組蛋白脫乙酰酶2介導(dǎo)的組蛋白乙?；Ш庠趬毫^載性心肌重構(gòu)中的作用*

羅孝美， 彭 昌， 吳書琪， 張煥婷， 田小春

（1遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，貴州 遵義 563000；2遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，貴州 遵義 563000）

心肌重構(gòu)（myocardial remodeling）是指在神經(jīng)體液因子的作用下，心肌細胞出現(xiàn)分子生物學(xué)和基因改變導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)和功能障礙，該病理生理變化是多種心臟疾患發(fā)展為慢性心衰的必經(jīng)階段，但具體發(fā)病機制尚不清楚，且治療手段匱乏［1-2］。因此，探討心肌重構(gòu)的發(fā)生機制及治療措施將為慢性心衰的防治帶來更多的選擇。本研究團隊前期證實組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c調(diào)控苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展［3-7］，但在壓力過載性心肌重構(gòu)過程中是否仍具有調(diào)控作用仍不清楚。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶提取物的主要成分，其在多種心血管疾病中均表現(xiàn)出良好的保護作用［8］。組蛋白脫乙酰酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）是經(jīng)典Ⅰ類HDAC 亞型之一，參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展［9-10］，我們前期證實HDAC5 介導(dǎo)的組蛋白H3K27 乙?；Ш鈪⑴c了心肌重構(gòu)［11］，但HDAC2是否通過調(diào)控H3K27乙?；瘏⑴c壓力過載性心肌重構(gòu)仍不清楚。本研究通過構(gòu)建小鼠壓力過載性心肌重構(gòu)模型，從組蛋白乙酰化修飾的全新角度探討組蛋白乙?；揎検Ш庠谛募≈貥?gòu)中的作用及相關(guān)機制，為心肌重構(gòu)的防治提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物及分組

選取6~8 周齡SPF 級昆明雄性小鼠54只，體重25~30 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，許可證號為SYXK（渝）2012-0015。按照隨機數(shù)字表法將小鼠分為：正常（normal）組、假手術(shù)（sham）組、溶劑（vehicle）組、部分胸主動脈結(jié)扎（transverse aortic constriction，TAC）組和TAC+EGCG組。每組6只小鼠。參照既往方法［12］，TAC組部分結(jié)扎胸主動脈（約主動脈直徑的70%）；sham組只分離不結(jié)扎；vehicle組給予等體積二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）腹腔注射；TAC+EGCG組部分結(jié)扎胸主動脈后1 周給予50 mg·kg-1·d-1EGCG 腹腔注射，連續(xù)注射至術(shù)后 12 周；normal組未給予任何處理。收集術(shù)后 4 周、8 周和12 周小鼠心臟進行檢測。

2 主要試劑與儀器

抗第27 位賴氨酸乙?；M蛋白H3（acetylated histone H3 at lysine 27，H3K27ac）單克隆抗體、抗HDAC2單克隆抗體及抗腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）單克隆抗體（Abcam）；抗β-actin 抗體及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（Proteintech）；抗心肌細胞增強因子2A（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）單克隆抗體（Santa Cruz）；SDS-PAGE 試劑盒（Beyotime）。

3 主要實驗方法

3.1 構(gòu)建小鼠TAC 心肌重構(gòu)模型 小鼠術(shù)前禁食禁飲8 h，術(shù)前腹腔注射戊巴比妥行全身麻醉，通過翻正反射和足蹬撤退反射的消失來確定麻醉程度，仰臥位固定小鼠。在相對無菌環(huán)境下，沿小鼠胸骨正中線將胸骨剪開，小心分離兩側(cè)胸腺，直到主動脈弓充分暴露，然后用手術(shù)線結(jié)扎主動脈弓部（結(jié)扎約管腔直徑的70%），縫合胸腔。術(shù)后給予青霉素（每只15 萬單位）腹腔注射防止感染，連續(xù)3 天，術(shù)后均自由進水進食。

3.2 Western blot 檢測 應(yīng)用核蛋白提取試劑盒提取心肌組織胞核蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，8%或12%SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜浸泡于含有5%脫脂牛奶的封閉液中封閉2 h，分別加入兔抗小鼠 H3K27ac（1∶200）、HDAC2（1∶1 000）、BNP（1∶1 000）和MEF2A（1∶1 000）單克隆抗體，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜緩沖液TBST 洗滌，每次5 min，洗滌6 次，加入山羊抗兔Ⅱ抗（1∶2 000）孵育，搖床上孵育1 h，TBST 洗滌，每次5 min，洗滌 6 次，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影。采用Bio-Rad 圖像分析儀進行圖像掃描；應(yīng)用Quantity One 4.4版本軟件進行分析。

