兩株桿狀細菌的分離及其風化能力初探

劉濤，張爽，王偉東，晏磊

（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術(shù)學院/黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點實驗室，大慶 163319）

五大連池火山群位于黑龍江省黑河地區(qū)五大連池市，是我國東部地區(qū)著名的第四紀火山群之一。老黑山是一座斯通博利型活火山，第一次噴發(fā)時間為1720 年1 月至1721 年3 月，最近一次噴發(fā)時間是1776 年，是五大連池火山帶最年輕的火山之一，地質(zhì)和生物的演變速度相對比較快[1-2]。老黑山中火山石的主要類型為鉀質(zhì)玄武巖，其主要成分包括二氧化硅、氧化鋁、氧化鐵、氧化亞鐵、氧化鈣、氧化鉀等。老黑山屬于溫帶大陸性季風氣候區(qū)。年平均氣溫在-0.5 ℃左右，無霜期有121 d，年平均降水量476.33 mm，年平均相對濕度69.2%[3]。由于老黑山這一貧瘠而獨特的環(huán)境與地球早期環(huán)境相似，致使老黑山成為巖石風化、地球早期土壤形成等科學研究的理想場地。

火山石風化是指暴露在山體表面的火山石，在各種環(huán)境因素（如風、雨水、太陽等）及生物的影響下發(fā)生的風化作用。火山石風化是一種非常重要的地質(zhì)變化過程，是巖石向土壤演化的前提，也是土壤中礦物元素的重要來源之一。風化作用主要包括物理風化、化學風化、和生物風化。物理風化指在溫度、濕度、壓力等因素的作用下，使巖石礦物發(fā)生崩碎的現(xiàn)象，包括風蝕、晶鹽風化、冷熱風化、干濕風化等。不同于物理風化，化學風化可以使巖石礦物的化學組分發(fā)生變化，其風化方式有溶解、水解、碳酸化作用、氧化還原反應等[4]。生物風化主要體現(xiàn)在生物活動加劇巖石的物理或化學風化作用。細菌風化火山石的機制非常復雜，包括有機酸的腐蝕作用、螯合物的螯合作用、氧化還原作用、生物膜的作用等。有研究表明鈣長石的溶解與細菌產(chǎn)生的有機酸有一定的相關性[5]，F(xiàn)e、Al 等[6]元素可以與有機酸形成絡合物，降低陽離子濃度，從而改變風化反應的動力學條件，進而促使礦物元素溶出。在缺鐵環(huán)境下，一些細菌可利用鐵載體螯合Fe3+，從而通過破壞礦物的晶格的方式加快礦物風化[7]。細菌通過與礦物中的含鐵氧化物進行樣化還原作用獲得自身生長代謝所需要的營養(yǎng)，從而破壞礦物的晶格[8-9]。細菌產(chǎn)生的生物膜對有機酸和一些無機離子具有吸附作用，有利于細菌從礦物中獲取營養(yǎng)，同時增加了礦物表面的持水作用，促進巖石的風化[10-11]。

研究表明，芽孢桿菌屬細菌對巖石風化具有促進作用 ，Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus aerophilus 等芽孢桿菌對鉀質(zhì)粗面巖、硅酸鹽、富鉀頁巖、鉀長石等巖石具有一定的生物風化作用[12-13]。而對于金黃桿菌屬細菌的風化能力研究相對較少，有報道稱部分金黃桿菌屬細菌對重金屬有較強的耐受性[14]，少數(shù)金黃桿菌屬細菌（如Chryseobacterium sp.，保藏號：CCTCC M2017810）對巖石礦物等有一定的風化作用[15]。細菌對火山石的風化作用是地表及其附近發(fā)生的最重要的地球化學現(xiàn)象之一，促進了土壤的形成，是重要的地質(zhì)化學現(xiàn)象之一，具有重要的研究意義。

基于上述問題，研究選擇老黑山火山石為研究對象，采用平板分離和16S rRNA 基因測序的方法分離得到芽孢桿菌和金黃桿菌，研究其生理生化特性，及在合適生長因素下對火山石的風化情況，為探究火山石風化為土壤的微生物過程提供基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品

