廣西厚皮甜瓜根腐病病原菌鑒定及抗病種質篩選

葉云峰，解華云，杜嬋娟，李天艷，趙廷昌，楊 迪，覃斯華，黃金艷，洪日新，何 毅，付 崗

（1.廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院園藝研究所 南寧 530007； 2.廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院植物保護研究所南寧 530007； 3.中國農業(yè)科學院植物保護研究所 北京 100093）

厚皮甜瓜（L.ssp.）是廣西地區(qū)重要的園藝作物和經濟作物，栽培面積約0.67 萬hm，南寧市和北海市為主要種植區(qū)，柳州市、來賓市、桂林市等地區(qū)也有少量種植。在廣西，厚皮甜瓜必須在保護地內種植才能獲得成功。溫暖濕潤的亞熱帶氣候使得甜瓜在該地區(qū)每年可以種植2 茬，但高溫多雨的氣候特點，加之2 茬種植缺乏輪作機制，致使該地區(qū)甜瓜病害發(fā)生程度遠高于北方地區(qū)，土傳病害尤甚。近年來，甜瓜根腐病發(fā)生嚴重，并感染所有當?shù)刂髟云贩N，造成大量植株在瓜采收前10～15 d 開始整株萎蔫枯死，病株果實不能正常膨大和成熟，品質和產量顯著下降。發(fā)病率普遍達20%以上，嚴重的大棚發(fā)病率在80%～100%，減產20%～40%，嚴重制約了廣西甜瓜產業(yè)的健康發(fā)展。

我國其他地區(qū)也有甜瓜根腐病發(fā)生的報道。20 世紀80 年代末，該病害首先在新疆喀什地區(qū)巴楚、伽師、岳普湖等縣開始發(fā)生，90 年代初迅速傳遍喀什地區(qū)各縣市，重病田發(fā)病率達100%，造成毀滅性損失。20 世紀90 年代至21 世紀初，山東費縣甜瓜根腐病造成20%以上的減產。甜瓜根腐病蔓延快、危害大、造成的損失重，于21 世紀初發(fā)展成為我國西北和東部地區(qū)的重要病害之一。

目前，國內已報道能引起甜瓜根腐病的病原菌有多種，分別是腐皮鐮孢菌（）、黑點根腐病菌（）、黑腐病菌（）和尖孢鐮孢菌（）等。國外報道的甜瓜根腐病菌主要有黑點根腐病菌（.）、腐皮鐮孢菌（.）、瓜果腐霉（）、立枯絲核菌（）和層出鐮刀菌（.）等。而引起廣西地區(qū)厚皮甜瓜根腐病的病原菌分類地位尚未明確。

甜瓜根腐病屬于土傳病害，防治困難。目前，尚無高效防治方法，而篩選抗病種質資源、選育和應用抗病品種，是最安全、有效的防治措施。國內外目前關于甜瓜根腐病抗源篩選研究的報道極少。僅見國內的楊穎等從薄皮甜瓜種質資源中鑒定篩選到高抗材料16 份，為挖掘抗病基因資源改良厚皮甜瓜根腐病抗性打下了基礎。國外未見有相關研究報道。

為了明確廣西地區(qū)厚皮甜瓜根腐病病原菌的分類地位和篩選抗病種質材料，筆者對采集于厚皮甜瓜主產區(qū)南寧市和北海市的病樣進行病原菌分離純化，通過致病性測定試驗確定病原菌株，結合形態(tài)學和分子生物學特征對病原菌進行分類鑒定。同時，通過苗期抗病性鑒定方法從厚皮甜瓜種質資源中篩選抗病材料，旨在為甜瓜根腐病的防治和抗病育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供致病性測定的厚皮甜瓜品種為北甜1 號，是當?shù)刂髟云贩N之一，易感根腐病。供抗病性鑒定的27 份厚皮甜瓜材料是由廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院園藝研究所通過多年自交純化和篩選獲得的純系材料，編號分別為：M5、M23、M57、M63、M66、M73、M75、M77、M78、M79、M81、M84、M85、M87、M88、M90、M93、M95、M97、M100、M102、M106、M108、M112、M123、M125 和M128。

