妊娠早期有機氯農(nóng)藥暴露與妊娠期糖尿病的關(guān)聯(lián)研究

楊向明 韓娜 包鶴齡 金楚瑤 周雙 徐金輝 王斌 王?？?安琳

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的不同程度的葡萄糖耐量異常[1]，是妊娠期最常見的妊娠并發(fā)癥之一[2]。2017年北京市通州區(qū)的一項研究表明，GDM發(fā)病率高達20%[3]。GDM與母親及其子代的短期和長期不良健康結(jié)局有關(guān)。患過GDM的婦女在未來患2型糖尿病的風險是孕期血糖正常婦女的4.8～11.5倍[4]，其子代在成年期有更高的風險發(fā)生糖耐量受損和糖尿病[5]。既往研究報道GDM的危險因素包括高齡、糖尿病家族史、巨大兒分娩史、吸煙、飲酒、不良生活方式、孕前超重或肥胖等[6-9]。胎兒性別也可能通過影響母體糖脂代謝，進而影響GDM的發(fā)生[10]。

有機氯農(nóng)藥(organochlorine pesticide，OCPs)屬于持久性有機污染物(persistent organic pollutant，POPs)的一類[11]，在20世紀曾被作為一種超強效殺蟲劑而廣泛使用[12]。雖然中國在1983年就禁止使用包括六氯環(huán)已烷、DDT在內(nèi)的有機氯農(nóng)藥，然而，由于其半衰期長、非極性等特點，至今仍可在人類血液樣本中檢測到。一般人群接觸OCPs主要是通過食用受污染的食品(尤其是牛奶、雞蛋、肉類、魚蝦等動物性食物)和飲用水[13]。大多數(shù)OCPs屬于內(nèi)分泌干擾物，與糖脂代謝密切相關(guān)[14]，可通過干擾胰島素功能，增加肥胖和糖尿病的患病風險[15]。由于生理狀態(tài)的特殊性，孕婦和胎兒是重要的易感人群。截至目前有5篇前瞻性隊列研究檢測了孕婦血液中OCPs水平且均報告了陰性結(jié)果[16-20]。但既往研究均在歐洲或美洲國家開展，未報告過亞洲人群有機氯農(nóng)藥暴露與GDM是否存在關(guān)聯(lián)，且既往研究均未校正妊娠早期身體活動強度、胎兒性別等混雜因素，檢測的OCPs種類也不夠全面。因此，本研究將探究血漿中20種OCPs與孕婦GDM發(fā)生風險的關(guān)聯(lián)。

對象與方法

一、研究對象

本研究采用基于出生隊列的巢式病例研究設(shè)計，依托北京市通州區(qū)婦幼保健院2018年6月開始建立的前瞻性隊列(PKUBC-T 出生隊列)，該隊列旨在調(diào)查孕前和孕期暴露對母親及其子代的短期和長期健康影響，已在ClinicalTrials.gov上注冊(NCT 03814395)。本研究已通過北京大學生物醫(yī)學倫理委員會審查批準(IRB00001052-19083)。研究對象納入標準為：(1)妊娠早期(孕周<14周)在該院建立了孕期健康檔案，并計劃在該院進行孕期保健和分娩；(2)年齡在18～49歲之間；(3)同意將孕期常規(guī)檢查剩余血樣用于研究。排除標準：(1)孕前患有糖尿病，包括妊娠前診斷的糖尿病以及妊娠早期首次產(chǎn)檢診斷的孕前糖尿病(空腹血糖 ≥ 7.0 mmol/L)；(2)孕前患有高血壓、心臟病、自身免疫性相關(guān)疾病、嚴重的肝臟或腎臟疾病、多囊卵巢綜合征，甲狀腺疾病；(3)有妊娠期糖尿病史或糖尿病家族史；(4)近三個月有吸煙、飲酒行為。

截至到2019年2月，PKUBC-T 出生隊列共有3 304名婦女完成了口服糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)，其中593人被診斷為GDM(17.9%)。根據(jù)既往文獻采用200個病例和200名對照的樣本量[21]，從患GDM者中隨機選擇200名GDM孕婦作為病例組，根據(jù)孕婦年齡相差在2歲以內(nèi)、OGTT檢測孕周相差在1周以內(nèi)的匹配原則，用1∶1匹配200名糖耐量正常的孕婦作為對照組。

