p53 modRNA 促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源早期心肌細(xì)胞分化成熟的初步研究

陳穎 楊禮 宮藝其 譚瑤 王會(huì)景 劉明璐 盧婷婷 羅潤嬌 王偉 付煒

心血管疾病是人類健康的頭號(hào)殺手[1]。心肌細(xì)胞是心血管疾病研究和治療的重要方向。然而，人來源心肌細(xì)胞獲取困難，存在倫理問題，并且無法體外傳代擴(kuò)增，限制了心血管領(lǐng)域的相關(guān)研究。人體細(xì)胞重編程去分化獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Human induced pluripotent stem cell，hiPSC），具有多向分化潛能，且避開了相關(guān)的倫理問題，具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。通過特定的誘導(dǎo)分化方式，可從hiPSC 不斷地獲得人心肌細(xì)胞，用于藥物毒性測(cè)試和篩選平臺(tái)、3D 類器官的構(gòu)建、疾病模型構(gòu)建、細(xì)胞治療等[3]。

然而，hiPSC 分化來源的心肌細(xì)胞屬于未成熟細(xì)胞，肌節(jié)少，沒有T 管，依賴糖酵解作為主要能源供應(yīng)[4]。研究表明，未成熟的心肌細(xì)胞移植到大型動(dòng)物模型體內(nèi)可能會(huì)誘發(fā)致死性心律失常[5]。因此，干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞成熟不足是其應(yīng)用的主要障礙。目前，促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟的方法包括延長培養(yǎng)時(shí)間、肌電刺激、細(xì)胞共培養(yǎng)、添加生物活性分子等，但這些方法存在各種問題，如效率低、成本高、效果有限或操作過于復(fù)雜[3，6]。因此，我們需要研究更為簡單高效的可促進(jìn)hiPSC 來源心肌細(xì)胞（Human induced pluripotent stem cell-cardiomyocyte，hiPSCCM）進(jìn)一步成熟的方法。

研究表明，心臟發(fā)育最后階段的標(biāo)志是心肌細(xì)胞增殖到肥大的轉(zhuǎn)變。人類的心肌細(xì)胞在出生后僅0.01%的細(xì)胞處于有絲分裂期，在青春期顯著下降，幾乎檢測(cè)不到。然而，hiPSC-CM 在其產(chǎn)生后數(shù)月仍可保留分裂能力，增殖率在長時(shí)間培養(yǎng)后逐漸從每天30%降至＜5%[7]。心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期是其成熟的主要標(biāo)志。其中，p53 蛋白具有調(diào)控細(xì)胞周期的重要作用[8]。研究顯示，抑制mTOR 通路可促進(jìn)iPSC來源的心肌細(xì)胞成熟，可能與上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子p53 相關(guān)[9]。p53 是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的周期調(diào)控、DNA 修復(fù)、細(xì)胞凋亡和衰老等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9]。在心肌細(xì)胞中，p53被認(rèn)為是心臟轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究顯示，心肌細(xì)胞特異性核心轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子上都有p53的結(jié)合位點(diǎn)，p53 可以在心肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而在心肌細(xì)胞成熟相關(guān)特征上扮演重要角色[10]。因此，我們?cè)O(shè)想是否可以通過簡單有效的手段調(diào)控p53 的表達(dá)，從而促進(jìn)hiPSC-CM 的成熟。

化學(xué)合成修飾信使RNA（Synthetic chemically modified mRNA，modRNA）技術(shù)利用化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改變，對(duì)mRNA 進(jìn)行改造，優(yōu)化mRNA 的帽子和尾部結(jié)構(gòu)，使其更加穩(wěn)定，并將序列中正常的尿嘧啶替換為N1 甲基假尿嘧啶（N1-methylpseudouridine），降低其免疫原性，從而使RNA 在細(xì)胞內(nèi)能高效快速表達(dá)目的蛋白[11]。傳統(tǒng)基因過表達(dá)方法易發(fā)生外源性基因整合到宿主基因內(nèi)的現(xiàn)象，從而造成染色體變異，且易激發(fā)宿主免疫反應(yīng)而被清除，因此轉(zhuǎn)染效率低且易造成嚴(yán)重不良后果[12]。modRNA 技術(shù)不會(huì)與宿主基因組發(fā)生整合，并且比未修飾的RNA 更加穩(wěn)定且免疫原性更低，這些優(yōu)良特性使modRNA 快速得到廣泛的應(yīng)用[13]。

本研究中，我們利用modRNA 技術(shù)表達(dá)目的蛋白、快速高效發(fā)揮作用的特性，將p53 modRNA 轉(zhuǎn)染至分化早期的hiPS-CMs 中，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53 的表達(dá)，從而一定程度上促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化成熟。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

