犀角地黃湯合銀翹散通過(guò)促進(jìn)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞自噬而降低線粒體ROS水平*

毛 欽， 馬璐瑤， 劉天怡， 周 娜， 劉夢(mèng)華， 吳 珺， 郝 鈺

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物學(xué)系，北京 102488）

流感病毒性肺炎是由流感病毒引起的一種急性呼吸道感染，會(huì)引發(fā)機(jī)體過(guò)度的免疫反應(yīng)和炎癥風(fēng)暴，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）也具有這一特點(diǎn)［1］。但目前西醫(yī)在治療病毒性肺炎方面未有特效藥，而中醫(yī)藥在治療病毒性肺炎方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

犀角地黃湯合銀翹散（Xijiao-Dihuang decoction combined with Yinqiao powder，XDY）最早見(jiàn)于吳鞠通的《溫病條辨·上焦篇》，銀翹散清熱解毒解表，主治風(fēng)熱犯表證；犀角地黃湯清熱解毒涼血，主治熱入營(yíng)血證，二者合用，既能清衛(wèi)分之熱，亦能解營(yíng)血之毒，達(dá)到清熱涼血，解毒化瘀之功效，是“截?cái)喁煼ā钡拇矸?，可在臨床上用于治療流感病毒性肺炎［2］。本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠肺部炎癥有著顯著的治療效果，可以減輕流感病毒感染小鼠的肺組織炎癥病變，降低感染小鼠的死亡率［3］。

巨噬細(xì)胞是流感病毒感染過(guò)程中炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞。流感病毒侵入機(jī)體后，除感染肺泡上皮細(xì)胞外，還能被肺泡巨噬細(xì)胞識(shí)別，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞從血管內(nèi)滲出并遷移至炎癥病灶，繼而釋放大量的炎癥因子與趨化因子，這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)被稱(chēng)為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，也是病毒性肺炎致死的主要原因［4］。流感病毒侵入機(jī)體后感染巨噬細(xì)胞，使細(xì)胞線粒體受到損傷，釋放大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），即線粒體ROS（mitochondrial ROS，mtROS），ROS 參與激活許多炎癥通路，包括炎性體通路。釋放的mtROS 刺激炎性體的激活，促進(jìn)大量炎癥因子，如白細(xì)胞介素（interleukin-1β，IL-1β）等的分泌，引發(fā)炎癥反應(yīng)［5］。前期研究已經(jīng)證明XDY 可以清除線粒體損傷產(chǎn)生的ROS，抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活化，并減少了細(xì)胞焦亡的發(fā)生［6］，但如何清除mtROS 的機(jī)制還不清楚。細(xì)胞自噬能清除損傷的線粒體，減少mtROS 產(chǎn)生［7］。因此，本研究以流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞為模型，以細(xì)胞自噬為切入點(diǎn)，探究XDY 對(duì)自噬調(diào)節(jié)的流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞mtROS 水平的影響，為闡明其抗流感病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1 購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。流感病毒鼠肺適應(yīng)株［A/PR/8/34（/H1N1），PR8］由本教研室液氮保存。XDY（水牛角30 g、生地30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹葉4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g 和牛蒡子9 g）購(gòu)自北京同仁堂藥店，制成水煎劑，煎藥后制備成凍干粉，每100 g 生藥提取14.53 g 凍干粉。

2 主要試劑

抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）抗體、抗 P62/SQSTM1 抗體和JC-1 法線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Solarbio；山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 均購(gòu)自Abcam；MitoTracker Red CMXRos 和 MitoSOX 染色液均購(gòu)自Invitrogen；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購(gòu)自 Selleckchem；Mito-TEMPO｛［2-（2，2，6，6-tetramethylpiperidin-1-oxyl-4-ylamino）-2-oxoethyl］triphenylphosphonium chloride｝均購(gòu)自 Sigma；DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自Corning；胎牛血清購(gòu)自HyClone。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1 接種于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖 DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 XDY 對(duì)J774A. 1 巨噬細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度測(cè)定 用細(xì)胞刮刀將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞刮下，PBS洗滌離心，用DMEM重懸調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L并加入96 孔板中（每孔100 μL），設(shè)正常組（正常培養(yǎng)不予以刺激）、不同濃度（2 500、1 250、625、312.5 和156.25 mg/L）的細(xì)胞加藥組、空白加藥組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液）及調(diào)零組（無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液），每組6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，每孔加 DMSO 150 μL，避光震蕩 10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 與570 nm 的吸光度（A）。分析不同濃度XDY 對(duì)細(xì)胞活力的影響，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率≤10%的藥物濃度作為藥物的最大無(wú)毒濃度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=［（正常組A值-調(diào)零組A值）-（細(xì)胞加藥組A值-空白加藥組A值）］/（正常組A值-調(diào)零組A值）×100%

