中空納米二氧化硅復(fù)合微球的制備及其對(duì)蛋白的親和分離

田淑芳 鄒雪艷 盧海濤 何建英 陳丹云 趙彥保 郭靜玉

中空納米二氧化硅復(fù)合微球的制備及其對(duì)蛋白的親和分離

田淑芳1,2鄒雪艷＊,2盧海濤3何建英1陳丹云1趙彥保2郭靜玉1

(1河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，開封475004)
(2河南大學(xué)特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，開封475004)
(3河南大學(xué)民生學(xué)院，開封475004)

利用水熱法合成了中空巰基納米二氧化硅微球(SiO2-SH)，然后在其表面修飾亞氨基二乙酸基團(tuán)(-IDA)，形成了中空SiO2-SH/IDA雙功能化納米微球。利用該納米微球表面的-SH和-IDA雙功能團(tuán)，可以更多的吸附溶液中的Ni2+，形成SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球從而可以更好的分離以六聚組氨酸為標(biāo)簽的(His-tagged)蛋白。結(jié)果顯示制備的樣品對(duì)分離His-tagged蛋白具有廣譜性，并且具有較好的再生能力。

中空微球；SiO2；蛋白分離；功能化；親和

近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，具有新穎拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的納米粒子引起了人們的極大興趣[1-3]。其中，中空二氧化硅材料因其具有大比表面積、高熱穩(wěn)定性和規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)在催化吸附、分離提純、生物材料、納米材料、環(huán)境、能源等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景[4-6]。特別是無(wú)機(jī)氧化物(如TiO2、 SiO2、Fe3O4等)中空微球[7-9]，因密度低、熱力學(xué)穩(wěn)定性高等特性備受關(guān)注。但在實(shí)際應(yīng)用中，僅僅依靠介孔材料骨架二氧化硅的性能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求，需要對(duì)其表面及孔道進(jìn)行功能化處理[10-12]。鎳離子親和層析法(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)隨之出現(xiàn)[13-16]，它的主要原理為六聚組氨酸鏈(His-tagged)對(duì)某些金屬離子(如Ni2+、Cu2+和Co2+)具有親和能力，能夠特異性的固定這些離子，從而達(dá)到親和分離的目的。His-tagged蛋白很容易通過(guò)微生物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)[17-18]，并且通過(guò)適當(dāng)處理，可實(shí)現(xiàn)表面修飾金屬離子的再生[19-20]。盡管如此，這些合成方法仍有一定的局限性：通過(guò)多步嫁接方式很難獲得高密度的功能化基團(tuán)，從而導(dǎo)致有限的比表面積和較低的表面金屬離子濃度，最終導(dǎo)致低的蛋白質(zhì)純化效率。

為了較好的解決這個(gè)問(wèn)題，本文采用一步法直接合成了中空巰基納米二氧化硅微球(SiO2-SH)，并在其表面修飾-IDA基團(tuán)，使之成為SiO2-SH/IDA雙功能團(tuán)復(fù)合材料，大大提高了表面Ni2+的吸附量。同時(shí)由于中空SiO2-SH本身具有較高的比表面積，從而用之分離蛋白具有更大的優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

巰基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)購(gòu)自Alfa-Aesar公司；正硅酸乙酯(TEOS)購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥98.0%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙醇胺(TEA，≥99.0%)，亞氨基二乙酸(IDA，98%)，3-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)均購(gòu)自阿拉丁公司；十六烷基三甲基氯化銨(CTAC，≥99.0%)均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

樣品的形貌及組成用透射電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-2010型，日本電子株式會(huì)社)，傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，AVATAR360型，美國(guó)尼高力公司)，熱重分析儀(TG，TGA/SDTA851e，Merrler-Toledo Instruments公司)進(jìn)行檢測(cè)；捕獲的Histagged蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)(SDS-PAGE，Power PAC 300，鄭州寶賽科貿(mào)有限公司)，穩(wěn)壓電壓是70 V，分離電壓是120 V。捕獲蛋白的含量用紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis，nanodrop 2000c，美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為400 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 SiO2-SH的制備