3.3 超聲心動圖檢測 10%水合氯醛腹腔麻醉小鼠后，參照以往報道的方法［13］，應(yīng)用 Vevo 2100 超聲儀檢測小鼠心臟左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室前壁厚度（left ventricular anterior wall hickness，LVAWT）和左室后壁厚度（left ventricular posterior wall hickness，LVPWT）。

3.4 左心室內(nèi)壓測定 戊巴比妥腹腔麻醉小鼠后，參照以往報道的方法［14］，經(jīng)小鼠左頸總動脈插入直徑0.6 mm 的導(dǎo)管到左心室，應(yīng)用ES420 生物系統(tǒng)檢測小鼠左心室收縮末期壓力（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）。

3.5 Masson 染色 收集4、8和12周各組小鼠心臟，4 ℃生理鹽水沖洗心臟組織后置入4%組織細胞固定液中過夜固定；蒸餾水沖洗固定組織后按順序依次添加不同濃度的乙醇和二甲苯試劑進行常規(guī)脫水包埋，然后切片（厚度5 μm）；接著先后使用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10 min 進行脫蠟，不同濃度的乙醇溶液進行水化，然后雙蒸水中浸泡5 min；將切片放入Bouin 液，室溫過夜進行媒染后，蒸餾水沖洗至切片上的黃色消失；按照試劑盒說明書依次先后添加試劑進行染色（天青石藍染色液3 min，Mayer 蘇木素染色液3 min，酸性分化液數(shù)秒，麗春紅品紅染色液10 min，磷鉬酸溶液10 min，苯胺藍染色液5 min，弱酸溶液2 min）；將染色后的切片用不同濃度的乙醇溶液進行醇洗，最后二甲苯透明3 次后中性樹脂封片鏡檢。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較應(yīng)用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 部分結(jié)扎胸主動脈構(gòu)建TAC小鼠模型

部分結(jié)扎小鼠胸主動脈后通過超聲心動圖檢測小鼠胸主動脈證實TAC 模型構(gòu)建成功。超聲心動圖結(jié)果顯示，sham組小鼠主動脈弓降部無狹窄（圖1-A1 綠色箭頭），超聲多普勒提示通過主動脈的血流順暢（圖1-A2 綠色箭頭）；TAC組小鼠主動脈弓降部明顯變窄（圖1-B1 紅色箭頭），超聲多普勒提示通過胸主動脈弓降部的血流減少（圖1-B2紅色箭頭）。同時，TAC組和TAC+EGCG組小鼠術(shù)后4 周胸主動脈直徑和胸主動脈血液流速與術(shù)前相比均有顯著差異（均P＜0.05），而sham組小鼠術(shù)前和術(shù)后胸主動脈直徑和胸主動脈血液流速均無顯著差異（P＞0.05），見圖1C、D。

2 EGCG 對 TAC 小鼠心肌組織中 H3K27ac 和HDAC2蛋白水平的影響

建模成功后，應(yīng)用Western blot 檢測小鼠心肌組織中H3K27ac 和HDAC2 蛋白水平。結(jié)果顯示，TAC組小鼠心肌組織中組蛋白H3K27 乙?；捷^sham組顯著降低（P＜0.05）；而TAC+EGCG組小鼠心肌組織中組蛋白H3K27乙?；捷^TAC組顯著升高（P＜0.05），見圖2A。同時，TAC組小鼠心肌組織中 HDAC2 表達水平較sham組顯著升高（P＜0.05）；而TAC+EGCG組小鼠心肌組織中HDAC2 表達水平較TAC組顯著降低（P＜0.05），見圖2B。

3 EGCG 對TAC 小鼠心臟發(fā)育相關(guān)蛋白MEF2A和BNP表達的影響

Western blot 結(jié)果顯示，TAC組小鼠心肌組織中MEF2A和BNP蛋白表達水平較sham組顯著降低（均P＜0.05）；而 TAC+EGCG組小鼠心肌組織中 MEF2A和BNP 蛋白表達水平較TAC組顯著升高（均P＜0.05），見圖3A、B。

4 EGCG對TAC小鼠心功能的影響

超聲心動圖結(jié)果顯示，TAC組小鼠LVEED 和LVESD 較sham組顯著增加（均P＜0.05），而EGCG+TAC組小鼠LVEED 和LVESD 較TAC組顯著降低（均P＜0.05）；同時，TAC組小鼠 LVEF 較 sham組顯著降低（P＜0.05），而 EGCG+TAC組小鼠 LVEF 較 TAC組顯著升高（P＜0.05），見圖4及表1。

