氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路參與糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞外基質(zhì)的重構(gòu)*

包伊特格樂， 金恚戎， 魏宇軒， 張默函

（延邊大學醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，吉林 延吉 133000）

糖尿病胃輕癱（diabitic gastroparesis，DGP）是常見的糖尿病消化道并發(fā)癥之一，主要由高血糖誘導發(fā)生，表現(xiàn)為胃動力障礙引起的胃排空延遲。DGP可導致機體血糖波動大、藥物控制乏力，加速相關糖尿病急、慢性并發(fā)癥的發(fā)生。胃動力來源于平滑肌細胞協(xié)同收縮運動，而細胞間的相互關系對平滑肌運動的影響是不可忽略因素。正常狀態(tài)下胃平滑肌細胞外表面環(huán)繞著細胞外基質(zhì)（extracellular matrix；ECM），具有機械性連接、限制肌細胞過度伸展及影響細胞間信息傳遞的作用。前期研究顯示，DGP 大鼠胃平滑肌自主收縮運動振幅下降、頻率變慢，表明高糖降低了胃平滑肌的自主收縮功能［1］。故我們假設高血糖誘導了胃平滑肌ECM 重構(gòu)，進而導致細胞間機械性連接中斷、信息傳遞遲滯，誘導DGP 發(fā)生。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是先天免疫系統(tǒng)NLR 蛋白超家族的成員之一，其主要功能為參與細胞程序性死亡、慢性炎癥及免疫應答，是機體內(nèi)慢性炎癥的主要參與者。氧化應激能夠誘導NLRP3 活化，而高血糖是氧化應激反應的重要誘因之一。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是屬于調(diào)節(jié)細胞生長和分化的超家族，在哺乳動物中主要有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和 TGF-β1β24 個亞型。Cáceres 等［2］研究顯示，NLRP3 通過 TGF-β1/IL-1β 途徑參與心肌細胞纖維化，這表明 NLRP3 與 TGF-β 關系密切，且參與ECM 的發(fā)生。Wu 等［3］研究認為 TGF-β3能夠通過抑制TGF-β1的功能進而抑制ECM 合成。高糖條件下DGP 大鼠胃平滑肌ECM 重構(gòu)與氧化應激-NLRP3-TGF-β3的關系，尚未見文獻報道。

本項工作以DGP 大鼠為研究對象，觀察DGP 大鼠胃平滑肌組織ECM 的改變，同時確定氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路各主要蛋白的變化，旨在進一步闡明DGP的發(fā)病機理。

材料和方法

1 實驗材料

SPF 級 4 周齡雄性 SD 大鼠 40只，體重（200±20）g，由延邊大學實驗動物中心提供，合格證號為SYXK（吉）2020-0009。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ；Sigma-Aldrich，S0130）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試試劑盒（TBA 法；A003-1）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測試盒（羥胺法；A001-1-1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒（鉬酸銨法；A007-1-1）均購自南京建成生物工程研究所；III 型膠原蛋白（collagen type III，Col III）抗體（BOSTER，M00788）；I 型膠原蛋白（collagen type I，Col I）抗體（Bioss，bs-10423R）；NLRP3 抗體（Abcam，ab214185）；caspase-1（CASP-1）抗 體（Abclone，A0964）；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體（Abcam，ab92536）；TGF-β3抗體（Abclone，A8460）；金屬蛋白酶組織抑制物 1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）抗 體（Santa Cruz，SC-21734）；內(nèi)參照β-actin 抗體（Sigma-Aldrich，A5316）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（Sigma-Aldrich）；大鼠白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（Mlbio，ml037361）。

2 方法

2.1 大鼠糖尿病模型的制備 用檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.0）0.1 mol/L 配制成0.5%的STZ 溶液。大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，大鼠單籠飼養(yǎng)，相對濕度50%~80%，室溫18~25 ℃。禁食不禁水12 h，稱重后一次性腹腔注射65 mg/kg STZ，制備糖尿病大鼠模型，即為diabitic組；正常大鼠為正常對照（normal control，NC）組。飼養(yǎng)條件不變，給藥7 d 后尾靜脈取血，血糖濃度≥350 mg/dL為糖尿病大鼠造模成功［1］。