二、方法

1. GDM診斷標準：GDM診斷標準依據(jù)《妊娠合并糖尿病診治指南(2014)》[22]，在妊娠24～28周進行OGTT檢測，空腹、服糖后1 h和2 h的血糖界值分別為5.1、10.0和8.5 mmol/L，任意一項達到或超過上述界值，則診斷為GDM。

2. 資料收集：通過調(diào)查問卷采集研究對象基本信息和產(chǎn)次、孕婦文化程度、妊娠早期每日膳食總熱量、妊娠早期身體活動強度，所有孕婦妊娠早期首次產(chǎn)檢時由受過統(tǒng)一培訓的護士測量身高及體重，并取空腹外周靜脈血，先做孕期常規(guī)化驗檢查，包括空腹血糖、總膽固醇(TC，g/L)、甘油三酯(TG，g/L)以及維生素D水平，然后將剩余血樣分離血漿保存在-80℃冰箱。

3. 血漿中有機氯農(nóng)藥分析：取0.6 mL血漿放于16 mL玻璃離心管中，加入0.6 mL乙酸鈉緩沖液、20 uL β-葡萄糖醛苷酸酶，在37℃搖床中孵化過夜。加入30 μL濃鹽酸、3 mL 環(huán)己烷和乙酸乙酯混合液(v/v，4:1)，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，氮吹濃縮。加入0.6 mL 正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液(v/v，9:1)復(fù)溶，氮吹濃縮。加入1 mL 乙腈復(fù)溶，加入QueChers填料，震蕩混勻、離心，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL透明玻璃小瓶，氮吹濃縮。加入0.4 mL超純水和0.5 mL 正己烷和甲基叔丁基醚混合液(v/v，1:1)，重復(fù)萃取3次，合并萃取液，氮吹濃縮。加入0.5 mL 正己烷，轉(zhuǎn)移至用正己烷平衡、二氯甲烷洗脫后的中性氧化鋁/硅膠混合柱中，加入20 mL 正己烷和二氯甲烷混合液(v/v，1:1)洗脫，同時用50 mL茄形瓶收集洗脫液。加入OCPs內(nèi)標混合液，旋蒸濃縮。轉(zhuǎn)移至1.5 mL棕色樣品瓶，氮吹濃縮，轉(zhuǎn)移到250 μL襯管中，儲存于-80℃ 冰箱中。OCPs的檢測采用三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫7890；美國安捷倫7010B)，配有HP-5MS毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，EI源。檢測的20種OCPs清單包括：艾氏劑(Aldrin，ALD)、o,p′-滴滴滴(o,p′-Dichlorodiphenyldichloroethane, o,p′-DDD)、p,p′-滴滴滴(p,p′-Dichlorodiphenyldichloroethane, p,p′-DDD)、o,p′-滴滴伊(o,p′-dichlorodiphenyldichloroethylene, o,p′-DDE)、p,p′-滴滴伊(p,p′-dichlorodiphenyldichloroethylene, p,p′-DDE)、o,p′-滴滴涕(o,p′-dichlorodiphenyltrichloroethane, o,p′-DDT)、p,p′-滴滴涕(p,p′-dichlorodiphenyltrichloroethane , p,p′-DDT)、狄氏劑(Dieldrin，DIE)、硫丹Ⅰ(Endosulfan-α，ES1)、硫丹Ⅱ(Endosulfan-β，ES2)、異狄氏劑(Endrin，END)、七氯(Heptachlor，HEC)、環(huán)氧七氯(Heptachlor epoxide，HCEAB)、六氯苯(Hexachlorbenzene，HCB)、a-六氯環(huán)己烷(α-hexachlorocyclohexane，aHCH)、β-六氯環(huán)己烷(β-hexachlorocyclohexane，bHCH)、γ-六氯環(huán)己烷(δ-hexachlorocyclohexane，rHCH)、δ-六氯環(huán)己烷(γ-hexachlorocyclohexane，dHCH)、異艾氏劑(Isodrine，IDR)、滅蟻靈(Mirex)。根據(jù)血脂濃度對OCPs進行校正并報告為ng/g血脂，血脂(TL，g/L)由甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的濃度計算，TL = 0.92 + 1.31 ×(TG + TC)[23]。

