霉魚生產(chǎn)過程中品質(zhì)特性變化研究

劉旭坤，趙 利*

(1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，330013，南昌；2.江西省水產(chǎn)加工及安全控制研究中心，330013，南昌)

0 引言

傳統(tǒng)自然發(fā)酵霉魚風(fēng)味獨特、咸香適口，極具地方特色，是江西吉安撫州一帶的特色美食。霉魚的主要原料是鳙魚塊、辣椒粉和鹽，經(jīng)過晾干、腌制，在室溫下厭氧發(fā)酵直到形成典型的香味[1-4]。加工過程中霉魚的品質(zhì)變化涉及肌肉組織中多種物質(zhì)的氧化、合成、降解、相互作用等。蛋白質(zhì)作為原料的主要化學(xué)成分，在加工中通過水解、氧化、產(chǎn)物互作等多種途徑影響發(fā)酵和成熟過程中產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤和質(zhì)構(gòu)[3]。

通常在發(fā)酵10 d左右即可得到具有傳統(tǒng)風(fēng)味的霉魚產(chǎn)品，然后一直處于油浸密封狀態(tài)下繼續(xù)發(fā)酵保藏，食用周期可至3個月甚至半年之久[4-5]。霉魚現(xiàn)多由作坊加工生產(chǎn)，還未出現(xiàn)完善的企業(yè)標準。霉魚在發(fā)酵保藏期間，可能會發(fā)生質(zhì)地、風(fēng)味品質(zhì)改變，導(dǎo)致出現(xiàn)安全性問題。評價其品質(zhì)和安全性顯得尤為重要。本研究以不同加工階段的霉魚為研究對象，通過微生物、物理、化學(xué)以及感官4種評價方法以綜合評價霉魚在不同加工階段的品質(zhì)變化，并對蛋白質(zhì)在加工過程中的結(jié)構(gòu)間的變化及這些變化對品質(zhì)的影響進行了深入研究，為尋找合理的發(fā)酵保藏時段及探究霉魚的品質(zhì)變化機理提供一定的理論依據(jù)，為霉魚的安全食用及工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮鳙魚：購自江西南昌樂買佳超市；三氯乙酸；乙醇；甲醛；三氯甲烷；亞鐵氰化鉀；硫氰酸銨；氯化亞鐵；乙二胺四乙酸二鈉；硫代巴比妥酸：化學(xué)試劑均為分析純；平板計數(shù)培養(yǎng)基(PCA)；孟加拉紅瓊脂；結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRGBA)。

1.2 儀器與設(shè)備

CT3-4500質(zhì)構(gòu)儀：美國Brookfield公司；Color i7色差儀：美國Xrite公司；TGL-16G高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 霉魚制備與樣品處理 鮮鳙魚洗凈，去鱗、內(nèi)臟，在20 ℃條件下懸掛晾制2 d，除去部分水分，直至魚皮皺縮，魚肉水分含量達到60%，切成2 cm大小的魚塊，加入2%姜絲、5%酒精含量50%的白酒，4 ℃下腌制1 d，樣品均勻沾裹3%鹽和3%辣椒粉混合物，放置于玻璃罐中，加入菜籽油，油浸樣品，放置于室溫(28～32 ℃)中發(fā)酵，分別在發(fā)酵15 d、30 d、45 d、60 d、75 d取樣。

1.3.2 實驗方法

1)基本營養(yǎng)成分測定。蛋白質(zhì)含量采用《GB5009.5—2010》凱氏定氮法測定；脂肪含量參照《GB 5009.6—2016》索氏抽提法測定；水分參照《GB5009.3—2010》中直接干燥法測定。

2)色澤測定。使用分光測色儀測定魚塊的亮度值L*、紅綠值a*以及藍黃值b*。其中L*為亮度值，L*值越大則樣品光澤度越好，a*值越大樣品越紅，反之越綠，b*值越大則樣品越黃，反之越藍。

3)ATP質(zhì)構(gòu)分析。肉塊切成厚度1.5 cm進行質(zhì)構(gòu)分析[6]。質(zhì)構(gòu)儀選擇ATP模式測定，探頭選擇TA25/1000，壓縮距離5 mm，數(shù)據(jù)頻率50點/s，循環(huán)2次，每個樣品測3組平行。