2.2 胃內(nèi)色素殘留率的檢測 從diabitic組隨機選取10只大鼠為實驗組（diabitic 1組），從NC組另取10只大鼠作為對照組（NC 1組），飼養(yǎng)條件不變，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，禁食不禁水24 h后，灌胃0.4 mL 濃度為1 g/L的美蘭溶液，30 min后脫頸處死，迅速剖取全胃并收集胃內(nèi)殘留物。生理鹽水沖洗殘留物，收集沖洗液，2 000×g離心15min，取上清液，分光光度計640 nm 檢測吸光值（A）確定胃內(nèi)色素殘留率［4］。胃內(nèi)色素殘留率（%）=測定管A值/標準管A值×100%。

2.3 胃腸推進率的檢測 剩余diabitic組10只大鼠為實驗組（diabitic 2組），剩余NC組10只大鼠作為對照組（NC 2組），飼養(yǎng)條件不變，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，禁食不禁水24 h 后，1 mL/kg 碳粉混懸液（活性炭10%和阿拉伯膠10%）灌胃，30 min后脫頸處死，迅速剖取幽門至回盲部的腸管，測量碳粉前端至幽門括約肌距離（cm）與幽門括約肌至小腸末端距離（cm），計算胃腸推進速率［5］。胃腸推進速率（%）=碳粉前端至幽門括約肌距離/幽門括約肌至小腸末端距離×100%。

2.4 DGP 大鼠模型的確定及實驗分組 統(tǒng)計分析比較diabetic組與NC組的胃內(nèi)色素殘留率與胃腸推進率，當P＜0.05 或P＜0.01 可確定為 DGP 模型制備成功。實驗從diabitic 1、2組成功建立DGP模型的大鼠中隨機選取10只作為DGP組，從NC 1、2組中隨機選取10只作為NC組。

2.5 氧化應激指標的檢測 將胃平滑肌組織稱重，生理鹽水中機械法粉碎成乳糜狀后，3 500×g離心15 min，取上清。按照試劑盒操作要求進行，后紫外分光光度計測定吸光度：532 nm 確定MDA 含量；550 nm確定T-SOD活性；405 nm確定CAT活性。

2.6 Masson 染色 胃組織經(jīng)Bouin 液固定，梯度脫水后石蠟包埋，切片厚度5 μm，切片水化后Regaud蘇木素染液（蘇木素1 g、95%乙醇10 mL、甘油10 mL和蒸餾水80 mL）染色8 min，蒸餾水沖洗，麗春紅酸性品紅液（麗春紅ponceau S 0.7 g、酸性品紅0.3 g、蒸餾水99 mL 和冰醋酸1 mL）染色8 min，0.2%冰醋酸浸洗15 s，1%磷鉬酸水溶液處理4 min，苯胺藍水溶液（苯胺藍2 g、蒸餾水98 mL 和冰醋酸2 mL）復染5 min，0.2%冰醋酸處理1 min，脫水、透明、封片。利用Image-Pro Plus 6.0軟件采用雙盲法進行分析。

2.7 免疫組織化學染色 胃平滑肌組織處理及切片厚度同上。切片水化后PBS 沖洗2 min×3 次；枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）浸泡，用微波爐加熱至沸騰20 min后斷電，間隔3 min后再通電，重復4次（注：枸櫞酸鹽緩沖液液面始終高于切片，以免蒸干切片）；PBS沖洗5 min×3次后滴加3%H2O2，室溫孵育20 min后PBS沖洗5min×3 次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育40 min（注：勿洗）；滴加按1∶200稀釋后的Col I和Col III抗體，4 ℃過夜（注：空白對照組滴加同體積PBS）；復溫 1 h 后，PBS 沖洗 5 min×3 次，滴加生物素化Ⅱ抗工作液，37 ℃孵育 40 min 后再 PBS 沖洗 5 min×3 次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育40 min后再PBS 沖洗5 min×3次；DAB 顯色劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）顯色；顯微鏡下觀察，顯色達到實驗要求后，蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木素復染后，脫水、透明、封片。