TESR-E8 培養(yǎng)基、Y-27632、ACCUTASE 消化酶、CHIR99021（STEMCELL，加拿大），EDTA、RPMI1640、B27-INSULIN、PCR 純化試劑盒、Xhol 酶、質(zhì)粒小抽試劑盒、轉(zhuǎn)錄物純化試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol、胰酶、TopVision Agarose Tablets、6×Orange DNA Loading Dye（THERMO，美國），基質(zhì)膠（CORNING，美國），心肌細(xì)胞消化液（賽貝，中國），流式細(xì)胞固定破膜液（INVITROGEN，美國），DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技有限公司），cTnT 抗體、cTnI抗體、p53 抗體（PROTEINTECH，美國），α-actin 抗體、DMSO（SIGMA，美國），RT REAGENT KIT 試劑盒（TaKaRa，日本），SYBR PCR 試劑盒（QIAGEN，德國），PBS、高糖DMEM、雙抗（HYCLONE，美國），F(xiàn)BS（BIOIND，以色列），DAPI（上海翊圣生物科技有限公司），驢抗兔/鼠IgG 二抗（ABCAM，英國），pUC57-p53/pUC57 -GFP 質(zhì)粒、PCR 引物、4×Tris-HCl 濃縮膠配膠緩沖液pH8.8 1.5 mol/L、Tris-glycine-SDS 緩沖液、10×印跡轉(zhuǎn)膜緩沖液（上海生工生物工程股份有限公司），4×Tris-HCl 濃縮膠配膠緩沖液pH6.8 0.5 mol/L、Amersham Hybond P 0.45 PVDF（GE Healthcare，美國），non-fat powder milk（BBI Life Science，美 國），tween-20、APS、TEMED、10%SDS（Sangon Biotech，美國）、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、PMSF、30% Acr-Bis（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Pageruler prestained protein ladder（LIFE TECHNOLOGIES，美 國），Immobilon Western HRP底物（MERK，德國），50×TAE 電泳緩沖液（北京索萊寶科技有限公司），Gelred 10 000×inwater（BIOTIUM，美國）。

倒置熒光顯微鏡（DMI3000B，Leica，德國），激光共聚焦顯微鏡（TSC SP8，Leica，德國），NanoDrop 2000（Thermo，美國），qPCR 儀（CFX-Connect，BIORAD，美國），化學(xué)發(fā)光成像儀（Amersham Imager 600，美國），電泳儀、電泳槽、微波爐、凝膠顯像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 modRNA 制備方法

參照p53/GFP CDS 序列構(gòu)建pUC57-p53/pUC57-GFP 質(zhì)粒。p53 CDS 序列詳見NM_000546.6，GFP 的CDS 序列[14]。取質(zhì)粒1 μg 與感受態(tài)細(xì)胞20 μL混合，置于冰上5 min，隨后42 ℃熱激60 s，加入1 mL無抗性LB 培養(yǎng)基于37 ℃活化1 h，取少量菌液均勻涂抹在含氨芐青霉素LB 培養(yǎng)板上，37 ℃過夜。挑取單菌落加入含氨芐青霉素LB 培養(yǎng)液中，37 ℃擴(kuò)增過夜。利用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒（參考說明書）。用Xhol 酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，用純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化（參照說明書），利用PCR 擴(kuò)增線性質(zhì)粒的CDS 序列，再次對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap、AntiReverse Cap Analog、N1-甲基假尿嘧啶、GTP、CTP、ATP 等進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄并純化，隨后進(jìn)行磷酸化修飾處理并再次純化。詳見參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.2 心肌細(xì)胞分化

hiPSC 細(xì)胞系由上海兒童醫(yī)學(xué)中心李彥欣教授課題組建系、鑒定，為臍帶血細(xì)胞來源，捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)知情同意書。

6 孔板用Matrigel 鋪板30 min，hiPSCs 用TeSR-E8 進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。

分化前2 天，按每孔100 萬hiPSC 的密度將其接種于已鋪膠的12 孔板上，分化第0 天加入12 μmol/L CHIR99021（用B27-Insulin 配制），2 mL/孔，分化第2 天終止，加入B27-Insulin 培養(yǎng)基，分化第3 天加入5 μmol/L IWP2（用B27-Insulin 配制），分化第5天用B27-Insulin 培養(yǎng)基換液，分化第7 天換成B27+Insulin 培養(yǎng)基，此后每2 天換液一次。分化第9天細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯搏動(dòng)。