火山石樣品來自黑龍江五大連池老黑山。

1.2 主要試劑儀器

主要儀器：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9080MBE型，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），空氣浴搖床（HZQ-C 型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），PCR 儀（2720 Thermal Cycler），酶標儀（MB-580型，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司），紫外可見分光光度計（721 型，中國上海菁華科技儀器公司），電泳儀（JY300C 型，北京君意東方電泳設備有限公司），鹽度計（CNY28 型，杭州陸恒生物科技有限公司）。

培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基，10 g·L-1NaCl，10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母浸粉，pH 7.0。LB 半固體培養(yǎng)基，10 g·L-1NaCl，10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母浸粉，12 g·L-1瓊脂，pH 7.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 細菌分離

取 5 g 火山石置于 50 mL 無菌水中，120 rpm，30 ℃，富集2 h。

稀釋涂布：將富集液稀釋至 10-1，10-2，10-3，10-4倍，分別取200 μL 稀釋液涂布于LB 半固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分離劃線：挑取單菌落劃線分離，分離3 次以上。

1.3.2 細菌的DNA 提取與PCR 擴增

四季平均相對濕度36.80%，春季22.18%，夏季32.15%，秋季46.78%，冬季46.49%，觀測期間最高99.90%，最低3.68%。

DNA 提取試劑盒法：依照試劑盒說明書的步驟提取細菌DNA。

PCR 總體系為 25 μL，ddH2O 10.5 μL，上下引物各 0.5 μL，2 x Taq Mix 12.5 μL，細菌 DNA 1 μL。PCR 反應程序如表1 所示。

表1 PCR 反應程序Table 1 PCR procedure

1.3.3 細菌的分子鑒定

PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果使用DNAMAN 8 軟件進行拼接后，應用 EZ BioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/identify）對擴增菌株的16S rRNA 基因序列比對，并在比對結(jié)果中下載標準菌株序列，利用MEGA X（https：//www.megasoftware.net/）建立系統(tǒng)發(fā)育樹。將細菌序列上傳至NCBI 中GenBank 數(shù)據(jù)庫，獲取菌株序列登錄號。

1.3.4 細菌生長的理化因素分析

分別配制不同鹽度（5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g·L-1）、不同溫度（15、25、28、30、35 ℃）、不同 pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的 LB 培養(yǎng)基，接種不同接種量（0.5%、1%、2%、4%、8%） 的 Bacillus zanthoxyli LHS-LT20（B.zanthoxyli LHS-LT20），每個處理3 個重復。分別配制不同鹽度（5.0、7.5、10.01、12.5、15.0 g·L-1）、不同溫度（25、28、30、35、40 ℃）、不同 pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的 LB 培養(yǎng)基，接種不同接種量（0.5%、1%、2、4%、8%）的 Chryseobacterium nepalense LHS-LT47（C.nepalense LHS-LT47），每個處理3 個重復。以LB培養(yǎng)基為對照。以培養(yǎng)相同時間的菌液OD600 為指標來考察各因素對B.zanthoxyli LHS -LT20 和C.nepalense LHS-LT47 的影響.

1.3.5 細菌風化能力測定

將火山石粉碎過篩至0.5~1.5 mm 左右，自來水清洗去除灰塵等雜質(zhì)，蒸餾水沖洗3 次以上，至水溶液不渾濁，于60 ℃干燥箱中干燥恒重，紫外滅菌2 h，備用。

取1.000 g 火山石粉末裝入100 mL 錐形瓶，加入 50 mL 的 LB 培養(yǎng)基，121 ℃，20 min 滅菌備用。將B.zanthoxyli LHS-LT20 和 C.nepalense LHS-LT47 的對數(shù)期菌液離心收集菌體，LB 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600 至0.8 左右。接種 B.zanthoxyli LHS-LT20 和 C.nepalense LHS-LT47，以LB 培養(yǎng)基為對照，接種量為1%，120 rpm，30 ℃，培養(yǎng) 3、6、9、12、15 d，每個處理 3 個重復。將培養(yǎng)基靜止10 min，吸取上清液2 000 rpm 離心5 min 去除菌體對吸光度干擾，吸取上清液至5 mL離心管中，編號制得待測液。

