NATD/FOXA2信號通路對乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用及其機制*

肖紅艷， 方 芳， 顧 林

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院乳腺二科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

絕大多數(shù)與乳腺癌相關(guān)的死亡是由于轉(zhuǎn)移到遠處器官，例如肺和骨骼［1］。腫瘤細胞經(jīng)歷遺傳和表觀遺傳變化以獲得轉(zhuǎn)移能力［2］。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）是表觀遺傳學研究最廣泛的一類酶，通過組蛋白上乙?；某练e來修飾染色質(zhì)［3］。重要的是，HAT 酶的調(diào)節(jié)顯著改變了正常的基因表達，并與包括癌癥在內(nèi)的幾種疾病的發(fā)展有關(guān)［4-5］。盡管在過去幾十年中描述了許多HATs 在基因調(diào)控和腫瘤發(fā)生中的作用，但其中一些酶的功能在很大程度上仍然未知，如N 末端乙?；D(zhuǎn)移酶（N-terminal acetyltransferases，NATs）主要修飾蛋白質(zhì)或多肽的 N 端 α-氨基［6］。N-α-乙酰基轉(zhuǎn)移酶D（N-α-acetyltransferase D，NATD）屬于NATs 家族成員之一，具有GCN5相關(guān)乙酰轉(zhuǎn)移酶超家族的保守序列基序，使其能專一地介導組蛋白H4和H2A的Nt乙?；?，并在不同類型惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［7］。最近的一項研究表明，NATD 是侵襲性肝癌亞型潛在預后標志物［8］。此外，NATD 在肝細胞癌組織中顯示下調(diào)，并且異位NATD 表達使肝癌細胞系對藥物誘導的凋亡敏感［9］。盡管有上述證據(jù)，NATD在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的NATD 通過抑制轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A2（forkhead box protein A2，F(xiàn)OXA2）表達以促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移，并且該過程涉及腫瘤細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）發(fā)生。因此，NATD 可能成為乳腺癌的潛在治療靶點。

材料和方法

1 細胞

人細胞系MDA-MB-231 及其對肺轉(zhuǎn)移衍生物LM2-4175（LM2）、MCF10CA1h 及其轉(zhuǎn)移性等基因系MCF10CA1a 均購自 ATCC。MDA-MB-231 及 LM2 接種在含有10%胎牛血清（HyClone）和100 mg/L 青霉素/鏈霉素（Gibco）的 DMEM 培養(yǎng)液（HyClone）中生長。MCF10 系列細胞系在補充有10 mg/L 胰島素、20 μg/L 表皮生長因子、0.5 μg/L 氫化可的松、100μg/L 青霉素/鏈霉素和 20% 馬血清（HyClone）的DMEM/F12 培養(yǎng)液（HyClone）中生長。每周使用第5~8代的細胞培養(yǎng)物測試支原體污染。