3.3 Western blot 檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞自噬水平 將小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1 接種到6 孔板中，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常組（正常培養(yǎng)不予以刺激）、模型組（PR8 感染24 h）、XDY 干預(yù)組（PR8 感染及XDY 干預(yù)24 h），3-MA（自噬抑制劑）干預(yù)（PR8+3-MA）組（3-MA 預(yù)處理3 h 后直接加PR8，繼續(xù)培養(yǎng)24 h）、3-MA 對(duì)照組（3-MA 預(yù)處理 3 h 后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h）及 PR8+3-MA+XDY組（3-MA 預(yù)處理 3 h 后直接加PR8 和 XDY，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h），每組 3 個(gè)復(fù)孔。PR8 感染量為 100 TCID50，XDY 終濃度為 162.5 mg/L，3-MA 終濃度為 5 mmol/L。PR8 感染 24 h 后，收集各組巨噬細(xì)胞，加入裂解液裂解提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)條件100 V、70 min，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉 1 h，加入兔源抗LC3B 抗體（1∶1 000）、兔源抗P62 抗體（1∶1 000）和鼠源抗β-actin 抗體（1∶1 000），室溫?fù)u床孵育3 h。TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min，加入相應(yīng)的羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）和羊抗鼠Ⅱ抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育1 h，使用發(fā)光液進(jìn)行曝光。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值進(jìn)行半定量分析。

3.4 免疫熒光檢測(cè)線粒體膜電位及線粒體與自噬體共定位情況 將巨噬細(xì)胞J774A.1 接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿約2×106個(gè)細(xì)胞。設(shè)置正常組、模型組和 XDY 干預(yù)組。PR8 感染 24 h 后，PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入JC-1 工作液，37 ℃，5%CO2孵育 20 min，加入 Incubation Buffer 洗 2 次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體膜電位情況。棄培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次（每次3 min），加入染料MitoTracker Red（終濃度100 nmol/L）工作液37 ℃、5%CO2孵育20 min。棄去染料，PBS 洗3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗 3 次，加入 0.3%TritonX-100 處理細(xì)胞 15 min（室溫透化），PBS 洗3 次，山羊血清37 ℃封閉1 h（每皿1 mL），棄封閉液，加入兔抗LC3B 抗體工作液（山羊血清1∶150），37 ℃孵育3 h，PBS洗3次，加入羊抗兔Ⅱ抗（山羊血清1∶300），37 ℃孵育1 h，PBS 洗3次。加入DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色室溫孵育10 min，PBS 洗3 次，加入1 mL PBS，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體（紅色）與LC3（綠色）的共定位情況。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞的mtROS 水平 將小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1接種到6孔板中，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。設(shè)置正常組、模型組、XDY 干預(yù)組、Mito-TEMPO（線粒體特異性抗氧化劑）干預(yù)（PR8 感染及 500 μmol/L Mito-TEMPO 干預(yù) 24 h）組、Mito-TEMPO 對(duì)照組（500 μmol/L Mito-TEMPO 干預(yù)24 h），3-MA 干預(yù)組、3-MA 對(duì)照組及 PR8+3-MA+XDY組。病毒感染24 h 后，棄上清，DMEM 清洗細(xì)胞一次，加入MitoSOX 工作液，收集各組巨噬細(xì)胞，153.166×g離心5 min，加入PBS，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞mtROS含量。

3.6 ELISA 檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞IL-1β 分泌水平 將小鼠巨噬細(xì)胞J774A. 1 接種到6 孔板中，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。設(shè)置正常組、模型組、XDY干預(yù)組、3-MA干預(yù)組、3-MA 對(duì)照組及PR8+3-MA+XDY組，每組3個(gè)復(fù)孔。病毒感染24 h 后，收集細(xì)胞上清液，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定各孔細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1β的水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩組間比較用SNK-q法（方差齊）或Games-Howell 法（方差不齊）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 XDY對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞J774A.1的最大無(wú)毒濃度

按照細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的公式計(jì)算得出，當(dāng)XDY的濃度分別為2 500 mg/L、1 250 mg/L、625 mg/L、312.5 mg/L及156.25 mg/L時(shí)J774A.1巨噬細(xì)胞的抑制率分別為85.77%、11.6%、3.88%、-15.79%和-9.09%。XDY 對(duì)J774A. 1 巨噬細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度為650 mg/L。之后根據(jù)MTT得出的最大無(wú)毒濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)并確定162.5 mg/L作為最佳藥物干預(yù)劑量。