火山石風化過程中，培養(yǎng)基中將會溶出一部分的 Fe、Ca、Al、Si、K 等元素。研究以培養(yǎng)基中 Fe 濃度反應火山石的風化風化程度，并采用鄰菲羅啉法檢測培養(yǎng)基中Fe 濃度[16-19]。以硫酸鹽鐵銨配制不同濃度Fe 標準液，分別取1 mL 不同濃度的標準液，依次加入10%鹽酸羥胺1 mL，醋酸—醋酸鈉（pH4.6）緩沖液5 mL，0.5%的鄰菲羅啉2 mL，放置15 min 后，在510 nm 波長紫外分光光度計下，測定吸光度，得標準曲線 y=0.191 2 x+0.016 25，R2=0.999 5。取 1 mL 待測液，依次加入10%鹽酸羥胺1 mL，醋酸—醋酸鈉（pH4.6）緩沖液5 mL，0.5%的鄰菲羅啉2 mL，放置15 min 后，在510 nm 波長紫外分光光度計下，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算待測液中Fe 濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用 SPSS 26（https：//www.ibm.com/） 對 OD600和Fe 濃度等數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Duncan，新復極差檢驗），并采用 Origin 2018（https：//www.originlab.com/）對菌液的OD600 和Fe 濃度等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離鑒定

老黑山火山石樣品經(jīng)平板分離純化后得到兩株細菌，B.zanthoxyli LHS-LT20 菌落呈淡黃色圓形，表面光滑，邊緣完整，菌落直徑0.9~1.5 mm（圖1a）；C.nepalense LHS-LT47 菌落為橙色圓形，表面光滑，邊緣完整，菌落直徑為1.0~1.8 mm（圖1b）。將分離菌株 B.zanthoxyli LHS-LT20、C.nepalense LHS-LT47 的PCR 產(chǎn)物進行16S rRNA 雙端測序，測序結(jié)果使用DNAMAN 8 軟件拼接后得到長度分別為1 467 bp（GC 含量為 53.72%） 和 1 422 bp （GC 含量為50.07%） 的兩條序列。將B.zanthoxyli LHS-LT20、C.nepalense LHS-LT47 序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫獲得登錄號NW535242 和NW535243。

圖1 菌落形態(tài)（a：B.zanthoxyli LHS-LT20；b：C.nepalense LHS-LT47）Fig.1 Colonial morphology（a：B.zanthoxyli LHS-LT20；b：C.nepalense LHS-LT47）

將B.zanthoxyli LHS-LT20 序列提交至EZ Bio－Cloud 中的16S-based ID 比對可知，菌株B.zanthoxyli LHS-LT20 與Bacillus zanthoxyli 1433 相似度最高，為99.16%，登錄號為KX865140；同時與Bacillus megaterium NBRC 15308（登錄號：JJMH01000057）和Bacillus flexus NBRC 15715（登錄號：BCVD01000224）親緣性較高，相似度高達98.56%和97.54%。以16S rRNA 同源性為基礎采用鄰接法構(gòu)建包括10 株Bacillus 屬標準菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2a 可知，B.zanthoxyli LHS-LT20 與芽孢桿菌屬細菌同源性較高。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹（a：B.zanthoxyli LHS-LT20 的系統(tǒng)發(fā)育樹；b：C.nepalense LHS-LT47 的系統(tǒng)發(fā)育樹）Fig.2 Phylogenetic tree（a：Phylogenetic tree of B.zanthoxyli LHS-LT20；b：Phylogenetic tree of C.nepalense LHS-LT47）

將C.nepalense LHS-LT47 序列進行比對可知，菌株 C.nepalense LHS -LT47 與 Chryseobacterium nepalense C-5-3 相似度最高，為97.95%，登錄號為KX129820；同時與Chryseobacterium takakiae DSM 26898（登錄號：jgi.1107755）和 Chryseobacterium taiwanense BCRC 17412（登錄號：DQ318789）的相似度較高，分別為96.6%和96.44%。下載同源性較高標準株序列共16 條，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2b 可知，C.nepalense LHS-LT47 與金黃桿菌屬和Epilithonimonas 屬的親緣關系較高。