1.2 病害癥狀觀察及病樣采集

2021 年3—6 月在厚皮甜瓜整個生長期觀察甜瓜根腐病的發(fā)生發(fā)展情況，并進行記錄和拍攝。在廣西南寧市武鳴區(qū)和北海市銀海區(qū)等厚皮甜瓜主產區(qū)采集病樣，兩地種植品種均為北甜1 號，種植時間為3 月上旬，株距0.6 m，行距1.0 m，武鳴區(qū)采樣地連片種植面積6.7 hm2，采集病樣6 份，樣品編號為T1～T6，銀海區(qū)采樣地連片種植面積10 hm2，采集病樣6 份，樣品編號為T7～T12。取樣時注意區(qū)分根腐病和枯萎病病株，根腐病病株莖基部維管束不變褐或者變褐但不向莖蔓擴展，環(huán)境濕度大時，莖基部有白色霉狀物，莖蔓裂口處無琥珀色膠狀物溢出，病部無縊縮；枯萎病病株維管束變褐，逐步向莖蔓擴展，環(huán)境濕度大時，莖基部有白色或粉紅色霉狀物，莖蔓裂口處有琥珀色膠狀物溢出，病部稍縊縮。

1.3 病原菌的分離純化

采用組織分離法進行病原菌分離。從病株根部的病健交界處切取5 mm×3 mm×1 mm 的組織塊，75%乙醇消毒20 s，0.1%升汞消毒1 min，無菌水清洗4 次，置于PDA 平板培養(yǎng)基上，每皿放3 個組織塊，每份樣品分離3 皿，28 ℃下培養(yǎng)4 d，選擇出現(xiàn)率高且形態(tài)一致的菌落，采用單孢分離法進行菌株純化。

1.4 病原菌的致病性測定

從純化獲得的菌株中選5 株代表性菌株接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)12 d，用無菌水將培養(yǎng)基上的分生孢子洗下，制成濃度為1×10個·mL的孢子懸浮液備用。甜瓜種子于32 ℃下催芽48 h后種于70 孔的育苗盤上，于育苗棚內生長7 d 后，甜瓜幼苗的子葉展平，將其從營養(yǎng)杯中輕柔拔出，將根部置于孢子懸浮液中浸泡15 min 后再植入育苗盤中，以清水浸根的植株為對照，每個菌株接種20 株幼苗，3 次重復。用薄膜覆蓋保濕48 h，溫度保持在25～35 ℃。定期觀察植株發(fā)病情況，確定發(fā)病癥狀與根腐病癥狀是否一致，如果一致，從發(fā)病組織上進行病原菌分離，并確定分離所得菌株與接種菌株形態(tài)特征是否一致，如果一致可確定為病原菌。

1.5 病原菌的分類鑒定

1.5.1 病原菌的形態(tài)學鑒定 將具有致病性的菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落生長情況和形態(tài)特征，在光學顯微鏡下觀察產孢結構及分生孢子的形態(tài)，并測量50 個分生孢子的大小。

1.5.2 病原菌的分子生物學鑒定 采用真菌DNA提取試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）對5個病原菌株的總DNA 進行提取。使用通用引物ITS1（5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對病原菌的核糖體轉錄間隔區(qū)序列（ITS）進行基因擴增。PCR 反應體系和反應程序參考葉云峰等的方法。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認有目標條帶后，委托北京擎科生物科技公司進行測序。測序結果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 同源性比對，并采用MEGA-X 軟件的Neighbor Joining法構建基于rDNA-ITS 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定病原菌的分類地位。

