鬼箭羽醇提取物通過阻止氧化應激和抑制TNF-α-NF-κB及TβR1-Smad2/3通路減輕兔腎缺血再灌注損傷*

陳明環(huán)， 王詠蘭， 李相國， 呂慧芬， 黃德斌

（湖北民族大學風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000）

目前腎移植面臨的兩大難題，就是“腎移植手術”和“術后移植腎存活或功能維持”［1］，解決后者的重要路徑之一就是減輕因腎缺血再灌注損傷（renal ischemia-reperfusion injury，RIRI）并誘發(fā)的一系列氧化-應激、信號通路啟動的炎癥反應等導致的移植腎功能損傷，甚至衰竭［2］。RIRI 的病理過程是早期移植腎血流量急劇減少，當后期血流恢復灌注時會造成非免疫性腎功能損傷甚至功能喪失，同時大大增加移植后血栓形成和感染風險［3］。因此，要減輕腎移植后RIRI，應在深入研究RIRI 對移植腎的影響及其機制的同時，積極從動物實驗探尋干預RIRI 的新型藥物。鬼箭羽乙醇提取物（ethanolic extracts ofEuonymus alatus，EEEA）是中藥衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛（Euonymus alatus）翅狀物的乙醇提取物，我們曾研究證實，該藥具有抗氧化應激、腦缺血再灌注、肝損傷等多種作用［4］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)EEEA 對RIRI家兔的腎功能具有明顯的保護作用，可能具有減輕腎移植后RIRI的臨床應用價值。

材料和方法

1 材料

蛋白轉(zhuǎn)印儀、垂直電泳儀及多色熒光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；TL988-IV PCR 儀（ABI，QuantStudio 6）；青霉素（華北制藥，F(xiàn)7022115）；地塞米松（dexamethasone，Dex）磷酸鈉注射液（華中藥業(yè)股份有限公司）；兔白細胞介素 2/6（interleukin-2/6，IL-2/6）ELISA 試劑盒（CUSABIO）；兔超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；抗兔GAPDH 多克隆抗體（杭州賢至生物有限公司）；抗兔轉(zhuǎn)化生長因子 β 受體1（transforming growth factor β receptor 1，TβR1）單克隆抗體（Abcam）；抗兔核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）P65 和磷酸化 P65（phosphorylated P65，p-P65）多克隆抗體（Bioss）。

2 方法

2.1 EEEA 的制備［4］8~9 月采于湖北恩施新塘野生衛(wèi)矛（Euonymus alatus）的翅狀物，經(jīng)湖北民族大學中藥學專家鑒定，清洗晾干備用。稱取鬼箭羽生藥2.0 kg，粉碎成5.5 mm 顆粒，按10 倍量70%乙醇冷凝回流提取2h，得3 次混合濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回抽乙醇得浸膏，冷凍干燥得EEEA 粉末76.738 146 g，回收率3.836 91%。

2.2 動物分組與實驗流程［5-6］30只 SPF 級日本大耳雄性白兔（2.1~2.5 kg）購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司［編號：42010000004471，許可證SCXK（鄂）2016-0011］，普通飲食喂養(yǎng)7 d 后開始實驗，控制室溫為（22±2）℃，濕度為（55±15）%。將動物隨機分成正常組、模型組、低劑量EEEA（low-dose EEEA，EEEA-L）組、高劑量EEEA（high-dose EEEA，EEEA-H）組、聯(lián)合治療（Dex+EEEA-H）組和Dex組，每組5只。各組動物灌胃相應藥物24 h后，RIRI造模，繼續(xù)用相應藥物灌胃13 d。正常組和模型組家兔灌胃等體積純水，EEEA-L 和EEEA-H組分別灌胃0.156 g/kg 和0.623 g/kg EEEA（相當于鬼箭羽生藥量2.5 g/kg 和 10.0 g/kg），Dex+EEEA-H組灌胃 0.2 mg/kg Dex和0.623 g/kg EEEA，Dex組灌胃0.2 mg/kg Dex，每天1次。實驗流程見圖1。

Figure 1. The process of the experiment. RIRI：renal ischemia-reperfusion injury.圖1 實驗流程