在50 mL燒瓶中加入17 mL水，2.8 mL無(wú)水乙醇，0.03 g CTAC，攪拌10 min后加入1.1 mL TEA，繼續(xù)攪拌20 min后升溫至60℃，加入1.4 mL TEOS和1.4 mL MPS的混合物，繼續(xù)反應(yīng)3 h。得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 mL高壓反應(yīng)釜中，于110℃反應(yīng)48 h，自然冷至室溫。離心后沉淀用鹽酸乙醇溶液洗滌3次。最后用無(wú)水乙醇洗滌3次后于60℃烘干，即得到SiO2-SH樣品。

1.2.2 SiO2-SH/IDA的制備

稱取1.7 g IDA，加入20 mL去離子水溶解在燒瓶中，然后用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值為11，在0℃冰浴條件下，邊攪拌邊加入2 mL GPTMS，隨后將溶液加熱至65℃，反應(yīng)12 h。取3 mL GPTMS-IDA溶液將其pH值調(diào)制為2，加入0.1 g SiO2-SH微球，分散后升溫至90℃反應(yīng)3 h，溶液離心、洗滌后得到SiO2-SH/IDA樣品。

1.2.3 SiO2-SH/IDA微球吸附Ni2+

準(zhǔn)確稱取3 mg SiO2-SH/IDA樣品，分散在50 mL的2 mol·L-1NiCl2溶液中，于25℃水浴震蕩反應(yīng)2 h，之后沉淀用去離子水洗滌6次，分散在1 mL 25%的乙醇中備用，即得SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品。

1.2.4 SiO2-SH/IDA-Ni2+微球?qū)is-tagged蛋白的分離

文中分離的蛋白為His-tagged Thioredoxin(Histagged TRX)[20]，來(lái)自于PET-32a質(zhì)體[21]，六聚組氨酸為標(biāo)簽的重組質(zhì)體被植入大腸桿菌體內(nèi)，并用常規(guī)的方法進(jìn)行蛋白的表達(dá)[22]。一般來(lái)說(shuō)，所有Histagged融合蛋白都可以用親和分離的方法捕獲分離。蛋白分離的具體步驟如下：首先用1 000μL破菌buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl)洗滌SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合材料，然后將這些復(fù)合材料分散到1 500μL細(xì)胞裂解液中，在搖床上(90 r· min-1)4℃孵育2 h。隨后，將捕獲了目標(biāo)蛋白的復(fù)合材料用破菌buffer離心洗滌數(shù)次以去除表面殘留的蛋白。最后，捕獲的His-tagged TRX蛋白用一定濃度的300μL咪唑進(jìn)行洗脫，取適量洗脫后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM分析

圖1為制備樣品的TEM圖，從圖中可以看出，制備的樣品為中空微球，內(nèi)部有多處中空，樣品粒徑均一，分散性好，平均粒徑為90 nm，殼層較厚。

圖1 制備SiO2-SH樣品的TEM圖Fig.1 TEM image of the prepared SiO2-SH sample

2.2 FT-IR分析

圖2給出了所制備的SiO2-SH/IDA樣品的FTIR圖。從圖中可以看出，1 124、801和471 cm-1均有明顯的紅外吸收峰，歸因于Si-O-Si的反對(duì)稱及反對(duì)稱伸縮吸收峰和彎曲振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明該樣品的主要成分為SiO2[23-24]。2 550 cm-1處的強(qiáng)峰對(duì)應(yīng)微球中-SH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)[25]，說(shuō)明制備的樣品中含有-SH基團(tuán)。2 926 cm-1為亞甲基的伸縮振動(dòng)峰，這可能是由于引入-SH或-IDA基團(tuán)引起的。對(duì)比圖2b中SiO2-SH(曲線1)和SiO2-SH/IDA(曲線2)的變化可以看出，曲線2在1 623 cm-1處增加了-NH及COO-的伸縮振動(dòng)峰，1 528 cm-1處增加了N-HⅡ的面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收振動(dòng)峰[26]，說(shuō)明制備樣品的表面成功修飾了-IDA基團(tuán)。

圖2 (a)SiO2-SH/IDA的樣品的FT-IR圖；(b)制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的FT-IR圖Fig.2(a)FT-IR spectrum of the parpared SiO2-SH/IDA sample;(b)FT-IR spectrum of the preparedSiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.3 TG曲線