1.6 甜瓜種質材料的抗病性鑒定

試驗于2021 年8—10 月在南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)可利村的大棚育苗基地開展。病原菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備、接種和甜瓜材料的種植參考1.4 的方法，每份材料接種10 株幼苗，3 次重復，定期觀察和記錄發(fā)病情況。接種病原菌40 d 時，對種質材料進行抗性水平鑒定，抗性劃分標準參考楊穎等的標準，略作修改（表1）。

表1 甜瓜根腐病抗性分級標準

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

該病害主要發(fā)生在大棚甜瓜生長中后期，坐果后15～20 d 開始有少量植株出現(xiàn)葉片黃化并萎蔫的癥狀，萎蔫植株早晚可恢復正常，反復3～5 d 后，整株萎蔫枯死不再恢復。在坐果后30～35 d（收瓜前10 d 左右），發(fā)病達到高峰期，出現(xiàn)大量萎蔫枯死植株（圖1-A）。病株果實較正常植株的果實小，不能正常膨大和成熟。植株根部皮層褐色干腐，容易斷根，須根少（圖1-B、C）。環(huán)境濕度大時，莖基部產生少量白色霉狀物。剖開莖基部，有部分病株可看到莖基部維管束變褐色，但不向莖蔓擴展（區(qū)別于枯萎?。Ｈ缗龅竭B續(xù)陰雨天后天氣忽然變晴的情況，病害發(fā)生嚴重。

圖1 厚皮甜瓜根腐病田間癥狀

2.2 病原菌的分離純化

分離的病樣組織塊被培養(yǎng)4 d 后，共長出103個真菌菌落，其中有89 個白色菌落形態(tài)一致，占總數(shù)的86.4%，所有病樣的分離物中都有這種菌落，每份病樣選擇其中1 個菌落進行單孢分離純化，共獲得12 個純化的菌株，編號為TG1～TG12，與病樣編號T1～T12 相對應。

2.3 病原菌的致病性測定

接種病原菌后20～25 d，所有處理的植株都開始出現(xiàn)病癥，子葉陸續(xù)開始黃化或枯死；接種后30～35 d ，基部真葉開始黃化或枯死，根部出現(xiàn)褐色病斑或腐爛（圖2-A）；55～65 d ，整株葉片黃化或枯死（圖2-B）。對照植株無癥狀（圖2-C）。對病株根部進行病原再分離，得到的菌株形態(tài)特征與接種菌株一致，表明接種的菌株是甜瓜根腐病的病原菌。

圖2 厚皮甜瓜接種病原菌后的發(fā)病癥狀

2.4 病原菌的分類鑒定

2.4.1 病原菌的形態(tài)學鑒定 在PDA 培養(yǎng)基上，菌落圓形、平鋪，氣生菌絲白色、絨毛狀（圖3-A），培養(yǎng)基背面乳白至黃褐色，有藍色色素（圖3-B）。菌絲無色、分枝、平滑，具隔膜。小型分生孢子腎形或卵圓形，（5.1～15.5）μm×（2.9～4.6）μm。大型分生孢子紡錘形、直或稍彎曲，兩端鈍圓，頂孢稍彎，多為1～3 個 隔 膜，（22.9～33.5）μm×（4.4～6.4）μm（圖3-C）。產孢細胞為長筒形單瓶梗（圖3-D），長在氣生菌絲上。

圖3 病原菌形態(tài)特征

2.4.2 病原菌的分子生物學鑒定 經PCR 擴增和電泳檢測，5 個菌株TG1、TG3、TG5、TG7 和TG8 均獲得長度約為530 bp 的電泳條帶。擴增產物經測序，均獲得了對應的rDNA-ITS 基因序列。5 段基因序列（GenBank 登錄號：OL308582～OL308586）分別在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行了BLAST 同源性比對。結果表明，與這些序列同源性最高的均為腐皮鐮孢菌（.）的菌株，同源性均達99%以上。采用MEGA-X 軟件構建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結果表明，5 個菌株的rDNA-ITS 基因序列均與.聚于同一最小分支。結合形態(tài)學和分子生物學鑒定結果，將廣西厚皮甜瓜根腐病的病原菌鑒定為腐皮鐮孢菌（.）。