1.2.3 核酸凝膠電泳

制備10%瓊脂糖溶液25 mL（含0.01%Gelred），倒入制膠板，插入梳子，室溫凝固30 min，將凝膠置入電泳槽，拔去梳子，加入1×TAE 電泳緩沖液沒過凝膠，將2 μL 樣本與1 μL 6×載樣緩沖液混合均勻，依次加入樣孔中。將電泳儀調(diào)至120 V 電壓，電泳30 min，利用凝膠顯像系統(tǒng)觀測(cè)條帶。

1.2.4 免疫熒光染色

將細(xì)胞以合適的密度接種于共聚焦小皿上，培養(yǎng)過夜后去除培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞，吸棄PBS后加入4%多聚甲醛1 mL，室溫固定30 min 后吸棄液體。加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入0.5%Triton，室溫放置10 min 后吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入5%BSA，室溫放置2 h 后吸棄液體。加入稀釋好的一抗（參照說明書），4 ℃孵育過夜，吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入稀釋好的二抗（參照說明書），室溫孵育2 h，吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入稀釋好的DAPI（參照說明書），室溫孵育5 min，吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5 免疫蛋白印跡（Western blot）

收集細(xì)胞沉淀，加入適量RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，冰上放置30 min，每隔10 min 渦旋一次，4 ℃下12 000 r/min 離心10 min，收集上清。用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。在預(yù)先準(zhǔn)備好的10%聚丙烯酰胺凝膠中加入30 μg 樣品，開始60 V 電泳30 min，后120 V電泳100 min。將凝膠轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜儀器中，200 mA轉(zhuǎn)膜100 min，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入稀釋好的一抗（參照說明書）4 ℃孵育過夜，吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入稀釋好的HRP 偶聯(lián)二抗（參照說明書），室溫孵育1 h，吸棄液體，加入PBS 漂洗3 次，每次5 min。加入顯色液，在化學(xué)發(fā)光儀器下曝光拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞分析技術(shù)

收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞固定液室溫避光孵育30 min，隨后加入1 mL PBS，1 000 r/min 離心5 min，吸棄液體，加入稀釋好的一抗（參照說明書）37 ℃孵育1 h，1 000 r/min 離心5 min，吸棄液體，加入稀釋好的二抗（參照說明書），室溫避光孵育1 h，1 000 r/min離心5 min，吸棄液體，加入400 μL PBS 重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）

吸棄培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol，吹打細(xì)胞，收集裂解液，冰上靜置5 min，每管加入250 μL 三氯甲烷，劇烈振蕩至完全乳化，冰上靜置5 min，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min。吸取上層水相500 μL至新EP 管，加入500 μL 預(yù)冷異丙醇混勻，冰上靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min。吸棄液體，加入75%乙醇1 mL（DEPC 水稀釋）重懸沉淀，4 ℃下7 500 r/min 離心5 min，吸棄液體，重復(fù)清洗沉淀一次，吸棄液體，晾干沉淀，加入適量DEPC 水溶解沉淀。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作參照說明書。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與擴(kuò)增引物、熒光染料等按照一定比例混合加入PCR 板中，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用非配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53 modRNA 制備與鑒定

modRNA 與天然mRNA 基本結(jié)構(gòu)相似，由5 個(gè)主要區(qū)域構(gòu)成，兩端分別是5' 帽結(jié)構(gòu)和3' 多聚（A）尾，其間包括5' 非翻譯區(qū)（5'untranslated region，5'UTR）、開放閱讀框（Open reading frame，ORF）以及3' 非翻譯區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）。ORF 區(qū)域通常編碼感興趣的蛋白質(zhì)。為了制備p53 modRNA，我們首先設(shè)計(jì)了p53 的序列結(jié)構(gòu)，裝入pUC57質(zhì)粒中。本研究中，利用modRNA 編碼人源性p53，p53 modRNA 在體外轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行純化，核酸電泳結(jié)果顯示，構(gòu)建的質(zhì)粒大小4 117 bp，p53 modRNA 純度較高，片段大小在1 500 bp 左右，與預(yù)期相符（圖1）。

圖1 p53 modRNA 鑒定Fig.1 Identification of p53 modRNA

2.2 hiPSC 鑒定及hiPSC 向心肌細(xì)胞分化

hiPSC 呈圓形，核質(zhì)比高，排列緊密，呈克隆樣生長，邊緣整齊。免疫熒光染色結(jié)果顯示，hiPSC高表達(dá)干性標(biāo)記物Oct4、Nanog、Tra-1-60、Sox2（圖2）。在hiPSC 向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎噙呅?，光鏡下顯示第9 天心肌細(xì)胞開始搏動(dòng)。免疫熒光結(jié)果顯示，hiPSC 誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞高表達(dá)心肌特異性標(biāo)記物α-actinin、cTnT，肌節(jié)結(jié)構(gòu)較為整齊且表達(dá)豐富。對(duì)分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞高表達(dá)特異性標(biāo)記物cTnT，且效率超過80%（圖3）。

