仙麻平喘湯對哮喘小鼠干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

蔣鵬娜，張佩青，王麗潔

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036；2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院·黑龍江 哈爾濱 150040)

仙麻平喘湯是本院臨床用于治療哮喘的有效驗(yàn)方，全方以“陽虛痰盛”立方，以溫陽益氣為主，兼以平喘化痰，綜觀全方溫陽利濕，陽氣足濕氣化，益氣納腎，一身之氣足則喘平氣順，補(bǔ)中有消，溫中有行，肺脾腎三臟同調(diào)，臨床使用多年療效可靠。本實(shí)驗(yàn)是在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行的關(guān)于仙麻平喘湯對哮喘模型小鼠肺組織損傷以及對氣道阻力的干預(yù)效果觀察，以期為該藥治療哮喘的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雌性BALB/c小鼠50只， 8～12周齡，體質(zhì)量18～22 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黑)2019-03，于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(黑)2016-008，5只1籠，提前1 周進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)，實(shí)驗(yàn)室溫度18～25 ℃，相對濕度40%～75%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 仙麻平喘湯：淫羊藿、黃芪、麻黃、五味子、紫菀、細(xì)辛、射干、款冬花、半夏、生姜、大棗，上述中藥飲片均購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院草藥局。仙麻平喘湯合煎液制備：分別稱取相應(yīng)劑量上述藥材，浸泡30 min，1煎8倍水，1.5 h，濾出藥液；2煎4倍水，1.5 h，濾出藥液；合并兩次藥液，轉(zhuǎn)移至旋蒸儀中濃縮，定容至濃度1.26 g生藥/mL，給藥劑量為25.2 g/(kg·d)，得到仙麻平喘湯合煎液。仙麻平喘湯混合液制備：分別稱取相應(yīng)劑量上述藥材分別浸泡30 min，分別以合煎組的時(shí)間、加水倍數(shù)條件煎煮，最后合并藥液；分別轉(zhuǎn)移至旋蒸儀中濃縮，各自定容至200 mL，最后混合藥液定容至1.26 g生藥/mL，劑量為25.2g/(kg·d)，得到仙麻平喘湯混合液。上述藥液別冷藏至-20 ℃冰箱保存，用時(shí)于-4 ℃冰箱保存。地塞米松磷酸鈉注射液(1 mL∶5 mg)：國藥準(zhǔn)字H42020019，天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：52003281。

1.3 主要試劑及儀器 OVA卵蛋白：上海伯奧生物科技有限公司；乙酰膽堿：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。403H超聲霧化機(jī)：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；EMKA-WBP清醒小動物給藥和呼吸生理檢儀：法國EMKA Technologies；光鏡:OLYMPUS。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，50只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成5組，分別為正常對照組、模型組、地塞米松組、仙麻平喘湯合煎液組、仙麻平喘湯混合液組，每組10只。用OVA致敏以及激發(fā)進(jìn)行造模[1]，周期為28 d，第1天與第8天在小鼠皮下和腹腔注射0.1 mL/只(每0.2 mL含OVA 0.1 mg,AL(OH)30.02 mg)進(jìn)行OVA致敏，致敏后第15～28天，用5%OVA進(jìn)行霧化，20 min/次，每天1次；正常組予生理鹽水注射或霧化。于致敏后第19天，地塞米松組予地塞米松磷酸鈉注射液(0.3 mg/kg)灌胃，仙麻平喘湯合煎液組予合煎液(25.2 g/kg)灌胃，仙麻平喘湯混合液組予混合液(25.2 g/kg)灌胃，正常組用等體積生理鹽水灌胃；每天1次，連續(xù)灌胃10 d。于第29天行檢測。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 肺功能檢測 將實(shí)驗(yàn)小鼠放入調(diào)整好的清醒小動物給藥和呼吸生理檢測儀激發(fā)室中，采用乙酰膽堿液進(jìn)行激發(fā)，每次激發(fā)1 min，連續(xù)激發(fā)并進(jìn)行記錄，激發(fā)濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00 g/L；記錄小鼠氣道阻力(RI)。

2.2.2 外周血嗜酸細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù) 肺功能測定完畢后，麻醉小鼠，目眶采血20 μL，加入EOS計(jì)數(shù)液0.38 mL，充分混合搖勻，調(diào)整顯微鏡目鏡倍數(shù)10×10，隨機(jī)選取10個(gè)大方格，并計(jì)錄EOS數(shù)量(X)。EOS數(shù)量=X×20×109個(gè)/L。

2.2.3 肺組織病理學(xué)觀察 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，取右肺上葉用10%福爾馬林固定，嚴(yán)格按照HE染色步驟進(jìn)行操作，先進(jìn)行脫水，再石蠟包埋，然后切片、染色，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺功能檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組小鼠氣道阻力(RI)測定結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液、地塞米松可以抑制不同濃度乙酰膽堿液(Ach)激發(fā)狀態(tài)下小鼠氣道的penh值，具有一定的緩解和干預(yù)作用，統(tǒng)計(jì)分析說明地塞米松組的抑制作用較明顯，而仙麻平喘湯合煎組以及仙麻平喘湯混合組與地塞米松組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 各組小鼠外周血EOS計(jì)數(shù)比較 見表2。