圖3為制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的TG圖，從圖中可以看出樣品從室溫～800℃均有明顯的失重，其中室溫～240℃為表面吸附水的失重，而主要的失重出現(xiàn)在240～800℃，從曲線1可以看出樣品SiO2-SH的失重率約為37.9%，這主要為表面巰基的失重率。從曲線2可以看出，樣品SiO2-SH/IDA的失重率為41.7%，這主要是由于表面修飾的-SH和-IDA基團(tuán)的熱分解所致，說(shuō)明表面具有較高的官能團(tuán)密度。對(duì)比兩條曲線可以看出，曲線2比曲線1多失重約3.8%，這可能是由于表面-IDA基團(tuán)的熱分解所引起的。

圖3 制備SiO2-SH和SiO2-SH/IDA樣品的TG曲線Fig.3 TG curve of the prepared SiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.4 捕獲蛋白測(cè)評(píng)

親和分離是一種常規(guī)分離蛋白的方法，它的基本原理是利用載體表面的基團(tuán)與蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，從而達(dá)到分離目標(biāo)蛋白的效果。從圖4可以看出，樣品從制備到分離His-tagged目標(biāo)蛋白共需要4步：首先水熱法一步合成中空SiO2-SH微球，隨后在微球表面修飾-IDA基團(tuán)形成SiO2-SH/IDA，并用其來(lái)吸附Ni2+，從而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球，最后將制備的微球直接用于混合蛋白的分離，可將His-tagged融合蛋白從混合蛋白中分離提純。其可能的作用機(jī)理為，-SH和-IDA基團(tuán)對(duì)溶液中的Ni2+具有協(xié)同作用，可以吸附更多的Ni2+，從而增加表面離子密度，進(jìn)而更好的分離His-tagged融合蛋白。而傳統(tǒng)的材料中一般只有一種金屬螯合基團(tuán)，如-IDA、-NTA(氨基三乙酸)、-CM-ASP(羧甲基天冬氨酸)[27-28]。

圖4 制備樣品及分離目標(biāo)蛋白示意圖Fig.4 Scheme of the synthesis of the sample and separation of the target protein by the prepared sample

為了確定最佳的咪唑洗脫濃度，我們考察了不同濃度洗脫條件下制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球分離His-tagged TRX蛋白的效果，圖5為不同咪唑濃度洗脫下制備微球分離目標(biāo)蛋白的SDS-PAGE電泳圖,泳道1：混合蛋白；泳道2：0.5 mol·L-1;泳道3：1 mol·L-1；泳道4：2 mol·L-1；泳道5：3 mol·L-1。從圖中可以看出，當(dāng)改變咪唑洗脫濃度時(shí)，隨著咪唑濃度的增加，洗脫目標(biāo)蛋白的量逐漸增加，當(dāng)咪唑濃度為1 mol·L-1時(shí)，洗脫下來(lái)目標(biāo)蛋白已達(dá)到最大，且?guī)缀鯖]有雜蛋白。當(dāng)繼續(xù)增加咪唑濃度時(shí)(2、3 mol·L-1)，洗脫下來(lái)雜蛋白的量也隨之增多，因此，我們以下測(cè)試選用咪唑的濃度為1 mol·L-1。

為了測(cè)試制備樣品對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)限，我們對(duì)不同梯度的His-tagged TRX蛋白進(jìn)行檢測(cè)。圖5泳道6～9為不同His-tagged TRX加入量分離蛋白的SDS-PAGE圖：泳道6：His-TRX濃度100μmol· L-1；泳道7：His-TRX梯度10μmol·L-1；泳道8：His-TRX梯度1.0μmol·L-1；泳道9：0.1μmol·L-1。從泳道6～8可以看出，當(dāng)His-tagged TRX濃度在100～1.0μmol·L-1時(shí)，制備的樣品對(duì)目標(biāo)蛋白均有較好的檢測(cè)效果，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.1μmol·L-1時(shí)，泳道9的條帶較弱，說(shuō)明樣品對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)能力較弱，即制備樣品對(duì)His-tagged TRX蛋白的檢測(cè)限至少為1.0μmol·L-1，具有較好的響應(yīng)效果。

