮中凍存的AML12 細(xì)胞，37 ℃迅速融化，加入雙無培養(yǎng)基以取出凍存液，隨后將其接種至DMEM-F12 完全培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度37 ℃、5%CO2。定時觀察細(xì)胞形態(tài)，更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至90%左右時，進(jìn)行傳代，通過細(xì)胞計數(shù)使細(xì)胞密度保持在1×105個·mL-1，將細(xì)胞鋪至 96 孔細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞分組

將細(xì)胞分4 組：溶劑對照組（C 組）、藥物模型組 （AFB1 組，濃度梯度分 別為 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1）、蝦青素組（AST 組，濃度梯度分別為 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1）、蝦青素+黃曲霉毒素B （AST+AFB1 組，AST 的濃度梯度分別為 20、50、100、150、200 μmol·L-1，AFB1 濃度為 20 μmol·L-1）。C 組為0.01% DMSO 溶劑對照組。每個濃度梯度重復(fù)5 次。

1.3.3 CCK-8 法檢測不同濃度時間AFB1 對AML12細(xì)胞影響

參照“1.3.1”的步驟在96 孔板中進(jìn)行細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)體系200 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、5% CO2。用 DMSO（細(xì)胞級）溶解 AFB1 粉末，配置成1 mg·mL-1儲備液，臨用前用DMEM-F12 雙無培養(yǎng)基稀釋，配置成 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1共6 個濃度梯度。

觀察細(xì)胞形態(tài)，達(dá)到試驗標(biāo)準(zhǔn)后，棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗，隨后加入 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1AFB1 的培養(yǎng)基，分別進(jìn)行 6、12、18、24 h 的處理。處理結(jié)束后，棄96 孔板中殘留的培養(yǎng)液，PBS 清洗兩次后，參照CCK-8 說明書進(jìn)行實驗。100 μL 的培養(yǎng)體系中加入 10 μL 的 CCK-8 溶液；200 μL 的培養(yǎng)體系中加入 20 μL 的 CCK-8 溶液，依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1～2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度，以溶劑對照組作為空白組，通過計算各組間吸光度的比值，來比較在不同時間下不同濃度的AFB1 藥物的刺激對于AML12 細(xì)胞存在怎樣的影響，確定AFB1 對細(xì)胞半數(shù)致死劑量。

1.3.4 CCK-8 法檢測不同濃度蝦青素對AML12 細(xì)胞影響

參照“1.3.1”的步驟進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。用DMSO（細(xì)胞級）溶解蝦青素，配置成5 mg·mL-1的蝦青素儲備液，使用前用DMEM-F12 雙無培養(yǎng)液稀釋，配置成0、20、50、100、150、200 μmol·L-1共 6 個濃度梯度。

觀察細(xì)胞形態(tài)，達(dá)到試驗標(biāo)準(zhǔn)后，棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗，隨后加入 0、20、50、100、150、200 μmol·L-1蝦青素的培養(yǎng)基。處理結(jié)束后，棄96 孔板中殘留的培養(yǎng)液，PBS 清洗兩次后，參照CCK-8 說明書進(jìn)行實驗。在加入CCK-8 溶液后，依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1～2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度，通過計算各組間的吸光度來判斷蝦青素對于AML12 細(xì)胞的影響，主要判斷蝦青素對細(xì)胞是否存在損傷，來確定蝦青素對AML12 細(xì)胞處理的安全濃度范圍。

1.3.5 CCK-8 法篩選蝦青素、AFB1 最適濃度時間范圍

依舊參照“1.3.1”的步驟進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，達(dá)到試驗標(biāo)準(zhǔn)后，棄去96 孔板中殘留的培養(yǎng)基，用 PBS 清洗，加入 20、50、100、150、200 μmol·L-1的不同濃度的蝦青素，分別對細(xì)胞進(jìn)行3、6、9、12 h 四個不同時間的培養(yǎng)。時間結(jié)束后，棄掉96 孔板中殘留培養(yǎng)液，PBS 洗兩次，再加入含有20 μmol·L-1AFB1 的培養(yǎng)液，按要求在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后，棄96 孔板中殘留培養(yǎng)液，參照CCK-8 說明書進(jìn)行實驗。在加入CCK-8 溶液后，依照培養(yǎng)細(xì)胞的條件在培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)1～2 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度，以觀察AFB1 對AML12 細(xì)胞的損傷是否會因為蝦青素的預(yù)保護(hù)得到緩解，根據(jù)吸光度來確定最佳處理濃度范圍及時間。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

將收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后使用SPSS 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用Duncan's 法對各處理組進(jìn)行多重比較分析，對符合樣本運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件測試正態(tài)性，單因素方差分析。整理數(shù)據(jù)，匯成柱狀圖，以便查看。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度時間AFB1 對AML12 細(xì)胞影響