2 方法

2.1 癌細胞中蛋白的質(zhì)譜分析 通過刮刀或胰蛋白酶處理收集培養(yǎng)的細胞，用裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS 與磷酸酶和蛋白酶抑制劑）在冰上裂解 15 min，然后以 17 000×g離心 15 min。用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度。上樣30μg 的蛋白質(zhì)，并在8%~12% SDS-PAGE 分離。每條泳道被切割成12個部分。將每個切片切成約1 mm×1 mm×1 mm的立方體，然后將凝膠片在100%乙腈中脫水15 min，通過SpeedVac 完全干燥，在50 μL 含有0.01 μg/μL 胰蛋白酶（Promega）的25 mmol/L 碳酸氫銨（Promega）中溶脹，并在37 ℃下孵育過夜。肽段用含5%甲酸的50%乙腈提取4 次。將所得肽段在MDLC 系統(tǒng)（Michrom Bioresources）與 Thermo Finnigan 2D 線性離子阱質(zhì)譜儀（Thermo）耦合上進行納米LCMS/MS實驗。所有數(shù)據(jù)文件都是通過對人類國際蛋白質(zhì)指數(shù)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（IPI. Human. v3.67.fasta）搜索 MS/MS 譜圖創(chuàng)建，使用 BioWorks 3.3 軟件套件中的TurboSEQUEST 程序，前體-離子質(zhì)量容差為2.0 amu，碎片離子質(zhì)量容差為0.8 amu。胰蛋白酶被設(shè)置為蛋白酶，允許有兩個缺失的切割位點。搜索的肽段和蛋白質(zhì)在Trans-Proteomic Pipeline（TPP）4.2 中使用默認參數(shù)通過PeptideProphet1 和ProteinProphet2 進行驗證。ProteinProphet P 值大于0.9 且具有不少于3 種獨特肽段的蛋白質(zhì)被認為是真正的鑒定。隨機IPI.HUMAN.v3.67.fasta 用作數(shù)據(jù)庫來估計蛋白質(zhì)識別的錯誤發(fā)現(xiàn)率。在我們的分析中，ProteinProphet 0.9的錯誤發(fā)現(xiàn)率＜1%。將含有相同肽段的蛋白質(zhì)分組，每組中只剩下一種概率最高的蛋白質(zhì)。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將全長人NATD 基因克隆到pMSCV 載體（Clontech）中以產(chǎn)生NATD表達質(zhì)粒。NATDshRNA（sh-NATD）質(zhì)粒購自Sigma。所有質(zhì)粒均通過DNA 測序驗證。將MDA-MB-231、LM2 細胞接種在6 孔板中，生長至80%~90%匯合度并用X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑（Roche）將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中，以進行NATD過表達和敲除。對于救援實驗，MDA-MB-231細胞與FOXA2和NATD過表達質(zhì)粒體共轉(zhuǎn)染48 h，收獲細胞用于后續(xù)分析。針對FOXA2過表達質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 人乳腺癌組織及免疫組化分析 石蠟包埋的原發(fā)腫瘤146 個從天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院獲得。分別對其中具有隨訪信息的樣本用于轉(zhuǎn)移（n=96）和具有總生存信息的樣本用于總生存（n=58）的Kaplan-Meier 分析。研究經(jīng)所有受試者的知情同意和醫(yī)院機構(gòu)的倫理委員會批準研究。將石蠟固定的標本切成4μm 厚，并附著在玻片上。然后將腫瘤組織切片在二甲苯中脫蠟并用梯度乙醇脫水。用蒸餾水沖洗后，在室溫下用3.0%過氧化氫阻斷組織過氧化物15 min。抗原在檸檬酸緩沖液中用微波加熱修復。然后將載玻片冷卻至室溫。用PBS洗滌3次后，用抗NATD 抗體孵育載玻片。通過HRP 連接的Ⅱ抗顯示結(jié)合的Ⅰ抗。在倒置顯微鏡拍攝圖像。根據(jù)腫瘤的染色強度中值將樣本分為NATD 高表達組和低表達組并用于生存分析。

2.4 小鼠實驗 從上海斯萊克實驗動物有限責任公司購買了6~8 周齡Balb/c 雌性小鼠。小鼠被麻醉并向尾靜脈注射NATD過表達或敲除乳腺癌細胞（MDA-MB-231 和 LM2 細胞：2.5×105）用于肺轉(zhuǎn)移。對于生物發(fā)光成像（bioluminescence imaging，BLI），通過給小鼠腹腔注射底物D-熒光素（150 mg/kg），然后使用IVIS 光譜儀（PerkinElmer）監(jiān)測腫瘤細胞的全身擴散，并在不同時間點使用BLI 測量了肺部轉(zhuǎn)移負擔。使用Living Image 2.50 分析BLI 圖像。通過人工繪制肺輪廓對應(yīng)區(qū)域內(nèi)BLI 信號的光子通量來測量肺轉(zhuǎn)移性腫瘤負擔。

2.5 微陣列分析技術(shù) 分別使用Affymetrix 人類基因2.0 ST 陣列對LM2 和MCF10CA1a 進行基因表達微陣列分析，包括或不包括NATD敲除。使用默認設(shè)置的R 軟件包“Oligo”對數(shù)據(jù)進行分析，并使用魯棒多芯片平均算法（RMA）對原始數(shù)據(jù)進行歸一化。將對照組和NATD基因敲除組之間表達水平變化1.5倍或更大（t檢驗P＜0.05）的基因定義為差異表達基因。