2 XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞自噬水平的影響

Western blot檢測(cè)顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞中LC3-II 和P62 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05），3-MA 對(duì)照組 LC3-II 蛋白水平顯著降低，P62 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，PR8+XDY組中 LC3-II 和 P62 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）；同時(shí)，與 PR8+XDY組相比，PR3+3-MA+XDY組LC3-II蛋白水平顯著降低，P62蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與 PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組細(xì)胞P62 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effects of XDY on the protein expression of LC3（A）and P62（B）in J774A. 1 cells infected with influenza virus. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs PR8 group；△P＜0.05 vs PR8+3-MA group.圖1 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞LC3和P62水平的影響

3 XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)線粒體與自噬體共定位的影響

免疫熒光檢測(cè)顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞中LC3 熒光信號(hào)（綠色）顯著增強(qiáng)，線粒體熒光信號(hào)（紅色）顯著減弱（P＜0.01）；PR8+XDY組LC3 熒光信號(hào)（綠色）相對(duì)于正常組增強(qiáng)，但相對(duì)于模型組減弱，線粒體熒光信號(hào)（紅色）相對(duì)于模型組顯著增強(qiáng)（P＜0.01），可見(jiàn)明顯的共定位情況，見(jiàn)圖2。

4 XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞線粒體膜電位的影響

免疫熒光檢測(cè)顯示，正常組JC-1呈現(xiàn)紅色熒光；與正常組相比，模型組紅光強(qiáng)度明顯減弱，胞質(zhì)內(nèi)綠光明顯增多；與模型組相比，PR8+XDY組紅光明顯增強(qiáng)，綠光強(qiáng)度減弱，見(jiàn)圖3。

5 XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞mtROS水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組相比，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞mtROS 水平顯著升高；與模型組相比，PR8+XDY組和 PR8+Mito-TEMPO組 mtROS 水平顯著降低（P＜0.01）；與 PR8+XDY組相比，PR8+3-MA+XDY組細(xì)胞mtROS 水平顯著升高（P＜0.01）；與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組 mtROS 水平有所降低，但是效果弱于PR8+XDY組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

5 XDY 對(duì)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞IL-1β 水平的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，PR8+XDY組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平下降（P＜0.05）；與PR8+XDY組相比，PR8+3-MA+XDY組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 水平有所下降，但效果弱于PR8+XDY組，見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 2. Effects of XDY on the colocalization of autophagosome and mitochondria in macrophages infected with influenza virus. Detection of the subcellular location of autophagosome and mitochondria was performed by labeling with the anti-LC3B and MitoTracker Red CMXRos in J774A.1 cells observed under confocal fluorescence microscope. Scale bar=10 μm. Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs PR8 group.圖2 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)線粒體與自噬體共定位的影響

自噬是所有真核生物中保守的細(xì)胞過(guò)程，可降解功能失調(diào)的細(xì)胞器或大細(xì)胞溶質(zhì)分子，其中包括受損的線粒體［8］。自噬過(guò)程分為 4 個(gè)階段：（1）雙層隔離膜形成；（2）自噬體形成；（3）自噬溶酶體形成；（4）自噬體溶酶體降解［9］。LC3是自噬體膜上的標(biāo)志性蛋白，LC3-II 已被證明是自噬體標(biāo)志物，其水平通常被用來(lái)表示自噬體的數(shù)量［10］；P62/SQSTM-1 是一種多功能蛋白，在自噬溶酶體中被降解，其水平代表了自噬通量，即完整的自噬流［11］。流感病毒感染細(xì)胞后增加自噬體的產(chǎn)生，但是抑制自噬溶酶體的降解［12］。在本研究中，流感病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞后，LC3 和P62 的表達(dá)量顯著增多，加入自噬抑制劑3-MA 后，與模型組相比，PR8+3-MA組的 P62的表達(dá)量增多，說(shuō)明流感病毒可誘導(dǎo)自噬發(fā)生，但是阻止了完整的自噬流，模型組LC3-II 的增多很有可能是由于自噬體無(wú)法與溶酶體融合，導(dǎo)致其無(wú)法被降解而堆積；加入 XDY 后，LC3-II 和 P62 的表達(dá)量降低，加入自噬抑制劑3-MA 后，與PR8+3-MA組相比，PR8+3-MA+XDY組 LC3-II 和 P62 蛋白表達(dá)量降低，說(shuō)明XDY 可以促進(jìn)形成完整自噬流，其LC3-II 蛋白表達(dá)水平低于模型組細(xì)胞可能與其促進(jìn)自噬體與溶酶體融合導(dǎo)致自噬體降解有關(guān)。