對 AML12 細(xì)胞進(jìn)行 0、5、10、15、20、40 μmol·L-1不同濃度及 6、12、18、24 h 不同時間的 AFB1 作用于細(xì)胞，通過測定各組吸光度值，來計算AML12 細(xì)胞活力。結(jié)果如圖1 所示：隨著各組用藥濃度的增加，各處理時間下的細(xì)胞活性呈現(xiàn)出下降趨勢。AFB1 濃度為 10、15、20、40 μmol·L-1作用 6、12、18 h 后，細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性下降趨勢（P＜0.05）。在藥物作用24 h 后，5、10、15、20、40 μmol·L-1濃度下對細(xì)胞都有明顯的抑制作用（P＜0.05），這種趨勢在 20 μmol·L-1作用24 h 后逐漸趨于平緩。在經(jīng)過CCK-8 檢測得到OD 值后，經(jīng)過換算得到AFB1 對細(xì)胞的半數(shù)致死量濃度為 20 μmol·L-1。因此確定 24 h、濃度為 20 μmol·L-1的AFB1 作為實驗的最佳條件。

圖1 不同濃度時間AFB1 對AML12 細(xì)胞影響Fig.1 The effect of AFB1 at different concentration and time on AML12

2.2 不同濃度蝦青素對AML12 細(xì)胞影響

為了篩選出蝦青素對AML12 細(xì)胞的安全濃度范圍，用不同濃度梯度的蝦青素對AML12 細(xì)胞進(jìn)行刺激，濃度分別為：0、20、50、100、150、200 μmol·L-1的蝦青素，作用于細(xì)胞24 h。通過CCK-8 法測定AML12 細(xì)胞活力變化。從結(jié)果可以看出，與未加入蝦青素的對照組比較，蝦青素的劑量在20、50、100、150 μmol·L-1時，細(xì)胞活性未見明顯的變化，這說明在150 μmol·L-1范圍前濃度梯度的蝦青素對細(xì)胞沒有明顯的損傷。而在200 μmol·L-1的濃度作用時，細(xì)胞數(shù)量有所降低，這說明200 μmol·L-1的蝦青素對AML12 細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，為了排除藥物對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，最終將藥物篩選的劑量范圍控制在 150 μmol·L-1以內(nèi)較為安全。

2.3 蝦青素、AFB1 最適濃度時間范圍

前期實驗確定了建立細(xì)胞模型中AFB1 最佳刺激濃度及時間，以及相對安全的蝦青素濃度范圍，為了進(jìn)一步確定蝦青素對AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞的劑量，進(jìn)行后續(xù)實驗。為了篩選蝦青素保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞損傷的劑量梯度及保護(hù)時間，在用0、20、50、100、150 μmol·L-1的蝦青素刺激細(xì)胞 3、6、9、12 h 后，加入 20 μmol·L-1的 AFB1 培養(yǎng) 24 h。通過CCK-8 法測定細(xì)胞活力變化。從結(jié)果可以看出，在蝦青素預(yù)保護(hù)的細(xì)胞中，AFB1 對于AML12 細(xì)胞的抑制作用得到了明顯的改善。蝦青素預(yù)保護(hù)3、6 h 時，細(xì)胞活性呈劑量依賴性的增長（P＜0.05）；蝦青素預(yù)保護(hù) 9、12 h 后，這種增長在蝦青素濃度為 150 μmol·L-1時有降低，且在蝦青素預(yù)保護(hù)9 h 后組間差異明顯增加。綜合以上考慮，最終確定蝦青素預(yù)保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞的時間為3 h，劑量梯度為20、50、100 μmol·L-1。

圖2 不同濃度蝦青素對AML12 細(xì)胞影響Fig.2 The effect of AST at different concentration on AML12

