雙交聯(lián)高強(qiáng)度絲蛋白水凝膠的制備與生物學(xué)性能研究

杜林 陸雯麗 張曉旭 顧芬

絲素蛋白制成的材料具有高度可調(diào)節(jié)的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中得到了廣泛探索[1-3]。絲素蛋白已被生物工程化為一系列組織，用于再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并已被生物工程化為3D 組織模型，用于在體外測(cè)試藥物組合和研究疾病進(jìn)展[4]。使用最廣泛的絲素蛋白是從家蠶中分離出來(lái)的，具有較低的免疫原性和細(xì)胞毒性[1]。

水凝膠是一種高度水化的聚合物網(wǎng)絡(luò)，可以使用多種方法使絲素蛋白水溶液凝膠化，其中一種制備絲素蛋白水凝膠的方法是通過(guò)化學(xué)交聯(lián)。雖然絲素聚合物鏈主要由非反應(yīng)性氨基酸和甘氨酸組成，但其確實(shí)含有酚性酪氨酸殘基（5.3%）[5]，可通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和過(guò)氧化氫（H2O2）催化，形成雙酪氨酸交聯(lián)[6]。這種酶（HRP/H2O2）交聯(lián)系統(tǒng)曾用于制備具有高彈性和可調(diào)剛度的絲素蛋白水凝膠，可通過(guò)蛋白質(zhì)濃度、分子量和溶劑組成進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在模擬體內(nèi)環(huán)境（37 ℃，PBS）中培養(yǎng)時(shí)，HRP/H2O2制備的RSF 水凝膠會(huì)隨著時(shí)間的推移轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z，比原始水凝膠弱得多[8]；而在低溫條件下，酶交聯(lián)的絲蛋白水凝膠會(huì)經(jīng)歷自發(fā)的無(wú)規(guī)α-螺旋到β-折疊的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致水凝膠剛度隨時(shí)間逐漸增加[9]，這使得酶交聯(lián)水凝膠在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有不可預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)。這表明HRP 交聯(lián)RSF 水凝膠不夠穩(wěn)定，可能是由于部分RSF 鏈段在凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)仍保持可移動(dòng)[10]。此外，還可以通過(guò)超聲波處理、pH調(diào)節(jié)、離心、電刺激以及通過(guò)添加極性化合物，如多元醇或表面活性劑誘導(dǎo)絲蛋白水凝膠形成[11-14]。所有這些方法都依賴(lài)于絲素蛋白鏈從無(wú)規(guī)卷曲到β-折疊的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。絲素蛋白鏈的疏水區(qū)域之間形成氫鍵，導(dǎo)致聚合物鏈重新排列和蛋白質(zhì)凝膠化[3]。因此，可引入乙醇來(lái)對(duì)酶促預(yù)交聯(lián)絲蛋白水凝膠進(jìn)行后處理。

首先，利用HRP 酶促預(yù)交聯(lián)絲蛋白水凝膠形成雙酪氨酸鍵位點(diǎn)限制，進(jìn)一步通過(guò)乙醇促進(jìn)絲蛋白水凝膠內(nèi)部形成β-折疊結(jié)構(gòu)域，起到了第二個(gè)均勻分布交聯(lián)劑的作用，制備形成雙交聯(lián)絲素蛋白（TSF）水凝膠（圖1）。我們的方法的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是能夠在不改變絲素蛋白結(jié)構(gòu)和組成的情況下進(jìn)行交聯(lián)，所制備的具有“雙網(wǎng)絡(luò)”的絲蛋白水凝膠具有良好的力學(xué)性能，并且在模擬體內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出優(yōu)秀的穩(wěn)定性。為了證明這種新型生物材料的實(shí)用性，我們將其在體外對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)其生物相容性。

圖1 TSF 雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠示意圖Fig.1 Schematic diagram of TSF double network hydrogel

1 材料與方法

1.1 主要材料

高糖DMEM（Hyclone，USA），胎牛血清（FBS）、1%的青鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，USA），溴化鋰、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）、辣根過(guò)氧化物酶Ⅵ型（HRP）、過(guò)氧化氫（H2O2）、纖維素透析膜（默克有限公司，中國(guó)），活死染色試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，中國(guó)），家蠶繭購(gòu)自中國(guó)江蘇。共聚焦顯微鏡（徠卡，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 制備絲蛋白