圖2 hiPSC 特異性標(biāo)記物鑒定（標(biāo)尺=75 μm）Fig.2 Pluripotency identification of hiPSC (bar=75 μm)

圖3 hiPSC 向心肌細(xì)胞分化的過程及心肌細(xì)胞鑒定Fig.3 Differentiation of hiPSCs into cardiomyocytes and identification of cardiomyocytes

2.3 p53 modRNA 轉(zhuǎn)染hiPSC-CMs 后p53 表達(dá)情況

我們驗(yàn)證了p53 modRNA 轉(zhuǎn)染hiPSC-CMs 6 h后成功表達(dá)了p53，24 h 后仍有部分表達(dá)，蛋白表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)時(shí)間與蛋白半衰期相關(guān)（圖4）。

圖4 hiPSC-CMs 轉(zhuǎn)染p53 modRNAFig.4 p53 modRNA transfected with hiPSC-CMs

2.4 轉(zhuǎn)染p53 modRNA 后hiPSC-CMs 成熟相關(guān)基因及蛋白表達(dá)情況

在心臟發(fā)育過程中，心肌細(xì)胞的成熟伴隨著p53 等細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的激活。我們測(cè)試了由p53 modRNA 介導(dǎo)的瞬時(shí)p53 表達(dá)是否具有類似的效果。我們將hiPSC-CMs 培養(yǎng)至分化且細(xì)胞開始搏動(dòng)后2 d，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染p53 modRNA，繼續(xù)培養(yǎng)2周后對(duì)心肌成熟相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)量。Western blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染p53 modRNA 組中，心肌特異性蛋白cTnI 表達(dá)較轉(zhuǎn)染GFP modRNA 的組有增高趨勢(shì)，但沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PCR 結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染無關(guān)蛋白的組相比，轉(zhuǎn)染p53 modRNA 的組增殖相關(guān)基因CCNB1 表達(dá)降低（P＜0.001），鉀離子通道基因KCNJ2 表達(dá)增高（P＜0.05），鈉離子通道基因SCN5A表達(dá)有增高趨勢(shì)，心肌細(xì)胞特異性蛋白基因TNNI3表達(dá)增高（P＜0.001），脂代謝相關(guān)基因PPARGC1a 表達(dá)增高（P＜0.01），證明p53 modRNA 轉(zhuǎn)染hiPSCCMs 可在一定程度上促進(jìn)心肌細(xì)胞的成熟（圖5）。

圖5 hiPSC-CM 成熟相關(guān)蛋白及mRNA 的表達(dá)Fig.5 Expression of maturation related protein and mRNA of hiPSC-CM

2.5 轉(zhuǎn)染p53-modRNA 對(duì)hiPSC-CM 形態(tài)的影響

為進(jìn)一步探究p53 modRNA 對(duì)hiPSC 誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞形態(tài)的影響，我們對(duì)p53 modRNA 處理后2 周的hiPSC-CM 進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組心肌細(xì)胞形態(tài)趨近長棒狀，細(xì)胞肌節(jié)排列更整齊且數(shù)量豐富，更接近成熟心肌細(xì)胞形態(tài)。表明p53 modRNA 作用于hiPSC 誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞，可能促進(jìn)hiPSC-CM 形態(tài)的成熟（圖6）。

圖6 hiPSC-CM 形態(tài)鑒定（標(biāo)尺=50 μm）Fig.6 Morphological identification of hiPSC-CM (bar=50 μm)

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescence quantitative PCR

3 討論

本研究中，我們成功利用modRNA 技術(shù)，制備出p53 modRNA,并將其成功轉(zhuǎn)染至hiPSC 分化來源的早期心肌細(xì)胞中，提高了p53 的表達(dá)，降低了增殖相關(guān)基因CCNB1 的水平，在一定程度上促進(jìn)了心肌細(xì)胞的進(jìn)一步分化成熟。

hiPSC 來源的心肌細(xì)胞成熟不足是心血管領(lǐng)域研究的重要障礙。目前，促進(jìn)hiPSC-CMs 成熟的方法各有弊端，因此不適用于批量生產(chǎn)使用。我們需要進(jìn)一步研究簡單有效的獲得成熟心肌細(xì)胞的方法。成熟的心肌細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，并且細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能更加完善[16]。其中，p53 蛋白具有調(diào)控心肌細(xì)胞周期的重要作用。p53 的激活可以促使細(xì)胞進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，p53 的抑制與斑馬魚心肌增殖相關(guān)[18]。因此，本研究通過modRNA 技術(shù)調(diào)控p53 的表達(dá)，從而一定程度上促進(jìn)了hiPSC-CM 的分化成熟。