2.6 反相蛋白質(zhì)陣列分析 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染NATD敲除的LM2 和MCF10CA1a 的蛋白裂解物連續(xù)稀釋并排列在硝酸纖維素涂層的載玻片上。在上海伯豪生物技術(shù)有限公司對載玻片上的蛋白質(zhì)裂解物進行反相蛋白質(zhì)陣列分析分析。通過標準化log2 轉(zhuǎn)化和以抗體為中心的中值來表示蛋白質(zhì)和磷蛋白的表達水平。使用Studentt檢驗確定對照組和NATD基因敲除組之間的蛋白質(zhì)表達差異，雙側(cè)P＜0.05。

2.7 高通量測序數(shù)據(jù)分析 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀測序（RIP-seq）研究樣本均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司在Illumina HiSeq 2500 進行，單端讀取長度為50 bp。使用hisat2 將深度測序數(shù)據(jù)與人類參考基因組版本38（GRCh38）比對?；蚪Y(jié)構(gòu)注釋通過R 軟件包BioMart 從BioMart 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集hsapiens_Gene_ensembl 中提取。如果相應(yīng)基因具有多個異構(gòu)體，則使用最長的異構(gòu)體，并將對齊的讀取擴展到150 bp 以滿足平均片段大小。為了平衡峰值調(diào)用中內(nèi)含子的干擾，我們將基因結(jié)構(gòu)注釋從基于基因組的坐標轉(zhuǎn)換為基于最長異構(gòu)體的坐標。每個基因每個窗口的讀取計數(shù)通過相應(yīng)基因所有窗口的中值讀取計數(shù)進行標準化。RIP富集峰（窗口）通過FDR＜0.05 和富集分數(shù)的 log2 轉(zhuǎn)換≥1 確定。通過 Fisher 精確測試P值調(diào)整FDR，該值評估RIP和輸入樣本之間的差異窗口。通過（IP_C×Input_MedC）（/IP_MedC×Input_C）計算窗口富集分數(shù)。IP_C：當前峰值中RIP樣本的讀取計數(shù)；IP_MedC：當前異構(gòu)體上所有窗口中RIP 樣本的中值讀取計數(shù)；Input_C：讀取當前峰值中輸入樣本的計數(shù)；Input_MedC：當前異構(gòu)體上所有窗口中輸入樣本的中值讀取計數(shù)。每個基因中RIP-seq 的標準化分布是每個亞型中每個位點的讀取計數(shù)，通過選取相應(yīng)亞型中所有位點的中值對讀取計數(shù)標準化。

2.8 細胞遷移和侵襲測定 在Transwell 室（BD Biosciences）中檢測細胞遷移能力。細胞接種在上室孵育24 h，將滲透到下表面的遷移細胞固定并用結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich）染色。對于侵襲測定，基質(zhì)凝膠預涂在上室的聚碳酸酯膜上，其他同遷移能力測定。用BX-60顯微鏡（Olympus）觀察細胞。

2.9 免疫熒光測定 MDA-MB-231 細胞用指定的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并鋪在室載玻片上。細胞在3.7%甲醛中固定，并在室溫下用0.15%Triton X-100 滲透。然后洗滌細胞，用5% BSA 封閉并與抗E-鈣黏蛋白（1∶500，Cell signaling Technology）和抗N-鈣黏蛋白（1∶800，Cell signaling Technology）抗體在4 ℃溫育16 h。然 后 用 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 偶 聯(lián) II 抗（Thermo Fisher Scientific）探測細胞，用DAPI 染色并固定在顯微鏡載玻片上。使用Leica 共聚焦系統(tǒng)（Leica）對細胞進行成像。