2.8 Western blot 胃平滑肌組織組織勻漿后提取總蛋白，全波長分光光度計測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2 min，每孔加樣40 μg。10% SDSPAGE分離后，利用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。用5%脫脂奶粉TBS-T 緩沖液（25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Tween-20，pH 7.5），封閉PVDF膜后洗膜。滴加Ⅰ抗（Col I、Col III、NLRP3 和 MMP-2 抗體，1∶1 000；CASP-1、TGF-β3、TIMP-1和β-actin抗體，1∶500），4 ℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下孵育1 h，洗膜。凝膠成像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為內(nèi)參照，計算蛋白的相對表達量。

2.9 ELISA 檢測IL-1β 含量 胃平滑肌組織加入適量生理鹽水后組織勻漿，1 000×g離心10 min，取上清液，然后按照試劑盒操作要求進行，后利用酶標儀在450 nm波長處測定A值。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學分析和制圖。計量資料以均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 胃內(nèi)色素殘留率和胃腸推進率

與NC組相比，diabetic組大鼠胃內(nèi)色素殘留率顯著升高，胃腸推進率顯著降低（P＜0.01），見表1。

2 氧化應激指標T-SOD和CAT活性及MDA含量

與 NC組相比，DGP組 T-SOD 和 CAT 活性均顯著降低（P＜0.01）；而MDA 含量則顯著升高（P＜0.01），見圖1。

3 胃平滑肌ECM的觀察

如圖2 所示，箭頭所指為平滑肌細胞間隙，藍色物質(zhì)為ECM，與NC組相比，DGP組細胞間隙增大，且ECM含量顯著降低（P＜0.01）。

4 胃平滑肌組織Col I和Col III的表達

如圖3A 所示，Col I 和Col III 均為白色箭頭所指的棕黃色物質(zhì)，與 NC組相比，DGP組 Col I 表達顯著減少（P＜0.01），但Col III 表達差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05）。Western blot 結(jié)果也顯示，DGP組胃平滑肌組織Col I 表達較NC組顯著減少（P＜0.01），Col III表達變化不顯著（P＞0.05），見圖3B、C。

Figure1. Activity of T-SOD（A）and CAT（B），and content of MDA（C）in gastric smooth muscle tissues. Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs NC group.圖1 胃平滑肌組織氧化應激指標T-SOD和CAT活性及MDA含量的變化

Figure 2. Changes of extracellular matrix（ECM）in gastric smooth muscle tissues（Masson staining，scale bar=100 μm）. Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs NC group.圖2 胃平滑肌組織細胞外基質(zhì)的變化

5 胃 平 滑 肌組 織 CASP-1、TGF-β3、NLRP3 和MMP-2蛋白表達及IL-1β含量的變化

Western blot 結(jié)果顯示，DGP組大鼠胃平滑肌CASP-1、TGF-β3、NLRP3 和 MMP-2 蛋白表達較 NC組升高（P＜0.05 或P＜0.01），而TIMP-1 蛋白表達則較NC組顯著下降（P＜0.01），見圖 4A~F。ELISA 結(jié)果顯示，DGP組大鼠胃平滑肌IL-1β 含量顯著高于NC組（P＜0.01），見圖4G。

討 論

根據(jù)興奮傳遞的特征分類，胃平滑肌屬于單個單位平滑肌。這類平滑肌在沒有神經(jīng)或激素的作用下，也能夠自發(fā)地產(chǎn)生收縮。這是由于該類平滑肌細胞中有一部分肌細胞是起搏細胞。起搏細胞的興奮通過廣泛存在的豐富的縫隙連接（gap junction，GJ）向周圍平滑肌細胞擴散，使許多平滑肌細胞隨著起搏細胞活動，形成一個功能單位。ECM 是維持細胞生理活動微環(huán)境的因素之一，并且處于不斷合成和降解的動態(tài)過程中。不僅在細胞與細胞之間起到機械支撐的作用和連接作用，而且是細胞與細胞之間信號傳導的橋梁，參與細胞的多種生理與病理過程，在組織損傷修復和纖維化形成等過程中起到重要作用。由于胃平滑肌細胞外表面環(huán)繞著ECM，故ECM 重構(gòu)必將引起GJ 功能紊亂。ECM 主要由膠原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖蛋白和彈性蛋白等五大類物質(zhì)組成［6］，其中 Col I 和 Col III 是 ECM 的主要蛋白成分，占體內(nèi)膠原蛋白總量的90%。ECM 存在于所有組織細胞中［7］，包括胃平滑肌組織。平滑肌細胞除了完成舒縮功能外，還有合成、分泌膠原蛋白、彈性蛋白及蛋白多糖的作用，但研究者對平滑肌細胞的內(nèi)分泌功能卻未能給予足夠重視［8］。本研究結(jié)果顯示，長期的高糖作用改變了胃平滑肌組織ECM 的組成，導致了ECM 重構(gòu)。進一步研究表明，這種重構(gòu)主要表現(xiàn)為Col I 表達下降而Col III 表達不變。ECM 的生成與降解受多種因素調(diào)控，而氧化應激被認為是重要因素之一［9-10］。本研究結(jié)果顯示長期的高糖作用能夠誘導DGP大鼠胃平滑肌發(fā)生氧化應激。這表明高糖通過誘導氧化應激參與了DGP大鼠胃平滑肌ECM的重構(gòu)。