表1 超聲心動圖檢測小鼠心功能Table 1. Cardiac function measurements by echocardiography（Mean±SD. n=6）

5 EGCG對TAC小鼠左心室內(nèi)壓的影響

應(yīng)用ES420 生物系統(tǒng)檢測小鼠LVESP，實驗結(jié)果顯示，TAC組小鼠LVESP 較sham組顯著降低（P＜0.05），而 EGCG+TAC組小鼠 LVESP 較 TAC組顯著升高（P＜0.05），見圖5。

6 TAC 小鼠不同時點心肌纖維化水平及左心室壁厚度

應(yīng)用Masson染色檢測TAC小鼠術(shù)后4周、8周和12周小鼠心肌組織纖維化程度，結(jié)果表明，隨著TAC術(shù)后時間的延長，心肌組織纖維化程度越來越明顯，TAC 術(shù)后12 周時纖維化程度最嚴重，見圖6。同時，超聲心動圖表明TAC 術(shù)后4 周左心室前壁和后壁開始出現(xiàn)心肌肥厚（LVAWT 和LVPWT 增大）；8周時心肌肥厚明顯，與sham組相比差異顯著（P＜0.05）；而TAC 術(shù)后12 周時，心肌肥厚程度較8 周時減輕（P＜0.05），見表2。

表2 超聲心動圖檢測小鼠左室壁厚度Table 2. Left ventricular wall thickness measurements by echocardiography（Mean±SD. n=6）

討 論

Figure 1. The transverse aortic constriction（TAC）model in mice was tested by echocardiography. A1：echocardiography imaging of the aortic arch of a mouse in sham group（green arrow）；A2：color Doppler imaging showing normal blood flow in the aortic arch（green arrow）；B1：echocardiography imaging of the aortic arch of a ligated mouse（red arrow）；B2：color Doppler imaging showed that blood flow had been blocked in the aortic arch（red arrow）；C：statistical analysis of thoracic aorta diameter in mice；D：statistical analysis of velocity of transverse aorta blood flow in mice. EGCG：epigallocatechin gallate.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs before operation.圖1 超聲心動圖檢測小鼠TAC模型

慢性心衰是多種心臟疾患的終末階段，目前尚無十分有效的治療手段，雖然一些新興的防治措施逐漸進入臨床應(yīng)用，但仍不能完全恢復(fù)衰竭心臟的結(jié)構(gòu)和功能［15-17］。心肌重構(gòu)是慢性心衰發(fā)生、發(fā)展的重要病理過程。因此，從心肌重構(gòu)入手探討慢性心衰的防治措施可能為該病提供一定的思路。現(xiàn)已證實心肌細胞肥大是心肌重構(gòu)的重要病理變化之一。本課題組前期研究顯示，組蛋白H3K9乙酰化修飾失衡參與了苯腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大［4］。然而組蛋白其它修飾位點（如H3K27）乙酰化是否參與了壓力過載性心肌重構(gòu)以及參與調(diào)控的乙?；改壳叭圆磺宄?。

Figure 2. The effects of epigallocatechin gallate（EGCG）on the protein levels of H3K27ac（A）and HDAC2（B）in the heart of transverse aortic constriction（TAC）mice. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.圖2 EGCG對TAC小鼠心肌組織中H3K27ac和HDAC2蛋白水平的影響

Figure 3. The effects of epigallocatechin gallate（EGCG）on the expression of MEF2A（A）and BNP（B）in the heart of transverse aortic constriction（TAC）mice. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.圖3 EGCG對TAC小鼠心臟發(fā)育相關(guān)蛋白MEF2A和BNP表達的影響