4)pH值的測定。采用《GB/T9695.5—2008》方法測定。

5)TVB-N值測定。采用《GB 5009.228—2016》方法測定。

6)亞硝酸鹽測定。采用《GB 5009.33—2010》方法測定。

7)POV值的測定。參考Wang方法[7]，有所改動。取2.00 g樣品加入15 mL三氯甲烷甲醇混合液(2:1)和3 mL 0.5%NaCl均質(zhì)1 min，震蕩5 min，后以3 000 r/min離心5 min。取下層清液5 mL加入5 mL三氯甲烷甲醇混合液，一滴硫氰酸銨一滴氯化亞鐵，反應(yīng)5 min后于500 nm處測吸光度(A500)。

8)TBARS值的測定。取10.00 g樣品加入50 mL 7.5%三氯乙酸溶液(內(nèi)含有0.1%EDTA)，分散機分散后震蕩30 min，雙層濾紙過濾。取5 mL濾液加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液，90 ℃反應(yīng)40 min，取出室溫下冷卻，加入5 mL三氯甲烷，渦旋1 min靜置分層。取上層液體分別于波長532 nm(A532)以及600 nm(A600)處測吸光度，計算TBARS值[8]。

式中：155為丙二醛摩爾吸光系數(shù)，72.6為其相對分子質(zhì)量。

9)微生物測定。菌落總數(shù)使用《GB 4789.41—2016》方法測定。腸桿菌使用《GB 4789.41—2016》方法測定。

10)肌原纖維蛋白及肌漿蛋白的提取。稱量樣品3.0 g，加入10倍體積的緩沖液A(0.02 mol/L磷酸緩沖溶液，pH6.5)在分散機1 500 r/min條件下分散10 min，4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，上清液在15 000 r/min離心5 min，上清液為肌漿蛋白。取沉淀加入緩沖溶液B(0.1 mol/L pH6.5磷酸緩沖溶液，其中含 0.7 mol/L KI)分散機1 500 r/min條件下分散10 min，13 000 r/min離心15 min，上清液為肌原纖維蛋白，以雙縮脲法測蛋白濃度[9]。

11)蛋白氧化指標的測定。1 mL蛋白溶液中加入1 mL 10 mmol/L DNPH(以2 mol/L HCl溶解)，渦旋混勻，溶液37 ℃下保溫1 h，加入1 mL 20%三氯乙酸后渦旋30 s，10 000 r/min離心5 min，沉淀用乙酸乙酯乙醇混合液(溶液體積比1:1)洗至無色，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液在37 ℃下保溫20 min，沉淀溶解后10 000 r/min離心5 min，上清液在370 nm處測吸光度，計算羰基含量[10]。

1 mL蛋白溶液加入9 mL 0.2 mol/L緩沖溶液(含有8 mol/L尿素，2%SDS，10 gEDTANa2，pH6.8)混勻，取4 mL混合液加入0.4 mol 0.1%DTNB(0.2 mol/L緩沖溶液，pH8.0溶解)渦旋混勻，40 ℃中保溫25 min，412 nm處測吸光度，計算巰基含量。

12)感官評價。邀請10位經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的同學(xué)，對不同發(fā)酵階段的霉魚進行感官評價，評價從色澤、氣味、質(zhì)地、滋味(蒸熟)幾個方面進行。評分標準如表1所示。

表1 感官評價標準表

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果以平均值±標準差表示，使用Origin作圖，SPSS22進行單因素方差方分析、相關(guān)性分析。P<0.01 表示極顯著，P<0.05 表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工階段霉魚基本營養(yǎng)成分變化

由表2可知，樣品中水分、蛋白質(zhì)、脂肪含量在加工過程中變化顯著(P<0.05)，蛋白質(zhì)和脂肪在發(fā)酵過程中呈下降趨勢，說明蛋白質(zhì)和脂肪在發(fā)酵過程中發(fā)生了降解，蛋白質(zhì)降解由魚體內(nèi)的內(nèi)源性蛋白酶以及微生物產(chǎn)生的蛋白酶誘導(dǎo)形成低分子量化合物，如肽、氨基酸、醛、有機酸，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)地和風(fēng)味。發(fā)酵過程中脂解釋放的游離脂肪酸經(jīng)過氧化產(chǎn)生醛和酮，更能促進發(fā)酵產(chǎn)品的典型風(fēng)味形成[2]。水分在干燥和腌制過程中降至63.88%，發(fā)酵后有所回升并維持在69%～71%，可能是由于添加的白酒等腌料的水分影響。由于添加了3%的食鹽利于水分析出，水分含量下降；pH值下降，魚肉蛋白發(fā)生氧化和降解變化劇烈，使得魚肉纖維變的緊密；同時，油封密閉環(huán)境，水分難以蒸發(fā)，發(fā)酵過程中水分含量變化較小。