表2 各組小鼠外周血EOS計(jì)數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠經(jīng)卵蛋白致敏和刺激后，小鼠體內(nèi)的應(yīng)激提高，出現(xiàn)過敏反應(yīng)，而且血液中EOS的計(jì)數(shù)也明顯增多，地塞米松、仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液均對小鼠的EOS表達(dá)有明顯的抑制作用，三者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組小鼠肺組織病理變化 正常組：正常肺小葉結(jié)構(gòu)，肺泡上皮細(xì)胞無變性﹑無壞死、無脫落，肺間隔、肺泡腔及支氣管腔、支氣管壁完整，細(xì)胞排列規(guī)整。模型組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞，肺泡上皮細(xì)胞壞死脫落，1/3肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤和肺泡壁充血，支氣管平滑肌厚度明顯增加，證明小鼠出現(xiàn)哮喘的病理表現(xiàn)。地塞米松組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度輕度增加，局部肺泡上皮細(xì)胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細(xì)胞浸潤。仙麻平喘湯合煎液組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度略有增加，局部肺泡上皮細(xì)胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細(xì)胞浸潤。仙麻平喘湯混合液組：肺小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，支氣管平滑肌厚度輕度增加，局部肺泡上皮細(xì)胞有壞死脫落，肺泡間質(zhì)內(nèi)具有輕度的炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組小鼠肺組織病理觀察結(jié)果(HE，×200)

4 討論

支氣管哮喘是常見呼吸系統(tǒng)疾病之一，黃帝內(nèi)經(jīng)《素問·陰陽別論篇第七》中既有其相關(guān)癥狀的詳細(xì)論述“陰爭于內(nèi)，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”。在引起哮喘發(fā)病的眾多病因中，風(fēng)寒襲肺當(dāng)居于首位，《證治心得》中的“風(fēng)寒之邪受自皮毛故得以入肺而為喘……”的記載；趙西斌等[2]總結(jié)兒童哮喘常由風(fēng)寒等外因以及肺脾腎三臟陽氣不足，兩寒相合，故氣逆而上導(dǎo)致哮喘。仙麻平喘湯以溫陽益氣為主，兼以平喘化痰，全方由臨床常用的經(jīng)典古方射干麻黃湯加淫羊藿、黃芪等而成?！督饏T要略》有言：“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，在辛鳳[3]報(bào)道的研究中發(fā)現(xiàn)，射干麻黃湯可減少哮喘患者EOS的增加，并能促進(jìn)EOS的凋亡，能調(diào)控TRPV2 mRNA的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)生長因子(NGF)、前列腺素(PGs)的過度釋放，減輕TRPV2誘發(fā)與促進(jìn)氣道高反應(yīng)性和慢性炎癥的刺激，多環(huán)節(jié)治療哮喘。另外研究還發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯治療哮喘性肺炎大鼠肺組織中的炎癥因子IL-4、IL-13及TNF-α的表達(dá)與射干麻黃湯的劑量成負(fù)相關(guān)[4]。

仙麻平喘湯是在射干麻黃湯方中加入黃芪和淫羊藿，本方既可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，還能對抗氧自由基，增強(qiáng)機(jī)體抗缺血、缺氧能力，另外黃芪在促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，減輕支氣管黏膜炎性水腫，改善臨床癥狀，減少環(huán)磷酸苷分解，松弛支氣管平滑肌，促進(jìn)排痰，擴(kuò)張血管，降低血流阻力等方面均有良好的療效[5]。另有研究證實(shí)，黃芪和淫羊藿聯(lián)合，不但能減輕哮喘氣道炎癥，提高療效，減輕患者對激素的依賴性,減少激素用量,而且還可改善下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能,促進(jìn)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的釋放[6]。

本實(shí)驗(yàn)中用卵蛋白致敏小鼠后，又經(jīng)卵蛋白霧化刺激，導(dǎo)致小鼠的肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤和肺泡壁充血，支氣管平滑肌厚度增加，說明造模的方法是可行的，而且血液檢查EOS也證明，小鼠血液中EOS的計(jì)數(shù)明顯增多，應(yīng)激增高，出現(xiàn)過敏反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)還通過清醒小動物給藥和呼吸生理檢測儀對小鼠的氣道阻力進(jìn)行測定，同樣也證明小鼠的氣道有痙攣的存在。

從本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然小鼠氣道的反應(yīng)性和乙酰膽堿(Ach)的濃度成正相關(guān)，隨著Ach濃度的增加，小鼠氣道反應(yīng)性數(shù)據(jù)penh也增加，但仙麻平喘湯合煎液、仙麻平喘湯混合液以及地塞米松均有干預(yù)小鼠氣道高反應(yīng)的作用，最后結(jié)果表明，仙麻平喘湯合煎液與混合液的療效均可起干預(yù)效果，說明仙麻平喘湯有良好的宣肺平喘作用。