2.10 Western blot 使用RIPA 裂解緩沖液（Abcam）從細胞中提取總蛋白。將50μg 細胞裂解物電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（GE Healthcare）。然后封閉膜并用抗NATD（1∶1 000）、FOXA2（1∶800）、E-鈣粘蛋白（1∶2 000）、N-鈣粘蛋白（1∶1 000）、波形蛋白（1：500）和GAPDH（1∶5 000）抗體在4 ℃孵育過夜。洗滌膜并用HRP 偶聯(lián)的Ⅱ抗進行探測。所有抗體均購自Abcam。ECL 底物用于觀察印跡。用ImageJ軟件分析相對條帶強度。

3 統(tǒng)計學處理

本研究中的所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0 進行分析，并表示為至少3 個獨立實驗的平均值±標準差（mean±SD）。組間比較采用雙尾Student＇st檢驗，多組間比較采用單向方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。繪制Kaplan-Meier 生存曲線分析乳腺癌中NATD 表達對總體存活率、無轉(zhuǎn)移生存的影響，以及NATD過表達或敲減對小鼠的無轉(zhuǎn)移生存期的影響，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 NATD表達與乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

質(zhì)譜組學分析顯示共有30 個蛋白在轉(zhuǎn)移腫瘤細胞中的表達上調(diào)，其中NATD 是受調(diào)控的蛋白質(zhì)之一（圖1A）。此外，Western blot 也證實了NATD 蛋白在LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移腫瘤細胞中的表達高于MDA-MB-231 和MCF10CA1h 親本腫瘤細胞（圖1B）。為了進一步驗證NATD 表達的臨床相關(guān)性，我們通過NATD 免疫組化染色分析了一組人類乳腺腫瘤（圖1C），發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中較高的NATD 表達與患者的總生存期縮短（HR=3.673，95% CI=1.611~8.376，P=0.003）和無轉(zhuǎn)移縮短（HR=3.347，95%CI=1.740~6.438，P=0.001）有關(guān)（圖1D、E）。這些結(jié)果表明NATD與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移之間呈正相關(guān)。

Figure 1. NATD expression was related to breast cancer cell metastasis. A：MS omics analysis heatmap of breast cancer cell lines with different metastatic ability；B：The expression of NATD protein in breast cancer cell lines with different metastatic ability was analyzed by Western blot（I：MDA-MB-231；II：LM2；III：MCF10CA1h；IV：MCF10CA1a）；C：the low expression and high expression of NATD in breast cancer tissues were demonstrated by immunohistochemistry；D：comparison of overall survival rate between high and low expression of NATD in breast cancer（n=58）；E：comparison of metastasis-free survival between high and low expression of NATD in breast cancer（n=96）.圖1 NATD表達與乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)

2 NATD促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

然后我們探討了NATD 在肺轉(zhuǎn)移中的功能作用。分別在MDA-MB-231 細胞和LM2 細胞中過表達或敲減NATD，并通過Western blot 驗證（圖2A）。將NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，與pMSCV 對照組相比，NATD 過表達組顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負擔（圖2B、C）并縮短了動物的存活期（圖2D）。相比之下，將NATD敲減的LM2 癌細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，減少了小鼠的肺定植并延長了無轉(zhuǎn)移生存期（圖2E~G）。

Figure 2. NATD promoted lung metastasis of breast cancer. A：overexpression and knockdown of NATD in MDA-MB-231 and LM2 were verified by Western blot. B，C and D：MDA-MB-231 overexpressing NATD was injected intravenously for lung metastasis analysis. B：bioluminescence imaging（BLI）quantification and representative images（n=10）；C：Lung surface nodules quantification and representative images（n=5）；D：animal survival rate（n=8）. E，F(xiàn) and G：intravenous injection of NATD knockdown LM2 for lung metastasis analysis. E：bioluminescence imaging（BLI）quantification and representative images（n=10）；F：lung surface nodules quantification and representative images（n=5）；G：animal survival rate（n=8）.Mean±SD.**P＜0.01 vs pMSCV group；△△P＜0.01 vs sh-NC group.圖2 NATD促進乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移

