藥用蒲公英幼苗對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

李澳旋，呂振濤，林奕翰，馬瑞冰，秦香楠，薄賀勻，喬永剛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

藥用蒲公英（Taraxacum officinaleF.H.Wigg.）為菊科蒲公英屬多年生草本，花朵呈鮮亮黃色，種子為淺黃褐色瘦果，是重要的藥食同源植物[1]。蒲公英干燥全草入藥，含有多種化學(xué)成分且功能多樣化，可清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋[2]。蒲公英環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，喜光較耐陰，短日照高溫條件下有利于抽薹開花,光照條件好有利于莖葉的生長(zhǎng)[3]。其在山坡草地、路邊等均有廣泛分布，萌發(fā)適溫為15~25℃，葉生長(zhǎng)適溫為20~22℃，因此，土壤溫度高于30℃可能導(dǎo)致種子發(fā)芽緩慢，植株生長(zhǎng)發(fā)育停滯或死亡[4]。近年來，蒲公英市場(chǎng)需求量增大，藥用蒲公英作為中藥材蒲公英主要基原物種，其規(guī)模化種植范圍日益增大[3]。種苗質(zhì)量歸屬于易被多因素影響的數(shù)量性狀，夏季酷熱環(huán)境易影響藥用蒲公英生產(chǎn)過程，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)降低。高溫脅迫成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的因素之一[5]。

高溫脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝過程，表現(xiàn)在植株形態(tài)結(jié)構(gòu)、光合作用、膜損傷、抗氧化物保護(hù)酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等方面[6-7]。不同時(shí)長(zhǎng)的高溫脅迫會(huì)使植物幼苗產(chǎn)生不同的形態(tài)變化，如葉緣卷曲、葉片失水、植株萎蔫等[8]。崔慶梅等[9]研究了高溫脅迫時(shí)間對(duì)黃瓜幼苗生理生化及光合作用的影響。高溫脅迫會(huì)使植物葉片氣孔關(guān)閉，光合器官受損，光合相關(guān)酶活性降低，影響其光合能力[10]。通過葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以檢測(cè)植物高溫脅迫條件下光合能力的變化[11]。張俊波等[12]對(duì)野扇花進(jìn)行32 d的高溫脅迫并比較了其植株生長(zhǎng)及葉中生理生化指標(biāo)和極性代謝產(chǎn)物含量的變化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高溫脅迫對(duì)植株極性代謝產(chǎn)物積累影響很大。高溫脅迫時(shí)，植物生物膜系統(tǒng)會(huì)受到損傷，過氧化程度增加，細(xì)胞液外滲，丙二醛（MDA）含量和電導(dǎo)率發(fā)生變化[13]。同時(shí)，植物體內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的動(dòng)態(tài)平衡被打破，超氧自由基（O2-）和過氧化氫（H2O2）迅速增加，體內(nèi)保護(hù)酶大量積累，保護(hù)細(xì)胞免受傷害[14-15]。此外，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如甜菜堿、脯氨酸、糖類等）來維持植物體內(nèi)的水分平衡，保證細(xì)胞的正常生理功能[16]。

目前，藥用蒲公英的研究多聚焦在藥理[17]、耐鹽性[18]等方面，喬永剛等[19]對(duì)其高低溫脅迫下最適內(nèi)參基因及相關(guān)基因表達(dá)分析進(jìn)行了研究。但藥用蒲公英在脅迫導(dǎo)致的直觀表型以及耐高溫機(jī)制解析方面研究較少。藥用植物經(jīng)歷長(zhǎng)期脅迫與適應(yīng)過程，逐漸積累藥用所需要的次生代謝產(chǎn)物，但仍需深入研究。本研究探究藥用蒲公英幼苗在高溫脅迫下的生理響應(yīng)，為研究其逆境栽培和抗熱機(jī)理提供參考，也為采取適當(dāng)?shù)脑耘喙芾泶胧┙档透邷赜绊懱峁├碚撘罁?jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為銘賢1號(hào)藥用蒲公英。2019年5月于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)天然藥用植物資源圃（N37°25′，E112°34′）采收種子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)趙曉明教授鑒定。挑選籽粒飽滿的種子，播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石（營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1（V/V））的營(yíng)養(yǎng)缽（口徑10 cm，底徑8 cm，高9 cm）中，于適宜環(huán)境的人工氣候室中培養(yǎng)（晝溫（25±2）℃，夜溫（20±2）℃，相對(duì)濕度65%，光照強(qiáng)度12 000 lx，光周期為光照16 h/黑暗8 h），出苗后每營(yíng)養(yǎng)缽定苗1~2株，在6~7葉期進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)。

1.2 高溫脅迫試驗(yàn)