Figure 3. The changes of collagen type I（Col I）and collagen type III（Col III）expression in gastric smooth muscle tissues. A：immunohistochemical staining of Col I and Col III（scale bar=100 μm）；B and C：Western blot results of Col I and Col III.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs NC group.圖3 胃平滑肌組織I型膠原蛋白及III型膠原蛋白表達的變化

Figure 4. The protein expression of caspase-1（CASP-1），TGF-β3，NLRP3，MMP-2 and TIMP-1 in gastric smooth muscle tissues detected by Western blot and the content of IL-1β detected by ELISA. A：Western blot images；B：NLRP3 expression；C：CASP-1 expression；D：TGF-β3 expression；E：MMP-2 expression；F：TIMP-1 expression；G：IL-1β content. Mean±SEM. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC group.圖4 胃平滑肌組織CASP-1、TGF-β3、NLRP3、MMP-2和TIMP-1蛋白表達及IL-1β含量的變化

NLRP3/TGF-β3是氧化應激下游的重要通路，且與ECM 的生成與降解關系密切。羅立慧等［11］研究認為，高糖能夠促進細胞內(nèi)活性氧的生成，同時促進NLRP3活化并刺激下游CASP-1、IL-1和IL-18等下游物質(zhì)的釋放；而 Zhang 等［12］研究認為，高糖能夠通過活性氧激活TGF-β 參與Th17 細胞生成；說明高糖是通過氧化應激參與調(diào)節(jié)NLRP3途徑的活化及TGF-β表達與活化。同時，這也表明DGP 大鼠胃平滑肌可能存在NLRP3/TGF-β3通路的改變。為此，本研究觀察了NLRP3-TGF-β3通路的關鍵蛋白NLRP3、CASP-1和 TGF-β3表達以及 IL-1β 含量，結(jié)果顯示 DGP 大鼠胃平滑肌NLRP3/TGF-β3通路變化明顯。結(jié)合前面的研究結(jié)果，我們認為高糖通過氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路誘導了DGP 大鼠胃平滑肌ECM 的重構(gòu)。那么，氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路又是通過何種途徑誘導的 ECM 的重構(gòu)呢？MMPs 是 TGF-β 的下游因子，也是一種促進ECM 降解的中性內(nèi)肽酶，其中MMP-2 可以消化 Col I、Col II 和 Col III。TIMPs 是參與控制MMPs 在組織中局部活化的特異性抑制劑，通常按照 1∶1 比例來結(jié)合 MMPs，形成 MMP-TIMP 化合物，從而防止MMP融合底物，抑制MMP活化；其中TIMP-1 活性最強。接下來，本研究又觀察了MMP-2和TIMP-1 的表達，結(jié)果顯示MMP-2 蛋白表達增加，而TIMP-1 蛋白表達下降。這表明氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路通過下調(diào) TIMP-1 表達，增加了 MMP-2 的生物學功能，進而通過下調(diào)DGP 大鼠胃平滑肌ECM的Col I，參與ECM 重構(gòu)。至于DGP 大鼠胃平滑肌Col III含量為何無變化，有待進一步研究。

綜上所述，我們認為高糖通過氧化應激-NLRP3-TGF-β3通路參與了大鼠胃平滑肌ECM 的重構(gòu)，進而參與DGP的發(fā)生。