表2 不同加工階段霉魚基本成分變化(g/100g濕基)

2.2 物理特性變化與霉魚品質(zhì)評價

2.2.1 質(zhì)構(gòu)(TPA)特性變化 TPA測試中各項指標可以反映霉魚的感官品質(zhì)和蛋白脂肪等主要成分變化。霉魚在加工過程中質(zhì)構(gòu)特性變化見表3，咀嚼性與彈性、內(nèi)聚性以及硬度有關(guān)，咀嚼性的變化是霉魚品質(zhì)變化的重要指標之一。在霉魚各加工階段，咀嚼性變化顯著(P<0.05)，在F3階段達到最高值，分別是R的5.5～6.8倍，可能是由于鹽和發(fā)酵產(chǎn)酸共同作用使得蛋白變性導(dǎo)致酸凝膠化加劇，形成霉魚的特征質(zhì)構(gòu)。內(nèi)聚性在腌制階段降低至0.52可能由于加入腌料破壞了樣品內(nèi)部結(jié)合鍵強度，發(fā)酵階段內(nèi)聚性增加顯著可能由于pH值下降引起的內(nèi)部結(jié)合鍵強度升高[11-12]。

表3 不同加工階段霉魚的質(zhì)構(gòu)特性變化

2.2.2 不同加工階段霉魚色澤的變化 色澤是影響消費者對產(chǎn)品喜好程度的重要指標之一。霉魚在不同加工階段中色澤變化如表4所示，干燥(D)和腌制(S)過程中L*、a*和b*值變化不顯著，在發(fā)酵過程中均變化顯著(P<0.05)，色度值變化可能與水分變化有關(guān)，隨著樣品水分含量下降則L*值升高，a*值隨之減小，b*值升高[13-14]。此外顏色變化也與脂肪氧化、蛋白氧化相關(guān)[15]。

表4 不同加工階段霉魚的色差變化

2.3 化學(xué)特性變化與霉魚品質(zhì)評價

2.3.1 不同加工階段對霉魚pH值的影響 由圖1可知，pH值整體呈下降趨勢，可能由于微生物活動消耗碳源，代謝產(chǎn)物累積，總酸含量升高，F(xiàn)1發(fā)酵階段迅速下降，F(xiàn)2、F3、F4發(fā)酵階段變化不顯著，pH下降導(dǎo)致蛋白酸變性和聚集，從而影響霉魚口感，可能也會影響內(nèi)源蛋白酶及微生物酶的水解作用，變化不顯著可能與所產(chǎn)生的有機酸的緩沖能力有關(guān)。發(fā)酵后期pH值上升可能與內(nèi)源性或微生物酶產(chǎn)生的氨等降解產(chǎn)物或揮發(fā)性堿化合物的形成有關(guān)[16]。

圖1 不同加工階段霉魚的pH值變化

2.3.2 不同加工階段霉魚TVB-N值變化 不同加工階段霉魚的TVB-N值變化如圖2所示。TVB-N含量在加工過程中呈不斷上升趨勢，在干燥(D)、腌制(S)階段變化不顯著，發(fā)酵階段變化顯著(P<0.05)。在F1階段，TVB-N值略高于國家TVB-N 的一級淡水魚鮮度(≤15 mg/100g)；繼續(xù)發(fā)酵，TVB-N含量持續(xù)上升，F(xiàn)3至F4階段增長迅速，在F4階段其含量達34.65 mg/100g，超出國家TVB-N二級鮮度限值(≤25 mg/100g)。在F1、F2和F3階段TVB-N增長緩慢可能是由于pH值較低，發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌素中和了一部分TVB-N。如果以歐盟訂立的TVB-N在魚肉中不得高于35 mg/100g標準為參考[17]，則霉魚以發(fā)酵方式保藏的可食用時間不超過60 d(F4)，但這還需與其它指標結(jié)合綜合判斷。TVB-N值變化趨勢與林城杏酸魚一致[18]。