2.3 RIRI 造模［7］禁食12 h 后，耳緣靜脈緩慢注射30 mg/kg戊巴比妥鈉至兔完全麻醉（瞳孔反射消失），腹部剃毛，常規(guī)備皮；腹中線開腹，向右移開腸管暴露右腎，小心撕開腎包膜及腎周脂肪，鈍鑷子提起腎臟，結(jié)扎腎蒂，切除右腎；向左移開腸管暴露左腎，小心撕開腎包膜及腎周脂肪，鈍鑷子提起腎臟，以無創(chuàng)血管夾夾閉腎蒂，可見腎臟由紅色變?yōu)楹谏?，腸管歸位，以止血鉗夾閉腹腔，腎缺血30 min后，松開止血鉗，移開腸管，鈍鑷子提起腎臟，松開止血夾，可見腎臟由黑色變?yōu)榧t色；確認無出血后，逐層關腹，待呼吸平穩(wěn)后，放回籠子正常飼養(yǎng)。術后肌肉注射青霉素（每只200 000 U）4 d防止感染。術后同時繼續(xù)每天按上述要求灌胃藥物干預，劑量如前，直至第14天。

2.4 取材、病理學觀察與腎組織Paller 評分［8-9］于手術后第0、7和14天耳緣靜脈分別取血2 mL，離心得血清用于生化檢測［K+、Cl-、Ca2+、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，SCr）］，ELISA檢測SOD和MDA水平。第14天最后一次取血（先禁食24 h）后，麻醉處死，取出雙側(cè)腎，無菌生理鹽水漂洗2次，去除其他組織后，一部分以4%多聚甲醛固定，另一部分-80 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。取甲醛固定組織，常規(guī)石蠟包埋、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、HE 染色，鏡下觀察。高倍鏡下（×200）隨機選病變腎小管10個視野（皮髓質(zhì)部各半）進行腎組織評分，腎小管記分100個。無異常記0分；擴張明顯、細胞扁平記1分；刷狀緣損傷記1分；腎小管腔內(nèi)有細胞脫落、壞死，但未成管型或細胞碎片記1分；管型記2分；刷狀緣脫落記2分?？傆? 000分。

2.5 IL-2、TGF-β1、TNF-α、IL-6、SOD 和 MDA 的檢測 嚴格按ELISA操作說明步驟進行操作。

2.6 RT-qPCR 檢 測 mRNA 表 達 Trizol 法 提 取RNA。取冰凍腎組織100 mg，加1 mL Trizol 試劑研成漿移至EP 管裂解，加200μL 氯仿混勻室溫放置5 min，4 ℃離心15 min，移上層（400 μL）于另一新EP管，加400 μL 異丙醇混勻室溫靜置10 min 離心10 min 得沉淀RNA，棄上清加乙醇混勻，離心5 min，棄上清，將干燥沉淀溶于 20 μL DEPC 水，取 1 μL 以DEPC 稀釋200 倍，紫外分光光度計測定A260/A280比值，計算RNA 濃度：總RNA 濃度（g/L）=A260×40×200×10-3。逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，繪制曲線，用 2-ΔΔCt法分析mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 腎組織中總蛋白的提取與蛋白表達的測定 將腎組織塊置于EP 管，加裂解液200μL 勻漿，冰上裂解 30 min，4 ℃、15 365×g離心 5 min。取 1 μL 加PBS 稀釋成 1、0.8、0.6、0.4 和 0.2 g/L，分別加入 96孔板（各設2 個平行孔，待測樣品設3 個平行孔），混合BCA 的A 和B 液（50∶1），37 ℃避光孵育15 min，測定吸光度，直線回歸方程計算蛋白濃度。常規(guī)電泳、電轉(zhuǎn)移：GAPDH、TβR1 和Smad2/3，200 mA，90 min；p-P65 和P65，200 mA，120 min。免疫印跡顯色：5%脫脂奶粉TBST 浸泡PVDF 膜室溫搖床封閉2 h，加相應Ⅰ抗（TBST 稀釋1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌5次，每次5 min，浸泡于HRP標記的Ⅱ抗（TBST稀釋1∶50 000）中37 ℃搖床孵育2 h，同樣TBST 洗滌5次，顯色曝光，濾紙吸干，依次顯影、定影、沖洗。掃描膠片，BandScan分析灰度值。

3 統(tǒng)計學分析

用 SPSS 20.0 和 GraphPad Prism 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析及繪圖。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）描述。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 EEEA對兔外周血K+、Cl-、BUN和SCr的影響