絲素蛋白是從家蠶繭中分離出來(lái)的[8]。具體步驟為：將蠶繭切成小塊，并在0.02 mol/L 碳酸鈉溶液中煮沸30 min，采去除絲素纖維中的絲膠；脫膠絲素蛋白纖維在70 ℃下溶解在溴化鋰（9.3 mol/L）中4 h；使用纖維素膜（截止值為14 kDa）將絲素蛋白溶液與去離子水透析5 d，每天更換離子水；獲得的絲素蛋白水溶液冷凍干燥。

1.2.2 制備雙交聯(lián)絲蛋白水凝膠

為了制備雙交聯(lián)處理的絲蛋白水凝膠（TSF 水凝膠），首先配制4 wt%的絲蛋白水溶液，將20 μL HRP（900 U/mL）和20 μL H2O2（0.5% v/v）添加到1 mL SF 溶液中。將混合物在37 ℃下培養(yǎng)形成酶促水凝膠，將其浸入90% v/v 的乙醇溶液中6 h，轉(zhuǎn)移到去離子水中，以去除乙醇和其他殘留物。

1.2.3 物理性能檢測(cè)

1.2.3.1 水凝膠形貌觀(guān)察

將TSF 水凝膠制成圓柱形樣品（高1 cm，直徑1 cm），冷凍干燥后噴金處理，使用掃描電鏡（PHENOM）觀(guān)察樣品的表面形貌。

1.2.3.2 力學(xué)性能檢測(cè)

將TSF 水凝膠制成圓柱形樣品（高1 cm，直徑1 cm），使用Electronic Universal Testing Machine（Zwick T1-FR020.A50）檢測(cè)樣品的壓縮性能，壓縮速率為1 mm/min，無(wú)預(yù)應(yīng)力設(shè)置。每個(gè)樣本測(cè)試3次。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細(xì)胞（hSFs）來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下（37 ℃、5%CO2以及飽和濕度），使用含10% FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80%的細(xì)胞融合度后傳代。

1.2.5 生物學(xué)性能檢測(cè)

1.2.5.1 生物相容性檢測(cè)

用CCK-8 法檢測(cè)材料的細(xì)胞毒性以及水凝膠對(duì)細(xì)胞的增殖能力的影響。將1×104個(gè)hSFs 接種在凝膠表面。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，在培養(yǎng)1、3 和7 d 后，將原有培基換成含有CCK-8 試劑的新鮮培養(yǎng)基，并37 ℃下培養(yǎng)1.5 h。吸出檢測(cè)溶液使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的光密度。細(xì)胞未接種在凝膠表面，直接接種于6 孔板的作為對(duì)照組（Control）。

為了分析細(xì)胞在凝膠培養(yǎng)條件下的存活能力，利用活死染色試劑盒，在培養(yǎng)7 d 后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果用共聚焦顯微鏡觀(guān)察并拍照。

1.2.5.2 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè)

用熒光染色觀(guān)察材料表面的細(xì)胞黏附形態(tài)。將1×104個(gè)hSFs 接種在凝膠表面，培養(yǎng)6 h 后，4%多聚甲醛固定。FITC-Actin 染色細(xì)胞骨架，DAPI 染色細(xì)胞核，用共聚焦顯微鏡（徠卡，德國(guó)）觀(guān)察結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用分析軟件GraphPad Prism 8（GraphPad software，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey 后分析法。P＜0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TSF 水凝膠物理性能研究

TSF 凝膠中可見(jiàn)由纖維結(jié)構(gòu)構(gòu)成的有序三維網(wǎng)絡(luò)，這與酶促交聯(lián)形成的雙酪氨酸網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，還可觀(guān)察到一些由于冰晶壓縮產(chǎn)生的一些帶狀結(jié)構(gòu)，這與β-折疊結(jié)構(gòu)域的大規(guī)模聚集有關(guān)（圖2）。我們認(rèn)為，這種具有三維網(wǎng)絡(luò)的纖維－帶狀結(jié)構(gòu)可以是TSF 水凝膠特有的結(jié)構(gòu)，與其力學(xué)性能相關(guān)。