Figure 3. Effects of XDY on the mitochondrial membrane potential in macrophages infected with influenza virus. Scale bar=10μm.圖3 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 4. Effects of XDY on the levels of mtROS in macrophages infected with influenza virus. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs PR8 group；△△P＜0.01 vs PR8+XDY group.圖4 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞mtROS水平的影響

流感病毒感染細(xì)胞后，會(huì)損害線粒體，線粒體膜通透性增加，向細(xì)胞質(zhì)釋放大量的ROS，繼而引發(fā)炎癥［13］。自噬系統(tǒng)可以靶向受損的線粒體并將它們遞送至溶酶體進(jìn)行降解，這種選擇性的自噬降解線粒體，稱(chēng)為線粒體自噬［14］。本研究結(jié)果顯示，模型組的LC3 表達(dá)顯著強(qiáng)于正常組，線粒體熒光信號(hào)明顯弱于正常組；PR8+XDY組LC3 表達(dá)強(qiáng)于正常組，但較弱于模型組，線粒體熒光信號(hào)顯著強(qiáng)于模型組，且有明顯的LC3 與線粒體共定位情況。這些結(jié)果表明，流感病毒能導(dǎo)致細(xì)胞的線粒體損傷，并且可以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞自噬體的生成，但未見(jiàn)明顯的線粒體自噬發(fā)生；XDY 可促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生，減輕線粒體損傷。

檢測(cè)線粒體膜電位可以觀察到線粒體的健康情況。JC-1 是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)熒光染料，可作為檢測(cè)線粒體跨膜電位指示劑，有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)。正常健康線粒體的膜電位具有極性，JC-1 形成多聚體發(fā)射紅色熒光；線粒體膜電位去極化時(shí)，紅光強(qiáng)度減弱，以單體形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光［15］。在本研究中，正常組呈紅色熒光，模型組紅色熒光減弱，胞質(zhì)中綠色熒光顯著增強(qiáng)，加入XDY 后，紅色熒光增強(qiáng)，綠色熒光減弱，表明流感病毒感染巨噬細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致線粒體跨膜電位去極化，導(dǎo)致線粒體損傷，XDY 可以減輕流感病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞造成的線粒體損傷。

自噬與mtROS 密切相關(guān)。ROS 是一種高活性分子，在未受到刺激的情況下可以平衡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但是過(guò)量的ROS 會(huì)引起機(jī)體代謝紊亂、炎癥性疾病的發(fā)生［16］。線粒體是ROS 產(chǎn)生的主要來(lái)源，線粒體氧化磷酸化合成 ATP，ROS 作為其副產(chǎn)物產(chǎn)生［17］。線粒體自噬可以清除損傷的線粒體，減少過(guò)多ROS 的產(chǎn)生［18］。在本研究中，流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞mtROS水平明顯升高，加入XDY后，mtROS水平顯著降低。作為陽(yáng)性對(duì)照，Mito-TEMPO 是一種線粒體靶向超氧化物歧化酶，可以清除mtROS。本研究結(jié)果顯示，XDY 和Mito-TEMPO 均可降低流感病毒感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)mtROS 水平。加入自噬抑制劑3-MA 以觀察自噬與mtROS 之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，PR8+3-MA+XDY組細(xì)胞 mtROS 水平相對(duì)于 PR8+XDY組顯著升高，表明抑制細(xì)胞自噬可加重細(xì)胞mtROS累積，加入自噬抑制劑后XDY 降低mtROS 水平的作用受到抑制，說(shuō)明XDY 減少mtROS 的作用與促進(jìn)細(xì)胞自噬相關(guān)。

ROS 參與激活許多炎癥通路，產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子［19］。本研究顯示XDY 可降低流感病毒感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素的水平，加入自噬抑制劑 3-MA 后，XDY 抑制 IL-1β 的作用減弱，說(shuō)明 XDY抑制IL-1β的作用與促進(jìn)細(xì)胞自噬相關(guān)。

綜上所述，流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞線粒體受到損傷，產(chǎn)生大量的mtROS，并誘導(dǎo)炎性因子IL-1β的產(chǎn)生；XDY 可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬清除受損的線粒體，減少mtROS的產(chǎn)生，從而抑制ROS參與激活的炎癥通路，減少炎癥因子產(chǎn)生。本研究進(jìn)一步完善了XDY 干預(yù)流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞mtROS 產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞和分子機(jī)制，以及XDY 抑制流感病毒引起的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的部分分子機(jī)制，為闡明其抗炎機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。