隨著時間的推移，模型組家兔血清K+、Cl-、BUN和 SCr 持續(xù)升高；7 d 和 14 d，EEEA 各組血清 K+、Cl-、BUN 和SCr 顯著低于模型組而高于Dex+EEEA-H組（P＜0.05），Dex組顯著高于 Dex+EEEA-H組而低于模型組（P＜0.05），見圖2。血清Ca2+各組間各時點均無顯著差異（P＞0.05，結(jié)果未顯示）。

Figure 2. Effects of EEEA on serum K+（A），serum Cl-（B），BUN（C）and SCr（D）levels in rabbits. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs EEEA-L group；▲P＜0.05 vs EEEA-H group；▼P＜0.05 vs Dex+EEEAH group.圖2 EEEA對兔血清K+、Cl-、BUN和SCr水平的影響

2 EEEA對兔腎組織結(jié)構(gòu)的影響

HE 染色可見，正常組兔腎組織結(jié)構(gòu)完整，局部少見滴狀或空泡變性；模型組腎組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，腎間質(zhì)明顯充血，彌漫性巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，局灶性膠原纖維典型增生，腎小管輪廓結(jié)構(gòu)明顯不清，擴張為囊狀，大量細胞變扁，細胞質(zhì)疏松，細胞核固縮呈典型空泡樣變性，刷狀緣明顯脫落，可見蛋白管型大量沉積，腎小球囊腔明顯狹窄；EEEA-L 腎組織結(jié)構(gòu)大致完整，腎間質(zhì)有充血，可見巨噬細胞和淋巴細胞浸潤，局灶性膠原纖維明顯增生，部分腎小管明顯擴張，有刷狀緣脫落，部分細胞變扁，細胞質(zhì)疏松，部分細胞核固縮呈空泡樣變性，蛋白管型中等沉積，部分腎小球囊腔狹窄；EEEA-H組腎組織結(jié)構(gòu)較完整，腎間質(zhì)輕微擴張充血和少見淋巴細胞浸潤，局灶性膠原纖維未見明顯增生，部分腎小管輕度擴張，未見明顯細胞變性，細胞核固縮不典型，局部少量空泡變性，蛋白管型罕見沉積，少數(shù)腎小球囊腔狹窄；Dex+EEEA-H組腎組織結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)未見明顯擴張充血和淋巴細胞浸潤，未見局灶性膠原纖維增生，腎小管少見擴張，局部有輕微空泡變性，少有腎小球囊腔狹窄；Dex組的病理變化與EEEA-L組相近，見圖3。

Figure 3. Effects of EEEA on the pathological changes of kidney tissues in rabbits（HE staining，scale bar=100 and 20 μm in A and B，respectively）.圖3 EEEA對兔腎組織結(jié)構(gòu)的影響

3 EEEA對兔腎組織結(jié)構(gòu)Paller評分的影響

模型組兔腎組織結(jié)構(gòu)Paller 評分顯著高于其他各組（P＜0.05）；EEEA 降低兔腎組織結(jié)構(gòu) Paller 評分，且高劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.05）；Dex+EEEA-H組與EEEA-H組相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于Dex組（P＜0.05），見表2。

表2 EEEA對Paller評分的影響Table 2. Effects of EEEA on Paller scores（Mean±SD. n=5）

4 EEEA 對兔血清IL-2、TGF-β1、TNF-α和IL-6水平的影響

在0 d，各組兔血清IL-2、TGF-β1、TNF-α 和 IL-6水平無顯著性差異（P＞0.05），除正常組外，其他各組在 7 d 和 14 d 顯著高于 0 d，且 7 d 高于 14 d（P＜0.05）；Dex組低于模型組（P＜0.05）而與EEEA-H組無顯著差異（P＞0.05），EEEA-H組顯著低于模型組而高于Dex+EEEA-H組（P＜0.05），EEEA-L組與模型組無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

5 EEEA對兔血清和腎組織SOD和MDA的影響

在7 d，模型組血清SOD 活性顯著低于0 d 和14 d，而MDA 含量顯著高于0 d 和14 d（P＜0.05）；在7 d和14 d，模型組血清SOD 活性顯著低于正常組，而MDA 含量顯著高于正常組（P＜0.05）；EEEA 顯著增強血清SOD 活性而降低MDA 含量（P＜0.05），且模型組與Dex組無顯著差異（P＞0.05），見表3。在14 d所取腎組織中，EEEA 也顯著增強SOD 活性而降低MDA含量（P＜0.05），見表4。