2.2 細菌生長的理化因素分析

培養(yǎng)10 h 后，將在不同生長因素培養(yǎng)的菌液移至96 孔板，使用酶標儀于600 nm 下檢測菌液的吸光度，下B.zanthoxyli LHS-LT20 的菌液OD600 如圖3 所示。B.zanthoxyli LHS-LT20 的菌液 OD600 隨鹽度和pH 變化先上升后下降，在鹽度為7.5 g·L-1和pH 為 7.5 時顯著高于其他鹽度和 pH（圖 3a、c）；在溫度為30 ℃時菌液的OD600 顯著高于其他溫度（圖3b），有文獻報道B.zanthoxyli 1443 最適生長溫度為28~32 ℃，最適 pH 為 6.0~7.0，鹽度為 0~30 g·L-1，其生長習性與研究成果相似[20]。接種量為1%時OD600 最高。綜上，B.zanthoxyli LHS-LT20 在鹽度為 7.5 g·L-1，溫度為30℃，pH 為7.5，接種量為1%的條件下生長繁殖較快。

圖3 不同因素下B.zanthoxyli LHS-LT20 的生長情況Fig.3 Growth of B.zanthoxyli LHS-LT20 under different factors

培養(yǎng)10 h 后，不同生長因素下C.nepalense LHS-LT47 的 OD600 如圖 4 所示。C.nepalense LHSLT47 的 OD600 在鹽度為 12.5 g·L-1和 pH 為 7.5 時顯著高于其他鹽度和 pH（圖 4a、c）；菌液OD600 在培養(yǎng)溫度 35℃時顯著高于 25、28、30 ℃時（圖 4b）；接種量在2%時，菌液OD600 顯著高于接種量為0.5%和1%時（圖4d）。有研究表明，一株分離自大熊貓獸舍的金黃桿菌Chryseobacterium chengduensis sp.nov.（CCTCC AB2015133）在鹽度為0~20 g·L-1，溫度為28~30 ℃，pH 為 7.0~8.0 的條件下生長情況較好[21]。綜上，C.nepalense LHS-LT47 在鹽度為 12.5 g·L-1，溫度為35 ℃，pH 為7.5，接種量為2%的條件下生長繁殖較快。

圖4 不同因素下的C.nepalense LHS-LT47 的生長情況Fig.4 Growth of C.nepalense LHS-LT47 under different factors

2.3 兩株細菌風化能力研究

以火山石中溶出的Fe 體現(xiàn)火山石風化程度，即培養(yǎng)基中Fe 濃度表示火山石的風化程度。將不同風化時間菌液的A510帶入標準方程（y=0.191 2 x+0.016 25，R2=0.999 5）計算得到菌液的Fe 濃度。統(tǒng)計分析后得到風化過程中Fe 濃度變化如圖4 所示。結(jié)果表明，在風化過程中試驗組培養(yǎng)基中Fe 濃度明顯高于對照組，B.zanthoxyli LHS-LT20、C.nepalense LHS-LT47均具有一定風化能力。其中，B.zanthoxyli LHS-LT20的初始風化速度略高于對照組，在3 d 時Fe 濃度達到0.18 mg·L-1；在3～6 d 火山石風化速度變化不顯著；在 6～12 d 風化速度顯著提升，12～15 d 火山石風化速度趨于平緩且不顯著，15 d 時Fe 濃度達到0.34 mg·L-1，整個風化過程中培養(yǎng)基的 Fe 濃度呈“S”趨勢Fe 濃度變化不顯著。C.nepalense LHS-LT47 在3 d 時菌液中的 Fe 濃度達到了 0.62 mg·L-1；3～6 d 火山石風化速度逐漸降低；在6～12 d 時，F(xiàn)e 濃度僅從0.74 mg·L-1上升至 0.80 mg·L-1，且 Fe 濃度變化不顯著；12 d 后 Fe 濃度開始劇烈上升，15 d 時 Fe 濃度高達1.24 mg·L-1，其在 15 d 時明顯高于 B.zanthoxyli LHS-LT20 和對照組。