3 討論與結(jié)論

AFB1 在動物飼料中存在十分廣泛，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。日常生活中，也經(jīng)常能看到在玉米、花生等農(nóng)作物中檢測出黃曲霉毒素的新聞，這一切對人類和動物健康都有著非常大的威脅。通過整理對AFB1 的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，其在污染的食物和飼料中性質(zhì)十分穩(wěn)定，耐高溫、耐酸且不溶于水，存放20 年之久依舊可以檢出[13]。不難看出，想要徹底清除AFB1 是一項困難艱巨的任務(wù)。在通過對流行病學(xué)進(jìn)行研究整理后發(fā)現(xiàn)，AFB1 是造成肝癌發(fā)生的一大罪魁禍?zhǔn)譡14-15]，因為肝臟是AFB1 進(jìn)入人體后最主要的靶器官，長期低劑量的暴露在AFB1 中會引起肝臟膽小管增生、脂肪變性等病癥，甚至發(fā)生癌變[16]。機(jī)體在攝入AFB1 后，進(jìn)行第一關(guān)卡效應(yīng)，經(jīng)由消化道的十二指腸進(jìn)行吸收，進(jìn)入肝臟后，再由肝細(xì)胞相關(guān)代謝酶將其轉(zhuǎn)化為AFB1-8，9 環(huán)氧化物，即AFBO，是AFB1 造成機(jī)體紊亂甚至致癌作用中最主要的原因[17]。為了盡可能的模擬AFB1 在體外吸收代謝的環(huán)境，實驗中選擇AML12 小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞系作為實驗體，利用藥物對AML12 小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，研究結(jié)果與預(yù)期一致，AFB1 對細(xì)胞造成了損傷，在5、10、15、20、40 μmol·L-1的 AFB1 作用不同時間時對AML12 細(xì)胞都有不同程度的抑制作用，并在20 μmol·L-1作用 24 h 時達(dá)到半數(shù)致死量，從而證實了后續(xù)實驗的可行性。

圖3 蝦青素、AFB1 最適濃度時間范圍Fig.3 Optimal concentration time range of AST and AFB1

有研究證實，AFB1 會參與機(jī)體內(nèi)部的代謝過程，并在此過程中通過引發(fā)肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激[18]，使機(jī)體受到氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS 的刺激，引起機(jī)體損傷。根據(jù)Chen 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，在AFB1 誘導(dǎo)的毒性中，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能是發(fā)揮關(guān)鍵性作用的原因，AFB1 的促氧化能力在一定程度上加強(qiáng)了其毒性能力。由此做出推斷，抗氧化物的應(yīng)用可以緩解甚至抑制AFB1 誘發(fā)的肝毒性，尤其是自然界中的天然抗氧化產(chǎn)物。

在20 世紀(jì)80 年代，科學(xué)家們對蝦青素生理功能的研究逐漸深入，從此蝦青素作為自然界中最強(qiáng)的抗氧化物出現(xiàn)在大眾面前。石麗麗等[20]對蝦青素進(jìn)行了毒理學(xué)安全性評價，從一系列的毒理學(xué)評價試驗結(jié)果來看，蝦青素對于機(jī)體無明顯的毒副作用。在通過利用不同濃度蝦青素對AML12 細(xì)胞進(jìn)行刺激后，蝦青素對于細(xì)胞的影響的雙向的，適當(dāng)?shù)乃幬餄舛群吞幚頃r間，會促進(jìn)AML12 細(xì)胞增殖，濃度不超過150 μmol·L-1的蝦青素對細(xì)胞無明顯毒副作用；而在蝦青素濃度為 200 μmol·L-1時，對 AML12 細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，藥物濃度過大對細(xì)胞仍會造成部分損傷。但 150 μmol·L-1到 200 μmol·L-1濃度之間的蝦青素是否有影響尚未可知，還需要進(jìn)一步的探究。對比來看，體外實驗只能作為體內(nèi)實驗的前期基礎(chǔ)，更精準(zhǔn)的結(jié)果必須進(jìn)行一定量的體內(nèi)實驗，才能更為準(zhǔn)確。

蝦青素作為天然的抗氧化劑，安全綠色無公害，比目前絕大多數(shù)抗氧化劑都有優(yōu)勢[21]。通過利用蝦青素對細(xì)胞進(jìn)行體外實驗，發(fā)現(xiàn)蝦青素的抗氧化作用增強(qiáng)了細(xì)胞整體的抗氧化能力，對氧化應(yīng)激生成的大量ROS 有一定的抑制作用，以此來減輕自由基所造成的損傷[22-23]。根據(jù)實驗結(jié)果得出結(jié)論，蝦青素能夠細(xì)胞以減輕AFB1 造成的損傷。在不同濃度及時間的蝦青素預(yù)處理AML12 細(xì)胞后，再利用20 μmol·L-1的AFB1 刺激24 h，可以看出細(xì)胞存活率有了明顯的上升，因此將最適藥物濃度篩選實驗中蝦青素濃度設(shè)置為 20、50、100 μmol·L-1。CCK-8 實驗結(jié)果顯示，AFB1 組的細(xì)胞OD 值低于AST+AFB1 處理組，證明了蝦青素可以保護(hù)細(xì)胞因AFB1 造成的損傷，為今后研究提供了理論支持。

綜上所述，AFB1 的半數(shù)致死量為 20 μmol·L-1，作用時間 24 h；20、50、100 μmol·L-1的蝦青素預(yù)處理細(xì)胞3 h 后，可以較好的保護(hù)AFB1 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，這為今后進(jìn)一步研究蝦青素用于預(yù)防AFB1 所致的肝損傷打下了基礎(chǔ)。