3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq 分析鑒定NATD靶標

為了研究NATD 在轉(zhuǎn)移中的分子機制，我們使用反相蛋白質(zhì)陣列分析了NATD敲減的LM2 和MCF10CA1a 轉(zhuǎn)移癌細胞的蛋白質(zhì)表達，其涵蓋了主要信號通路中的蛋白質(zhì)標記物。在分化表達的蛋白質(zhì)中，有34 個蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著改變（22 個蛋白質(zhì)上調(diào)，12個蛋白質(zhì)下調(diào)）（圖3A）。接下來，在LM2細胞中進行NATD RNA 免疫沉淀測序（RIP-seq），并在22 個上調(diào)蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn) 3 個基因（FOXA2、ABL1和MSH6）的mRNA 與NATD 蛋白結(jié)合（圖3B），表明它們是NATD 的直接目標。已知FOXA2對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移很重要；其他2 個基因在轉(zhuǎn)移中的功能目前尚未見報道。一致地，LM2 和MCF10CA1a 細胞中的NATD敲減也在體外上調(diào)這些基因的蛋白水平（圖3C）。

4 FOXA2是NATD在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中的必需靶點

為了研究NATD 是否通過調(diào)節(jié)NATD 軸發(fā)揮作用，我們在MDA-MB-231 細胞中過表達 NATD 和FOXA2。在NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞中，F(xiàn)OXA2 表達明顯降低（圖4A）。然而，在NATD 過表達的MDA-MB-231 細胞中，F(xiàn)OXA2 過表達在一定程度下調(diào)NATD 表達和上調(diào) FOXA2 表達（圖 4A、B）。NATD 過表達介導的對MDA-MB-231 細胞侵襲和遷移的促進作用被FOXA2 過表達逆轉(zhuǎn)（圖4C、D）。此外，免疫熒光和Western blot 印跡分析顯示，NATD 過表達介導MDA-MB-231 細胞的EMT 過程，而FOXA2過表達逆轉(zhuǎn)了NATD 對EMT 過程的誘導作用（圖4E~H）。這些數(shù)據(jù)提示NATD 可能通過調(diào)節(jié)FOXA2來抑制乳腺癌的EMT和轉(zhuǎn)移。

Figure 3. Identification of NATD targets by high-throughput reversed-phase protein array and RIP-Seq analysis. A：supervised hierarchical clustering analysis of the differential expression of 34 proteins identified by the high-throughput reverse-phase protein array between NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells；B：RNA immunoprecipitation sequencing（RIP-seq）showed the combination of NATD with a single mRNA of the transferred gene in LM2 cells［the normalized reading distribution of Input（blue）and NATD（red）along the mRNA］；C：Western blot analysis of NATD protein expression levels in NATD knockdown LM2 and MCF10CA1a metastatic cancer cells.圖3 通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列和RIP-Seq分析鑒定NATD靶標

討 論

隨著早期診斷和全身治療的進步，大多數(shù)早期非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者被認為有可能治愈［10］。然而，轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍然被認為是無法治愈的，死亡率很高［11］。因此，探索轉(zhuǎn)移機制是開發(fā)更有效的乳腺癌療法的關(guān)鍵。EMT 是轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的第一步，以促進癌細胞從原發(fā)腫瘤逃逸［12］。在這項研究中，我們證明NATD 可能通過下調(diào)FOXA2的表達來抑制乳腺癌的EMT 和轉(zhuǎn)移。與其他研究一致，我們的數(shù)據(jù)揭示了NATD/FOXA2 軸在EMT 和乳腺癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，并表明NATD/FOXA2 軸是開發(fā)治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的潛在分子靶點。

Figure 4. FOXA2 overexpression can inhibit the EMT and metastasis of MDA-MB-231 cells. MDA-MB-231 cells were transfected with plasmids against NATD and/or FOXA2. A：the expression of NATD and FOXA2 protein were analyzed by Western blot（n=3）；B：Transwell analysis of MDA-MB-231 cells（n=3）；C：immunofluorescence detection of E-cadherin（green）and N-cadherin（red）immunofluorescence staining（n=3，×100）；D：the expression of E-cadherin，N-cadherin and vimentin protein were analyzed by Western blot（n=3）. Mean±SD.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs NATD group.圖4 FOXA2過表達可抑制MDA-MB-231細胞的EMT和轉(zhuǎn)移