表3 EEEA對兔血清MDA和SOD水平的影響Table 3. Effects of EEEA on serum levels of MDA and SOD in rabbits（Mean±SD. n=5）

表4 EEEA對第14天兔腎組織MDA和SOD水平的影響Table 4. Effects of EEEA on MDA and SOD levels in rabbit kidney tissues on the 14th day（Mean±SD. n=5）

Figure 4. Effects of EEEA on serum levels of TGF-β1（A），IL-2（B），TNF-α（C）and IL-6（D）in rabbits. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs EEEA-L group；▲P＜0.05 vs EEEA-H group；▼P＜0.05 vs Dex+EEEA-H group.圖4 EEEA對兔血清TGF-β1、TNF-α和IL-2/6的影響

6 EEEA 對兔腎組織 TβR1 和 NF-κB P65 mRNA表達的影響

RT-qPCR 擴增曲線及熔解曲線顯示，TβR1 和NF-κB P65在后期進入平臺期，曲線平滑，擴增良好，見圖5。模型組兔腎組織TβR1 和NF-κB P65 mRNA表達水平顯著高于正常組（P＜0.05）；EEEA 各組和Dex+EEEA-H組TβR1和NF-κB P65 mRNA 表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；EEEA-H組與Dex組相比無顯著差異（P＞0.05），見表5。

表5 EEEA 對第 14 天兔腎組織 TβR1 和 NF-κB P65 mRNA表達的影響Table 5. Effects of EEEA on the mRNA expression of TβR1 and NF-κB P65 in rabbit kidney tissues on the 14th day（Mean±SD. n=5）

7 EEEA 對兔腎組織NF-κB P65、TβR1 和Smad2/3蛋白表達的影響

模型組兔腎組織P65、p-P65、TβR1和Smad2/3蛋白水平均顯著高于正常組（P＜0.05）；EEEA-H組和Dex+EEEA-H組P65、p-P65、TβR1 和Smad2/3 蛋白水平均顯著低于模型組（P＜0.05）；Dex+EEEA-H組P65和p-P65蛋白水平與EEEA-H組相比無顯著差異（P＞0.05），TβR1和Smad2/3蛋白水平均顯著低于EEEAH組（P＜0.05），見圖6。

討 論

鬼箭羽為衛(wèi)矛科植物衛(wèi)矛枝條的翅狀物，常用于治療糖尿病、類風濕性關節(jié)炎、腫瘤等，主要成分有黃酮化合物（兒茶素、槲皮素、金絲桃苷等）、酚酸化合物（對羥基苯甲酸、松蘿酸等）、生物堿類（衛(wèi)矛堿、鬼箭羽堿、雷公藤新堿等）、甾體類（β-谷甾醇、豆甾-4-烯-3，6-二酮等）等［10-11］。我們曾研究證實EEEA能通過抑制TNF-α 生成影響α-平滑肌肌動蛋白等表達而阻止CCl4所致小鼠肝纖維化，其成分β-谷甾醇能抑制 TNF-α-NF-κB 和 TβR1-Smad2/3 而減輕 CCl4所致肝纖維化［4-5］。

本研究顯示，EEEA 顯著降低家兔血清 K+、Cl-、BUN、SCr、IL-2、IL-6、TGF-β1和TNF-α 水平及腎組織Paller 評分，病理學也證實EEEA組顯著優(yōu)于模型組而弱于與Dex 聯(lián)合組，表明EEEA 對RIRI 家兔的腎功能具有良好保護作用，且這種作用與Dex 聯(lián)合應用療效更佳。研究還顯示，與模型組相比，EEEA 顯著降低家兔血清或腎組織中IL-2、IL-6、TGF-β1、TNF-α 和 MDA 水平，而提高 SOD 活性。這提示 EEEA 對RIRI 家兔腎功能的保護作用與減少IL-2、IL-6、TGF-β1和TNF-α 生成及減輕氧化應激反應有關，同時也提示Dex抗RIRI的作用與氧化應激反應無關。結(jié)果還顯示，EEEA-H組和Dex+EEEA-H組家兔血清或腎組織中 TβR1 和 NF-κB P65 的 mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低，提示二者聯(lián)合抗RIRI 作用增強的機制與其共同抑制 TGF-β1-Smad2/3 和 TNF-α-NF-κB P65通路的激活有關。