4. 統(tǒng)計學處理：血漿中OCPs濃度和孕婦基本特征均不符合正態(tài)分布，因此采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距(interquartile range,IQR)進行描述，兩組率的比較采用卡方檢驗，兩組中位數(shù)的差異采用wilcoxon符號秩和檢驗。對檢出率高于66.7%的OCPs，根據(jù)對照組濃度的三分位數(shù)將OCPs水平進行三等分，與妊娠期糖尿病發(fā)病風險之間的關(guān)聯(lián)采用條件Logistic回歸分析，計算比值比(OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)。進一步用OCPs三組各自的中位數(shù)給每組重新賦值生成連續(xù)變量，代入模型進行趨勢檢驗。協(xié)變量納入既往文獻中報道的GDM危險因素，包括產(chǎn)次、孕婦文化程度、孕前BMI、妊娠早期每日膳食總熱量、妊娠早期身體活動強度和胎兒性別。采用R 4.0.2軟件進行統(tǒng)計分析。雙側(cè)P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、孕婦的基本特征

GDM病例組和對照組的社會人口學特征，如產(chǎn)次、孕婦文化程度，在兩組間的分布基本均衡(P>0.05)；妊娠早期每日膳食總熱量、妊娠早期身體活動強度、胎兒性別，以及血脂水平(包括總膽固醇和三酰甘油)在兩組之間的差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例組孕前BMI高于對照組，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 GDM組與對照組孕婦人群基本特征比較Table 1 Characteristics by the gestational diabetes mellitus (GDM) cases and the corresponding controls

二、孕婦血漿OCPs水平

本研究共檢測血漿中20種OCPs水平，有5種(HCB、p,p′-DDE、END、p,p′-DDT、Merix)高于機器檢出限，其余15種(aHCH、bHCH、rHCH、dHCH、HEC、ALD、IDR、HCEAB、opDDE、DIE、ES1、o,p′-DDT、o,p′-DDD、ES2、p,p′DDD)未檢出?？鄢鄳?yīng)空白對照均值后，p,p′-DDE的檢出率最高。為100.0%，Merix最低，為51.3%。5種被檢出的OCPs中濃度最高的是END，GDM組和對照組的中位數(shù)分別為232.4 ng/g血脂和201.1 ng/g血脂，其次是p,p′-DDE，GDM組和對照組的中位數(shù)分別為63.9 ng/g血脂和56.2 ng/g血脂。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗5種OCPs組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 GDM組和對照組妊娠早期血漿OCPs水平的比較Table 2 Summaries of plasma OCPs levels by GDM cases and the corresponding controls

三、OCPs暴露與GDM發(fā)病的關(guān)聯(lián)

對檢出率高于66.7%的OCPs，根據(jù)對照組三分位數(shù)分為三分類變量，以最低濃度組為參照組，采用條件Logistic回歸進行分析。如表3所示，在未校正混雜因素的情況下，孕婦血漿END暴露最高組較暴露最低組GDM的發(fā)病風險顯著上升，OR值為1.95(95%CI:1.10～3.46)。模型1校正了產(chǎn)次、孕婦文化程度、妊娠早期每日膳食總熱量、妊娠早期身體活動強度和胎兒性別等混雜因素，END暴露與GDM的關(guān)聯(lián)仍然具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，OR值為1.95(95%CI：1.08～3.51)。模型2在模型1的基礎(chǔ)上進一步校正孕前BMI，OR值略有下降(OR=1.84, 95%CI:1.01～3.34)，但依然具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不管是調(diào)整前模型、模型1還是模型2，趨勢檢驗均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即隨著END暴露水平的升高，GDM的患病風險也上升，提示END暴露與GDM之間的關(guān)聯(lián)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。未發(fā)現(xiàn)其他OCPs與GDM的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 妊娠早期血漿OCPs暴露與GDM發(fā)病的關(guān)聯(lián)Table 3 Estimated association between GDM incidence and OCPs concentrations in the plasma samples of early-pregnant women