組蛋白修飾在基因調(diào)控中具有重要作用［13］。然而，即使這種修飾很豐富，并且相應(yīng)的NAT酶在真核生物中高度保守，但是組蛋白H4的N-α-末端乙酰化的功能仍然不確定［14］。最近發(fā)現(xiàn)NAT酶在幾種人類癌癥的發(fā)展和進展中的關(guān)鍵作用突出了它們的重要臨床意義［15-16］。有研究證實，NATA 復合物（Naa10p，NATA 復合物的催化亞基）與腫瘤有關(guān)，并且對于維持增殖和確保各種癌細胞的存活至關(guān)重要［17］。由于NATD 催化活性僅限于組蛋白H4 和H2A，最近研究發(fā)現(xiàn)NATD 可通過不依賴p53 的機制在結(jié)直腸癌細胞中具有抗凋亡作用，并且NATD-KD 細胞對化療治劑表現(xiàn)出更高的敏感性［18］。此外，臨床觀察顯示，肺癌組織中的NATD 表達水平較鄰近的正常組織顯著升高，并且與患者的存活率呈負相關(guān)，證實了NATD促進肺癌進展［7］。本研究擴展了先前的研究發(fā)現(xiàn)，證實了NATD 在轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞中的表達高于親本癌細胞，并且NATD過表達的MDA-MB-231細胞顯著加劇了小鼠肺轉(zhuǎn)移負擔。相比之下，NATD敲減的LM2 細胞減少了小鼠的肺定植并延長了無轉(zhuǎn)移生存期。這些發(fā)現(xiàn)證明了NATD 在乳腺癌中的促轉(zhuǎn)移作用。

最近研究證實組蛋白修飾與EMT 密切相關(guān)［19］。要進行EMT，癌細胞需要獲得除遺傳變化以外的表觀遺傳變化［20］。這項研究通過高通量反相蛋白質(zhì)陣列RIP-Seq分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子FOXA2為NATD靶標。FOXA2 屬于轉(zhuǎn)錄因子的叉頭/翼狀螺旋家族［21］，參與胚胎發(fā)育，并在來自三個胚層的多個成體組織中廣泛表達和發(fā)揮作用［22］。FOXA2在多種人類腫瘤中發(fā)揮作用，如肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌，并且FOXA2 的持續(xù)表達通?？梢苑乐股鲜瞿[瘤的進展［23-25］。FOXA2 在正常人乳腺上皮細胞中表達，但其表達因臨床乳腺癌樣本中FOXA2 基因甲基化增加而下調(diào)，表明 FOXA2 影響乳腺癌進展［26］。FOXA（HNF-3）是維持上皮標志物E-cadherin表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，提示FOXA2 參與了EMT 的調(diào)控［27］。許多研究還證實，F(xiàn)OXA2 通過抑制各種人類腫瘤（如胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌）中的EMT，起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［28-30］。更重要的是，本研究中乳腺癌細胞中FOXA2的表達水平與NATD 的表達水平密切相關(guān)，過表達NATD 通過抑制FOXA2 表達進而誘導EMT 過程。這些發(fā)現(xiàn)確定了NATD 在基因表達調(diào)控中的新功能，并擴展了我們對EMT 表觀遺傳調(diào)控的理解。在我們的結(jié)果中，F(xiàn)OXA2 是NATD 介導EMT 過程的直接表觀遺傳靶點。然而，考慮到NATD調(diào)節(jié)多個基因表達的能力，本研究不能完全排除由NATD 直接調(diào)節(jié)的其他基因有助于獨立于FOXA2表達的遷移和侵襲的可能性。

總之，在本研究中，我們首次證明NATD 通過控制FOXA2 介導的EMT 來促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。我們的結(jié)果不僅揭示了乳腺癌轉(zhuǎn)移的新調(diào)控機制，而且為開發(fā)治療乳腺癌的新策略提供了潛在的靶點。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，靶向NATD/FOXA2 軸可能是治療乳腺癌的新策略。