壓力過載致慢性心衰模型主要是模擬臨床上由于心臟大血管畸形所致的心臟后負荷過重的患者，隨著時間的推移，在此過程中往往伴有病理性心肌重構(gòu)的發(fā)生。本課題組前期研究證實，HDAC2 介導(dǎo)的組蛋白乙酰化修飾失衡參與了苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大［18］，心肌細胞肥大往往是病理性心肌重構(gòu)的重要階段。因此，我們推測HDAC2 可能在壓力過載性心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。正如我們所預(yù)期的一樣，TAC 模型組小鼠心肌組織中HDAC2 呈現(xiàn)高表達，且其組蛋白H3K27 呈現(xiàn)低乙?；@提示H3K27 乙?；揎検Ш饪赡苁艿紿DAC2的調(diào)控，與國外研究報道相一致［19］。EGCG是綠茶提取物的主要成分，研究顯示其在組蛋白乙?；揎椫芯哂兄匾恼{(diào)控作用［11，20］。本研究顯示 EGCG 處理后的模型小鼠心肌組織中HDAC2 表達水平顯著降低，且組蛋白H3K27 乙?；皆贓GCG 處理組較模型組亦顯著升高。這提示在壓力過載性心肌重構(gòu)中EGCG能夠通過抑制HDAC2的表達來減輕對組蛋白H3K27 乙酰化修飾的抑制效應(yīng)。但EGCG 并非只針對HDAC2 一種亞型的組蛋白脫乙酰酶有抑制作用，研究證實EGCG 對其他亞型的HDAC（如HDAC3/4/7）也有抑制作用［20］，因此，其他亞型的HDAC 也有可能參與該病理生理過程，所以HDAC2表達異?？赡懿⒉皇菈毫^載性心肌重構(gòu)發(fā)生的唯一調(diào)控因素，其他亞型的組蛋白及不同位點的乙?；欠褚矃⑴c其中，目前仍不清楚，尚待進一步研究證實。

Figure 4. The effects of epigallocatechin gallate（EGCG）on the cardiac function of transverse aortic constriction（TAC）mice.LVEDD：left ventricular end-diastolic dimension；LVESD：left ventricular end-systolic dimension；LVEF：left ventricular ejection fraction；A：normal group；B：sham group；C：TAC group；D：TAC+EGCG group；E：vehicle group.圖4 EGCG對TAC小鼠心功能的影響

Figure 5. The effects of epigallocatechin gallate（EGCG）on the left ventricular end-systolic pressure（LVESP）of transverse aortic constriction（TAC）mice. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs TAC group.圖5 EGCG對TAC小鼠左心室收縮末期壓力的影響

Figure 6. Myocardial fibrosis was detected by Masson staining in the heart of transverse aortic constriction（TAC）mice. Scale bar=50μm. A：sham group；B：TAC（4 weeks）group；C：TAC（8 weeks）group；D：TAC（12 weeks）group.圖6 Masson染色檢測TAC小鼠心肌纖維化

病理性心肌重構(gòu)是多種疾病發(fā)展為慢性心衰的必經(jīng)階段。多項研究證實心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達異常在慢性心衰的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［21-22］。因此，心臟發(fā)育相關(guān)蛋白的正常表達是維持心臟正常功能和結(jié)構(gòu)的基石。本研究觀察到心臟發(fā)育相關(guān)蛋白MEF2A 和BNP 的表達水平在模型組由于組蛋白低乙?；聊虮磉_的調(diào)控作用使這些基因表達水平降低，而EGCG 處理能夠逆轉(zhuǎn)上述基因的低表達。而在我們的前期研究中證實MEF2A和BNP在心肌肥厚階段（心衰代償階段）均呈現(xiàn)高表達［6］，但本研究結(jié)果顯示這2 個蛋白卻呈現(xiàn)低表達，推測主要原因可能是在心衰早期代償階段，各種調(diào)控心臟發(fā)育的蛋白處于代償階段，呈現(xiàn)高表達以滿足心功能的需求，而到后期心衰的失代償階段，心室逐漸變薄，心肌細胞數(shù)量逐漸減少，心肌纖維化增加，各種蛋白因代償能力不足出現(xiàn)低表達現(xiàn)象。為了證實上述推測，我們進一步檢測了TAC 術(shù)后不同時間點的心肌組織纖維化及心室壁的變化情況，結(jié)果正如我們所預(yù)期的一樣，隨著時間的推移TAC 小鼠心肌組織中纖維化程度逐漸增加，且左心室前壁及后壁的厚度亦從早期的肥厚發(fā)展到后期的變薄，這些結(jié)果也和另一項研究報道相一致［11］。心臟超聲心動圖結(jié)果也證實模型組小鼠LVEF 較對照組顯著降低，而LVEDD 與LVESD在模型組較對照組顯著增大，且LVESP 在模型組較對照組亦顯著降低，而EGCG 處理能夠顯著改善上述指標，改善小鼠心功能。這些均提示EGCG 在抑制壓力過載性心肌重構(gòu)過程中可能發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，HDAC2 介導(dǎo)的組蛋白H3K27 乙?；揎検Ш饪赡軈⑴c了壓力過載性心肌重構(gòu)，EGCG能在一定程度上抑制壓力過載性心肌重構(gòu)。這有可能成為病理性心肌重構(gòu)的防治靶點之一。