3 討論

火山極端環(huán)境中的火山石風化細菌種類及含量較低，但研究利用平板分離純化和16S rRNA 測序鑒定鑒定技術(shù)出兩株細菌屬于芽孢桿菌和金黃桿菌屬，經(jīng)EZ BioCloud 中參考菌株的同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析確定了兩株細菌的種屬。B.zanthoxyli LHS-LT20 屬于芽孢桿菌屬，與Bacillus megaterium NBRC 15308 同源性較高（圖 2a）；B.zanthoxyli LHSLT20 的生長繁殖對鹽度變化不敏感（圖3a），對溫度、pH 變化較敏感（圖 3b、c），與同屬的 B.zanthoxyli 1443 生長習性相似。C.nepalense LHS-LT47 為金黃桿菌屬，與Chryseobacterium takakiae DSM 26898 同源性較高（圖2b）；C.nepalense LHS-LT47 的生長繁殖對鹽度、溫度、pH 變化敏感（圖 4a、b、c），生長習性與同屬的Chryseobacterium chengduensis sp.nov（.保藏號：CCTCC AB2015133）相似。接種量對兩株菌生長發(fā)育影響較?。▓D3d、圖4d）。

研究發(fā)現(xiàn)，B.zanthoxyli LHS-LT20 的初始風化速度略高于對照組，在9 d 后風化速度開始加快，15 d后Fe 濃度達到對照組1.8 倍以上（圖5）。有研究表明，Bacillus cereus、Bacillus aryabhattai、Bacillus aryabhattai、Bacillus anthracis、Bacillus megaterium、Bacillus thuringiensis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、Bacillus aerophilus、Bacillus tequilensis、Bacillus mucilaginosus 等[22-24]芽孢桿菌對鉀質(zhì)粗面巖、硅酸鹽、富鉀頁巖、鉀長石等巖石具有一定的生物風化作用。從鉀質(zhì)粗面巖中分離得到的一些Bacillus megaterium 具有解磷的能力，可以風化煤矸石、磷礦石等巖石[22，25]。B.zanthoxyli LHS-LT20 與 Bacillus megaterium 同源性極高，風化能力相似，二者可能具有相同的風化相關基因以及相同的風化機制。C.nepalense LHS-LT47 的初始風化速度較快，在6～12 d 時風化速度趨于平緩，在12 d 后風化速度顯著提升（圖5）。推測0～3 d 菌體大量增殖，加快了火山石的風化速度，加速了火山石中Fe 的溶出；在3～12 d，C.nepalense LHS-LT47 大量增殖達到穩(wěn)定期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分大量消耗，菌體及其代謝物大量附著在火山石表面，減慢了火山石的風化速度。在12 d 后，經(jīng)多日風化作用火山石表面發(fā)生裂解，大大增加接觸面積，從而導致火山石風化加劇。綜上所述，B.zanthoxyli LHS-LT20 和 C.nepalense LHS-LT47均具有一定風化能力。15 d 時C.nepalense LHS-LT47培養(yǎng)基中Fe 濃度約為B.zanthoxyli LHS-LT20 培養(yǎng)基中Fe 濃度的3.7 倍，是對照組Fe 濃度的6.7 倍。有研究表明，金黃桿菌（保藏號：CGMCC 17564）對鉻、錳、銅等重金屬有吸附作用（一種具有重金屬抗性的金黃桿菌及其應用），金黃桿菌（保藏號：CCTCC M2017810）對煤矸石中的鉀、磷、硅、鈣、硫等元素有較好解離作用，煤矸石中的鉀、硅、鈣等成分與老黑山鉀質(zhì)玄武巖的組成相似，推測C.nepalense LHS-LT47 對火山石的較快的風化作用與金黃桿菌的解鉀、解硅、解鈣能力有關，其對火山石風化能力及風化機制有待進一步研究。

圖5 風化過程中LB 培養(yǎng)基中Fe 濃度Fig.5 Iron concentration in LB medium during weathering

4 結(jié)論

（1）研究通過平板分離和16S rRNA 基因測序技術(shù)鑒定出一株芽孢桿菌和一株金黃桿菌，并通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析出B.zanthoxyli LHS-LT20、C.nepalense LHS-LT47 和其他具有風化能力的同屬細菌的親緣性和遺傳進化規(guī)律。

（2）風化能力測定結(jié)果顯示B.zanthoxyli LHSLT20、C.nepalense LHS-LT47 均具有一定的風化能力。C.nepalense LHS-LT47 的風化能力明顯高于B.zanthoxyli LHS-LT20，且 C.nepalense LHS-LT47 在15 d 時仍具有較高的風化能力，培養(yǎng)基中Fe 溶出量是對照組的6.7 倍。