圖4 基于rDNA-ITS 序列的病原菌菌株與其他相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 甜瓜種質材料的抗病性鑒定

抗病性鑒定結果表明，不同甜瓜材料的抗性水平不同，在27 份甜瓜材料中表現(xiàn)高抗的材料有3份，分別為M87、M102 和M125，占供試材料的11.11%；表現(xiàn)抗的材料有6 份，分別為M23、M78、M84、M100、M112 和M123，占供試材料的22.22%；表現(xiàn)感的材料有7 份，占供試材料的25.93%；表現(xiàn)高感的材料有11 份，占供試材料的40.74%（表2）。

表2 不同厚皮甜瓜種質材料對甜瓜根腐病的抗性水平

3 討論與結論

根腐病近年來在廣西大棚厚皮甜瓜主產區(qū)發(fā)生日益嚴重，并上升為重要病害之一。本試驗對該病的病原菌進行分離和致病性測定，并結合形態(tài)學和分子生物學特征將其鑒定為腐皮鐮孢菌（.）。鑒定結果與北京、新疆、山東費縣等地區(qū)的甜瓜根腐病菌鑒定結果一致。此外，甘肅省中部半干旱種植區(qū)的甜瓜根腐病菌被鑒定為黑點根腐病菌（.）。甘肅皋蘭地區(qū)的甜瓜根腐病菌被鑒定為尖孢鐮孢菌甜瓜?；停?f. sp.）及黑點根腐病菌（.）。黑龍江省齊齊哈爾地區(qū)的甜瓜根腐病菌被鑒定為黑腐病菌（.）?？梢?，在我國能引起甜瓜根腐病的病原菌多樣化，因此，及時、準確鑒定出病原菌的分類地位，有利于病害的針對性防控和降低經濟損失。

據(jù)報道，由腐皮鐮孢菌引起的甜瓜根腐病在不同生育期的發(fā)病癥狀和類型不同，主要有猝倒型（苗期發(fā)生）、根腐型（各生育期均可發(fā)生）、萎蔫型（伸蔓期、開花坐果期發(fā)生）和果腐型（中后期發(fā)生）。經調查，廣西地區(qū)的厚皮甜瓜根腐病癥狀主要是萎蔫型，其癥狀與甜瓜枯萎病癥狀極其相似，需仔細區(qū)分并采取對應的防治措施。

國內外關于甜瓜根腐病抗源篩選研究的報道極少。僅見國內的楊穎等開展了相關研究，認為厚皮甜瓜根腐病抗源貧乏，于是從薄皮甜瓜種質資源中鑒定篩選到高抗材料16 份，表明薄皮甜瓜種質資源中蘊含著對改良厚皮甜瓜根腐病抗性有潛在利用價值的基因資源。本試驗對27 份厚皮甜瓜材料進行了苗期抗病性鑒定，篩選到抗性水平為高抗和抗的材料分別為3 份和6 份，表明厚皮甜瓜種質材料中也蘊含抗病基因資源，下一步有望從更多的厚皮甜瓜種質材料中挖掘高抗資源。此外，在厚皮甜瓜材料的苗期抗病性鑒定試驗中，發(fā)現(xiàn)厚皮甜瓜在接種病原菌后發(fā)病進程比楊穎等描述的薄皮甜瓜的發(fā)病進程更加緩慢。本試驗在參考薄皮甜瓜根腐病抗性分級標準的基礎上，結合厚皮甜瓜接種病原菌后的實際發(fā)病情況，制定了適用于厚皮甜瓜的根腐病抗性分級標準，為后續(xù)開展厚皮甜瓜材料抗病性評價提供借鑒。

本試驗首次明確了廣西地區(qū)厚皮甜瓜根腐病病原菌為腐皮鐮孢菌（.），并篩選到抗性水平為高抗和抗的材料共9 份，為甜瓜根腐病的防治和抗病育種奠定了基礎。