討 論

本研究采用基于出生隊列的巢式病例對照研究設(shè)計，檢測北京地區(qū)婦女妊娠早期血漿中OCPs濃度，分析妊娠早期OCPs暴露與妊娠期糖尿病發(fā)病的關(guān)聯(lián)。在調(diào)整混雜因素后，發(fā)現(xiàn)妊娠早期血漿END暴露與GDM發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

孕前BMI為GDM的重要危險因素。研究表明，孕前BMI較大導致的超重或肥胖是GDM的危險因素，而控制體重(孕前BMI維持在25 kg/m2以下)則可有效降低GDM的發(fā)生[24]。本研究中，在調(diào)整產(chǎn)次、身體活動、膳食能量攝入等混雜因素的基礎(chǔ)上，進一步調(diào)整孕前BMI的影響后，發(fā)現(xiàn)與低暴露相比，END高暴露是GDM的危險因素，表明在考慮孕前BMI作用的情況下，END高暴露仍然是影響GDM發(fā)病的危險因素。

本研究未發(fā)現(xiàn)HCB、p,p′-DDE、p,p′-DDT和Merix與GDM的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計學意義，結(jié)論與既往研究一致。2007年Saldana等[25]發(fā)現(xiàn)，自述在妊娠早期有過農(nóng)藥接觸的孕婦GDM的患病率是非暴露孕婦的兩倍，但后續(xù)的幾項血清檢測研究均得到了陰性結(jié)果。2016年Smarr等[16]評估了258名孕婦懷孕前血清中9種OCPs含量與GDM風險的關(guān)聯(lián)程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊娠早期血清中9種OCPs暴露與GDM的發(fā)生風險關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學意義，雖然校正混雜后p,p′-DDE的OR值上升。Shapiro等[17]在1 274名孕婦中也未發(fā)現(xiàn)DDE與孕婦糖耐量受損或GDM存在關(guān)聯(lián)。2017年Vafeiadi等[18]發(fā)現(xiàn)妊娠早期HCB濃度與GDM發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，但經(jīng)過孕前BMI、孕期增重、孕期吸煙等混雜因素校正后，關(guān)聯(lián)不具有統(tǒng)計學意義。同樣地，Valvi等[19]報告了孕婦妊娠34周血清DDE與GDM存在正相關(guān)，但校正后關(guān)聯(lián)不具有統(tǒng)計學意義。2019年Rahman等[20]對POPs混合物進行聯(lián)合分析，仍然未發(fā)現(xiàn)OCPs對GDM的發(fā)生存在影響。與上述研究相比，本研究人群HCB暴露水平較高，p,p′-DDE、p,p′-DDT則較低。本研究樣本量較小，可能存在檢驗效能不足的問題，后續(xù)研究需要增大樣本量。

到目前為止，未發(fā)現(xiàn)既往研究報告END與GDM的關(guān)聯(lián)。END是一種用于棉花和谷物等作物的殺蟲劑，也用于控制嚙齒動物和鳥類。細胞學實驗研究表明END可能會通過抑制脂肪細胞分化，進而干擾脂質(zhì)代謝[26]。一項橫斷面研究提示一般人群身體總環(huán)二烯負荷(包括END、ALD和DIE)與胰島素樣生長因子存在非線性劑量反應(yīng)關(guān)系[27]。2017年西班牙的一項橫斷面研究報告了END與2型糖尿病不存在關(guān)聯(lián)，但其濃度比本研究低約5倍[28]，檢出率也低約30%。本研究與該研究人群不同，研究設(shè)計、樣本收集時間和用于量化OCPs暴露的實驗方法也存在差異，發(fā)現(xiàn)妊娠早期END暴露與GDM存在關(guān)聯(lián)，提示當前人群END較高濃度暴露對GDM發(fā)生可能產(chǎn)生影響，暴露濃度越高，GDM的發(fā)生風險可能越高。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在北京地區(qū)婦女妊娠早期檢出的五種OCPs中END暴露與GDM發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，未發(fā)現(xiàn)其余四種OCPs暴露與GDM發(fā)病存在關(guān)聯(lián)，為進一步研究GDM發(fā)病的環(huán)境危險因素提供科學證據(jù)。