本研究表明，EEEA 抗RIRI 的作用機制不僅與RIRI 早期氧化應激的抑制有關，還與通過阻止TGF-β1生成及抑制TβR1和Smad2/3 mRNA和蛋白表達而影響TGFβ1-Smad2/3 通路有關，同時也與阻止TNF-α生成及抑制p-P65、P65 蛋白和mRNA 表達而影響TNF-α-NF-κB P65 通路有關。EEEA 的這種多重作用及機制，可能是EEEA 中多成分多靶位互補作用的結(jié)果。至于結(jié)果中模型組和EEEA-L組TβR1 和NF-κB mRNA 和蛋白表達水平不一致，我們認為EEEA 本身為復方成分，存在多成分多靶位互補效應，可能系EEEA 復方成分中存在某種對應的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控成分，低濃度時這種調(diào)控成分含量不足所致［12-13］。

Figure 5. Amplification and melting curves of TβR1 and NF-κB P65 mRNA. A：TβR1；B：NF-κB P65；C：GAPDH.圖5 TβR1和NF-κB P65 mRNA的擴增與熔解曲線

現(xiàn)已證實，IL-2是TNF-α-NF-κB P65通路上游促活因子，可誘導自然殺傷細胞、細胞毒性T 細胞和淋巴因子誘導殺傷細胞等產(chǎn)生，分泌多種細胞因子（IL-6、TNF-α、CSF、IFN-γ 等）［14］。尤其是 IL-6 在器官缺血再灌注損傷、感染及急性炎癥反應時快速生成，刺激B 細胞增殖分化及分泌，并活化巨噬細胞而誘發(fā)更嚴重的氧化應激反應，加重組織或器官損傷［15］。TGF-β1能刺激間充質(zhì)細胞，與 IL-2 和 IL-6 聯(lián)合共同誘導胸腺T、B 細胞增殖，通過IL-6 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)誘導成纖維細胞c-sis基因表達而促進細胞外基質(zhì)表達，抑制細胞外基質(zhì)降解［16］。這是器官缺血再灌注損傷、氧化應激反應、遲發(fā)型超敏反應、自身免疫反應、細胞免疫及器官移植排斥的關鍵環(huán)節(jié)［17］。RIRI多見于創(chuàng)傷、休克、腎移植、腎切除等，其發(fā)病機制與炎癥、氧化應激、腎小管壞死、腎小管細胞凋亡等有關，屬于固有免疫和適應性免疫共同介導的免疫失調(diào)性炎癥性疾?。?0］。動物研究證實，與組織實性變化相關的TGF-β 分子，可通過 TβR1-Smad2/3 依賴性和非依賴性途徑阻止細胞外基質(zhì)降解，加速細胞外基質(zhì)生成，從而加重組織實性變化［11］。NF-κB 是迄今功能最多的存在于各組織器官細胞質(zhì)內(nèi)的生物活性核因子［12，18］。在腎組織內(nèi)，當腎小球或腎小管細胞質(zhì)內(nèi)無活性的 NF-κB 受到刺激后，NF-κB P65-IκB 解離成NF-κB P65 進入細胞核結(jié)合DNA，啟動TGF-β1轉(zhuǎn)錄生成TGF-β1蛋白，通過TβR1 激活成纖維細胞，引起腎組織實性變化而致腎功能損傷［19］。因EEEA 成分復雜，可能是其多成分多靶位互補作用而形成了多因子、多信號路徑調(diào)控效應［11，20-21］。

Figure 6. Effects of EEEA on the protein levels of NF-κB P65 and TβR1-Smad2/3 in rabbit kidney tissues. A：the protein levels of NF-κB P65 and p-P65；B：the protein levels of TβR1 and Smad2/3. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs normal group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs EEEA-L group；▲P＜0.05 vs EEEA-H group；▼P＜0.05 vs Dex+EEEA-H group.圖6 EEEA對兔腎組織TβR1-Smad2/3和NF-κB P65蛋白表達的影響

總之，結(jié)合本團隊前期研究，本研究結(jié)果顯示，EEEA 通過抑制氧化應激反應，對RIRI 家兔的腎功能有保護作用，加上其與Dex 聯(lián)合抗RIRI 的疊加作用及其共同抑制 TGFβ1-Smad2/3 和 TNF-α-NF-κB P65 通路激活的機制，顯示出二者聯(lián)合抗RIRI 具有研究價值。