圖2 不同加工階段霉魚的TVB-N值含量變化

2.3.3 發(fā)酵時間對亞硝酸鹽含量的影響 發(fā)酵過程中霉魚亞硝酸鹽含量的變化見圖3，發(fā)酵過程中霉魚亞硝酸鹽含量均遠低于國標規(guī)定的安全標準(≤30 mg/kg)， 符合國家食品衛(wèi)生標準。F1、F2階段亞硝酸鹽增長較為緩慢，可能由于酸性條件下亞硝酸鹽易被降解[19-20]。這結(jié)果與沈穎瑩發(fā)酵魚成品亞硝酸鹽含量相似[21]。

圖3 不同發(fā)酵時段霉魚亞硝酸鹽含量的變化

2.3.4 不同加工階段對霉魚脂質(zhì)氧化程度的影響 脂肪氧化對肉的品質(zhì)起決定性的影響。脂肪氧化對肉的影響有3個方面。首先是安全性，二級脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對人體有毒性；其次是生物利用度方面，必需脂肪酸的氧化會降低營養(yǎng)價值；最后會影響感官質(zhì)量，風(fēng)味和顏色發(fā)生了不期望的變化，出現(xiàn)特征劣變氣味，顏色變黃[22]。

霉魚加工過程中脂質(zhì)氧化情況，以POV和TBARS值表示(圖4)。POV值與TBARS值變化趨勢基本一致，總體呈上升趨勢。POV值通常被認為是初級脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，在加工過程中總體呈上升趨勢，干燥樣品的POV為0.020 6 mg/kg，與新鮮樣品的POV無顯著差異(P>0.05)。在腌制階段(S)時達到第一個峰值即0.226 mg/kg，并在這之后的發(fā)酵階段下降，而在發(fā)酵第60 d(F4)時升至0.382 mg/kg，其原因可能是初級氧化產(chǎn)物進一步氧化形成低分子形式的二級脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，如醛或酮等，同時氧化產(chǎn)物又不斷累積，因此POV值在發(fā)酵階段又重新升高[23]。

TBARS值是反映相對極性二級反應(yīng)產(chǎn)物濃度的良好指標，特別是醛，是肉類產(chǎn)生異味的主要原因[24]。TBARS值在S階段升至峰值達到1.203 7 mg/100g后又迅速下降，可能是形成的部分丙二醛與蛋白質(zhì)水解的產(chǎn)物游離氨基酸發(fā)生反應(yīng)或者醛類物質(zhì)進一步氧化成有機醇和羧酸等小分子物質(zhì)造成的。在發(fā)酵過程中TBARS值整體呈上升趨勢，F(xiàn)2至F5階段TBA值增長變緩，可能是因為微生物在該發(fā)酵階段生長過程中產(chǎn)生較多過氧化氫酶，從而抑制肉制品中脂肪變質(zhì)，或醛類物質(zhì)自身或與其他化合物發(fā)生了反應(yīng)，所以TBARS值增長趨勢變緩[25-26]。該研究結(jié)果與趙珠蓮等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉制品脂肪氧化趨勢相同[27]。

圖4 不同加工階段霉魚的TBARS值、POV值變化

2.4 不同加工階段霉魚中微生物的變化

發(fā)酵過程中微生物的存在有助于蛋白質(zhì)的降解以及風(fēng)味和香氣的形成[28]。以鳙魚為原料的初始菌落總數(shù)為5.34 lgCFU/g，在干燥期間空氣中的菌落附著，菌落總數(shù)升高至6.59 lgCFU/g。經(jīng)過腌制處理后略有下降(P<0.05)。室溫發(fā)酵時，菌落總數(shù)持續(xù)升高(P>0.05)，發(fā)酵15 d后，菌落總數(shù)達到7.49 lgCFU/g，后開始出現(xiàn)小幅下降，但在F4到F5階段后其含量又有所回升。在加工過程中，鹽通過抑制腐敗和致病微生物的生長，在保存中起著關(guān)鍵作用。腌制和干燥過程導(dǎo)致魚肉的水分含量和pH值降低，這些條件有利于抑制腐敗菌生長[29]。腸桿菌主要包括沙門菌屬、志賀氏菌、大腸桿菌，是霉魚發(fā)酵保藏過程中主要控制的致病菌。腸桿菌含量在發(fā)酵初期顯著下降，可能由于微生物的基數(shù)已經(jīng)處于很高水平，同種微生物之間亦存在生存空間的競爭。F3到F5階段，腸桿菌數(shù)量上升至3.49 lgCFU/g，可能由于pH值上升，對腸桿菌產(chǎn)生的抑菌作用消失。參考霉豆腐腸桿菌標準《GB 2712—2014》和《GB 29921—2021》發(fā)酵魚標準，在整個發(fā)酵過程中F1、F2和F3腸桿菌含量符合衛(wèi)生標準(<31 000 CFU)。