圖2 TSF 水凝膠斷面SEM 觀(guān)察Fig.2 SEM observation of TSF hydrogel section

如圖3 所示，TSF 水凝膠在重復(fù)壓縮試驗(yàn)中能夠承受較大的應(yīng)變，TSF 水凝膠在10%應(yīng)變下的抗壓強(qiáng)度為（0.907±0.024）MPa，其相關(guān)壓縮模量為（0.589±0.032）MPa。由于酶交聯(lián)程度受到絲蛋白中酪氨酸含量以及絲蛋白水溶液中酚羥基暴露水平的限制，而在乙醇中處理凝膠后，通過(guò)形成廣泛的β-折疊結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)一步固定這個(gè)“不完整網(wǎng)絡(luò)”中的絲蛋白分子鏈，進(jìn)而可以推測(cè)雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)能夠極大地提高TSF 水凝膠的強(qiáng)度。

圖3 TSF 水凝膠的壓縮強(qiáng)度檢測(cè)Fig.3 TSF hydrogel compressive strength test

2.2 TSF 水凝膠的生物相容性

細(xì)胞接種6 h 后可很好地黏附在TSF 凝膠表面，并在凝膠表面鋪展，具有良好的方向性（圖4）。

圖4 TSF 水凝膠表面HSFs 細(xì)胞（6 h）的熒光染色結(jié)果Fig.4 Fluorescence staining results of HSFs cells on TSF hydrogel surface (6 h)

CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞逐漸增多，與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯的細(xì)胞毒性（圖5），顯示材料具有良好的生物相容性。

圖5 TSF 水凝膠接種hSFs 細(xì)胞的增殖情況（CCK-8 檢測(cè)結(jié)果）Fig.5 Proliferation of hSFs cells inoculated with TSF hydrogel(CCK-8 test results)

在凝膠表面接種1 周后進(jìn)行活/死細(xì)胞染色，以評(píng)估在水凝膠中的細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示，細(xì)胞逐漸長(zhǎng)入凝膠內(nèi)部，且顯示出良好的細(xì)胞活力，未見(jiàn)明顯死細(xì)胞（圖6）。

圖6 TSF 水凝膠接種HSFs 細(xì)胞的活死細(xì)胞染色結(jié)果（7 d）Fig.6 Live/dead cell staining of HSFs cells inoculated with TSF hydrogel (7 d)

3 討論

TSF 水凝膠顯示出較高的強(qiáng)度，是因?yàn)樵谝掖既芤褐羞M(jìn)一步處理酶處理后的絲蛋白水凝膠。同樣，將酶促凝膠浸入乙醇溶液后，可以制備具有雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的酶－乙醇TSF 水凝膠。SEM 結(jié)果顯示，由于利用乙醇作為額外的物理交聯(lián)劑，在水凝膠內(nèi)部形成了廣泛的β-折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)在水凝膠內(nèi)保留完全的酶致化學(xué)交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)。

近幾十年來(lái)，各種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)被用于提高基于合成聚合物和天然聚合物的水凝膠的機(jī)械性能，包括基于聚合物的納米復(fù)合凝膠、雙網(wǎng)絡(luò)（DN）凝膠和半互穿網(wǎng)絡(luò)[15-17]。酶預(yù)處理的雙-Tyr 交聯(lián)位點(diǎn)不僅部分實(shí)現(xiàn)水凝膠的3D 網(wǎng)絡(luò)，還促進(jìn)絲素蛋白中相鄰GAGAGS 序列的空間呈現(xiàn)，從而在乙醇的幫助下促進(jìn)其從無(wú)規(guī)卷曲到β-折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變[18]。更重要的是，HRP 預(yù)連接網(wǎng)絡(luò)顯著限制了RSF 鏈的組織，從而限制了不斷增長(zhǎng)的β-折疊結(jié)構(gòu)域的大小。因此，在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中形成并均勻分布小范圍的β-折疊，這被認(rèn)為是對(duì)TSF 水凝膠強(qiáng)度的主要貢獻(xiàn)。

因此，用乙醇對(duì)交聯(lián)不足的酶促絲蛋白水凝膠進(jìn)行后處理，對(duì)于提高水凝膠的強(qiáng)度非常關(guān)鍵，因?yàn)檫@提供了一種有效且簡(jiǎn)單的方法來(lái)產(chǎn)生小且均勻分布的β-折疊結(jié)構(gòu)域，形成雙交聯(lián)TSF 凝膠中的第二交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在乙醇溶液中對(duì)酶交聯(lián)彈性絲蛋白水凝膠進(jìn)行后處理，開(kāi)發(fā)了一種雙網(wǎng)絡(luò)TSF 水凝膠，這種水凝膠顯示出良好的機(jī)械性能。由于TSF水凝膠具有優(yōu)異的力學(xué)性能和良好的生物相容性，可作為一種植入生物材料,在組織工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。