modRNA 技術(shù)是一種創(chuàng)新性的方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的基因傳遞方法包括基于DNA 的方法和非DNA（如mRNA）的方法。第一代DNA 療法將攜帶的遺傳物質(zhì)與宿主基因整合，可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡或者腫瘤形成[19]。第二代DNA 療法雖然不與細(xì)胞基因組整合，但仍可與細(xì)胞基因組以外的DNA 結(jié)合，并可能導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損傷甚至死亡[20]。mRNA 的應(yīng)用也是具有挑戰(zhàn)性的，mRNA 在細(xì)胞外極易被核糖核酸酶降解，并且這種大分子難以通過細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性低且傳遞效率較差[21]。modRNA 通過化學(xué)修飾以及結(jié)構(gòu)改變，可提高其安全性、有效性和持續(xù)時(shí)間。與傳統(tǒng)的基于DNA 的傳遞方式相比，modRNA 具有許多優(yōu)勢(shì)。首先，modR?NA 不會(huì)與宿主基因發(fā)生整合，且modRNA 的作用是短暫的，沒有致突變的風(fēng)險(xiǎn)。modRNA 還可有效利用細(xì)胞的翻譯機(jī)制以劑量依賴的方式產(chǎn)生目的蛋白[22,23]。由于結(jié)構(gòu)和核苷酸的修飾，modRNA 的免疫原性更低[12]。與傳統(tǒng)方式相比，modRNA 的制備更為便捷且高效，更容易批量化生產(chǎn)。由于modRNA 的突出優(yōu)勢(shì)，已被用于不同疾病的臨床研究與治療中[13,24]。

在hiPSC 誘導(dǎo)的早期心肌細(xì)胞中，可以觀察到轉(zhuǎn)染p53 modRNA 一定程度上促進(jìn)了心肌細(xì)胞肌節(jié)相關(guān)蛋白cTnI 和基因TNNI3 的表達(dá)。心肌細(xì)胞肌節(jié)的形成依賴不同肌原纖維蛋白的表達(dá)，監(jiān)測(cè)相關(guān)蛋白（如cTnT、cTnI 等）的表達(dá)水平可以對(duì)iPSCCM 的成熟進(jìn)行初步評(píng)價(jià)[25]。

在細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞長寬比增大，形態(tài)更趨近長棒型，肌節(jié)豐富且排列整齊。成體心肌細(xì)胞形態(tài)不僅提供細(xì)胞的結(jié)構(gòu)框架，而且還直接促成細(xì)胞的其他關(guān)鍵功能特性。高長寬比的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有利于生成長肌原纖維與橫向?qū)R的肌節(jié)，導(dǎo)致有效心臟收縮力的產(chǎn)生[26]。未成熟的心肌細(xì)胞在平面培養(yǎng)時(shí)，會(huì)迅速形成扁平形狀，且沒有清晰的肌原纖維排列[27]。

心肌細(xì)胞收縮力的產(chǎn)生不僅與肌節(jié)相關(guān)，還與離子通道的活動(dòng)密不可分。心肌細(xì)胞的收縮力由動(dòng)作電位激發(fā)，而離子通道是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位產(chǎn)生的基礎(chǔ)[28]。本研究中的q-PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組鈉離子和鉀離子通道相關(guān)蛋白基因的表達(dá)相比未轉(zhuǎn)染組有增高趨勢(shì)；同時(shí)，脂代謝相關(guān)基因PPARGC1a表達(dá)增加，提示心肌細(xì)胞的代謝方式可能更多地向脂代謝轉(zhuǎn)變。hiPSC-CMs 主要通過糖酵解產(chǎn)生能量[29]，而在成年心肌細(xì)胞中，大約80%的能量消耗是由脂代謝提供的[30]。因此，上調(diào)p53 有可能促進(jìn)了hiPSC-CMs的能量代謝轉(zhuǎn)變，但是還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

本研究利用p53 modRNA 轉(zhuǎn)染hiPSC 來源的心肌細(xì)胞，初步顯示對(duì)心肌細(xì)胞的分化成熟有促進(jìn)作用，但是依然需要后續(xù)透射電鏡、膜片鉗電生理、全面的基因分析以及體內(nèi)細(xì)胞治療的應(yīng)用驗(yàn)證，從而進(jìn)一步證明該方法促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟的可靠性和有效性。