圖5 相關(guān)微生物含量的變化/(lgCFU/g)

2.5 不同加工階段中蛋白質(zhì)氧化規(guī)律

如圖6所示，加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量變化均顯著降低(P<0.05)，在發(fā)酵階段蛋白含量下降顯著，肌原纖維蛋白在發(fā)酵75 d(F5)時降至7.18 mg/g，肌漿蛋白降至18.83 mg/g，分別是鮮肉(R)的9.16%和33.66%，可能是由于水分含量降低，pH值下降導(dǎo)致組織蛋白酶被激活，微生物酶協(xié)同水解魚肉蛋白[24]。

蛋白羰基、巰基的含量可以反映蛋白的氧化程度[30]。加工過程中蛋白質(zhì)羰基和巰基含量變化如圖7所示。霉魚加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的羰基含量顯著上升(P<0.05)，分別由鮮魚的6.8 nmol/mg和3.07 nmol/mg，增長至19.17 nmol/mg和12.24 nmol/mg。羰基化合物的形成主要分為直接作用和間接作用，直接作用主要為賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸等側(cè)鏈直接氧化和肽主鏈的直接斷裂，間接作用主要為還原糖的非酶催化反應(yīng)即美拉德反應(yīng)以及非蛋白羰基化合物如丙二醛共價結(jié)合、4-羥基-2-壬烯醛等[31]。

加工過程中巰基含量顯著下降(P<0.05)，F(xiàn)5階段肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的巰基含量僅為鮮肉的20.62%、17.61%。巰基含量的降低可能是由于氧化破壞了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使巰基轉(zhuǎn)化為分子之間、分子內(nèi)二硫鍵或氧化成次磺酸，亞磺酸和磺酸，也可能是存在疏水相互作用等導(dǎo)致蛋白變性聚集，從而導(dǎo)致能檢測到的巰基含量降低[31]。在加工過程中蛋白質(zhì)表面的巰基被氧化，形成二硫鍵或二硫鍵發(fā)生-S-S-互換作用，使蛋白質(zhì)與水分結(jié)合的能力減弱，導(dǎo)致了持水能力的降低，對產(chǎn)品品質(zhì)產(chǎn)生間接影響[32-33]。此研究結(jié)果與曹辰辰等研究發(fā)酵香腸蛋白質(zhì)巰基含量隨時間變化的趨勢相同[34]。

圖6 不同加工階段霉魚肌原纖維蛋白和肌漿蛋白含量變化

圖7 不同加工階段霉魚羰基和巰基含量的變化

2.6 發(fā)酵時長對霉魚感官品質(zhì)的影響

F5階段TVB-N值超出標準，僅對發(fā)酵保藏的F1～F4階段進行感官評價。由表5可知，在發(fā)酵45 d前色澤更接近鮮肉，得分較高，F(xiàn)4階段色澤發(fā)黃暗淡，使得得分降低；組織形態(tài)評分隨發(fā)酵進行而肉塊變硬、組織松散，得分降低；氣味和滋味得分均是先增加后降低；F2達到最高，后續(xù)下降明顯。由感官評分可知F1、F2階段品質(zhì)良好F3、F4稍次，均可被消費者接受。

表5 不同發(fā)酵階段霉魚的感官評價結(jié)果

3 結(jié)論

本研究證實了霉魚加工過程中品質(zhì)變化及蛋白質(zhì)氧化。蛋白質(zhì)變化對霉魚品質(zhì)具有相關(guān)性，對霉魚品質(zhì)指標，如質(zhì)構(gòu)、色澤等，在發(fā)酵前期均產(chǎn)生積極作用。與新鮮魚肉相比，霉魚加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均發(fā)生顯著降解，蛋白質(zhì)、脂肪氧化持續(xù)加深；品質(zhì)分析表明霉魚硬度、咀嚼性、彈性升高增加了產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)品質(zhì)；加工中蛋白質(zhì)持續(xù)氧化顯著影響產(chǎn)品色澤的形成過程；蛋白質(zhì)、脂肪氧化顯著影響產(chǎn)品感官評分。在加工過程中各項化學(xué)指標、微生物指標均符合食品安全標準，結(jié)合感官評價，霉魚發(fā)酵保藏最佳食用時間為30 d，發(fā)酵保藏最長時間為60 d。