圖5 不同咪唑濃度及不同濃度His-tagged TRX蛋白濃度條件下SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球分離Histagged TRX蛋白的電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+composite NSs in different concentration of imidazole and different concentration His-tagged TRX proteins were used

泳道10為商品凝膠分離混合蛋白的電泳圖，從圖中可以看出，文中制備樣品分離目標(biāo)蛋白的效果(泳道2)與商品凝膠分離效果(泳道10)相當(dāng)，由于商品凝膠分離蛋白需要多次過(guò)柱子，操作比較繁瑣，所以與之相比，制備樣品分離目標(biāo)蛋白的操作更簡(jiǎn)便、快捷。

為了考察制備SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球的再生能力，我們用EDTA和NiCl2溶液對(duì)分離過(guò)Histagged TRX蛋白的微球進(jìn)行處理，然后再用其分離混合蛋白。圖6中泳道1為Marker，泳道2為混合蛋白，泳道3～5分別為第一次再生、第二次再生、第三次再生后復(fù)合微球?qū)is-tagged TRX蛋白分離的電泳圖。從圖6可以看出，制備的微球再生3次，仍對(duì)混合蛋白中His-tagged TRX蛋白具有較高的分離能力(泳道3～5)，說(shuō)明此微球具有較強(qiáng)的再生能力。

為了考察制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球分離His-tagged融合蛋白的廣譜性，我們又考察了SiO2-SH/IDA-Ni2+微球?qū)is-tagged Light Oxygen Voltage(His-tagged LOV)蛋白的分離效果，圖7中泳道1為制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品從混合蛋白中分離His-tagged LOV蛋白的電泳圖，泳道2為混合蛋白，泳道3為Marker。從圖7可以看出，制備的樣品對(duì)His-tagged LOV蛋白仍具有較好的特異性分離效果，能夠從混合蛋白中將目標(biāo)蛋白分離出來(lái)，說(shuō)明制備的SiO2-SH/IDA-Ni2+樣品對(duì)His-tagged的蛋白具有廣譜性[29]。

圖6 SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球循環(huán)分離His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs for four times

圖7 SiO2-SH/IDA-Ni2+復(fù)合微球分離His-tagged LOV蛋白的SDS-PAGE圖Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged LOV proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs

3 結(jié)論

本文中，我們通過(guò)一步法直接制備了中空巰基二氧化硅納米微球，然后在其表面修飾-IDA基團(tuán)，并用其吸附Ni2+，從而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+納米微球。利用該微球可以有效的分離His-tagged融合蛋白，操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)目標(biāo)蛋白檢測(cè)靈敏度高，并且通過(guò)再生處理，可實(shí)現(xiàn)微球的多次循環(huán)利用，具有潛在的市場(chǎng)價(jià)值。與商品凝膠分離介質(zhì)相比，分離目標(biāo)蛋白操作更簡(jiǎn)便、快捷。

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Synthesis of Nanometer Hollow Silica Composite Microspheres for Affinity Separation of Protein

TIAN Shu-Fang1,2ZOU Xue-Yan＊,2LU Hai-Tao3HE Jian-Ying1
CHEN Dan-Yun1ZHAO Yan-Bao2GUO Jing-Yu1
(1College of Chemistry and Chemical Enginerring,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(2Key Laboratory for Special Functional Materials,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(3Henan University Minsheng College,Kaifeng,Henan 475004,China)

Hollow silica nanospheres with thiolgroups(SiO2-SH NSs)have been successfully prepared through a hydrothermal route.Then the SiO2-SH NSs was further modified by conjugating iminodiacetic acid(IDA)to bear dual chelating groups(-SH and-COOH).After chelating Ni2+,these hollow NSs with dual chelating groups were applied to purify histidine-tagged(His-tagged)proteins.Results show thatthese hollow NSs can be widely used to separate His-tagged proteins and have a good reused ability.

hollow microspheres;silica;separation of protein;functionalization;affinity

O613.72

A

1001-4861(2015)07-1329-06

10.11862/CJIC.2015.191

2015-01-24。收修改稿日期：2015-04-25。

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)研究項(xiàng)目(No.14B150003)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21271062)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：zouxy182838@163.com