2019年6月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院選取長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)良好的藥用蒲公英幼苗于BSC-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海右一儀器有限公司）進(jìn)行高溫脅迫試驗(yàn)，即38℃下光照強(qiáng)度12 000 lx，光照16 h/黑暗8 h，相對(duì)濕度65%分別處理0（對(duì)照）、3、6、12、24、48 h，每組10株。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 利用熒光測(cè)定儀（OS5p+）檢測(cè)藥用蒲公英幼苗第二節(jié)位葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量（PSⅡactual photochemical quantum yield，ΦPSⅡ）和相對(duì)電子傳遞速率（Relative electron transport rate，ETR）直接利用OS5p+測(cè)定。初始熒光值（Initial fluores-cence，F(xiàn)o）、最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Variable fluores-cence/maximal fluorescence，F(xiàn)v/Fm）、PSⅡ潛在光化學(xué)效率（Variable fluorescence/initial fluorescence，F(xiàn)v/Fo）測(cè)定時(shí)，先進(jìn)行暗適應(yīng)30 min后再進(jìn)行測(cè)量；非光化學(xué)淬滅（Non-photochemical fluorescence quenching，NPQ）根據(jù)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.3.2 抗氧化酶活性的測(cè)定 采用馬蕾等[21]方法，測(cè)定藥用蒲公英幼苗葉片保護(hù)酶過氧化物酶（Per-oxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.3 丙二醛、相對(duì)電導(dǎo)率及脯氨酸的測(cè)定 參照李珍等[22]方法，測(cè)定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、相對(duì)電導(dǎo)率大小及脯氨酸含量，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和顯著性分析采用Microsoft office 2016和SPSS 26.0軟件，利用Origin 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)藥用蒲公英形態(tài)的影響

形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化是植物最直觀的表現(xiàn)，可以直接反映出植物受脅迫后的生長(zhǎng)狀況。從圖1可以看出，高溫脅迫后藥用蒲公英幼苗植株形態(tài)發(fā)生變化，并且脅迫時(shí)間越久，葉色失綠、葉緣卷曲、植株萎蔫，不能保持挺立的現(xiàn)象越嚴(yán)重。

2.2 高溫脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

采用熒光測(cè)定儀（OS5p+）檢測(cè)藥用蒲公英幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)。Fo可以反映植物受損程度，其大小與受破壞程度成正比，與0 h相比，3 h Fo呈下降趨勢(shì)，表明短時(shí)間高溫可促進(jìn)藥用蒲公英生理活動(dòng)，3~48 h內(nèi)Fo整體呈上升趨勢(shì)，在24 h達(dá)到最大值（圖2），說明長(zhǎng)時(shí)間高溫脅迫使幼苗受到損傷。高溫脅迫下Fv/Fm和Fv/Fo整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2），說明此時(shí)高溫脅迫可增強(qiáng)藥用蒲公英光抑制程度，損害PSⅡ光能轉(zhuǎn)化率。與0 h相比，6 h NPQ上升并達(dá)到最大值，說明藥用蒲公英有防高溫?fù)p傷能力，6~12 h下降，之后輕微上升。脅迫6 h ΦPSⅡ下降，6~24 hΦPSⅡ有輕微升高趨勢(shì)，24 h后急劇下降，說明藥用蒲公英可耐受高溫脅迫，并在一定時(shí)間內(nèi)維持較強(qiáng)的光合能力。藥用蒲公英幼苗ETR整體先上升后下降，6 h最大，48 h最小，說明高溫影響藥用蒲公英葉片內(nèi)部光合效應(yīng)。

2.3 高溫脅迫對(duì)藥用蒲公英幼苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 高溫脅迫對(duì)抗氧化酶活性的影響 測(cè)定不同高溫脅迫時(shí)間抗氧化酶活性，結(jié)果表明（圖3），與0 h相比，葉片POD先升高后降低，24 h達(dá)到最高，48 h降低；CAT也有類似變化，但在12 h最高，SOD活性在高溫脅迫6 h達(dá)到最小值，但隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，SOD活性出現(xiàn)上升后略有下降，在48 h內(nèi)總體呈波動(dòng)下降。短時(shí)間的高溫脅迫下藥用蒲公英為保護(hù)自身生命活動(dòng)的正常進(jìn)行，增強(qiáng)抗氧化酶活性，加快物質(zhì)代謝，使植物免受重度損傷。

2.3.2 高溫脅迫對(duì)丙二醛、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量的影響 對(duì)不同高溫脅迫時(shí)間下藥用蒲公英的MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率和脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定。由圖4可知，MDA、相對(duì)電導(dǎo)率基本呈升高的趨勢(shì)，說明藥用蒲公英葉片細(xì)胞膜受到損傷，且細(xì)胞膜破壞越來越嚴(yán)重，膜通透性發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)含物外滲。脯氨酸含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，6 h時(shí)達(dá)到最大，之后下降，說明脯氨酸在藥用蒲公英抗高溫機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，持續(xù)38℃高溫48 h脅迫使藥用蒲公英幼苗葉色失綠、葉緣卷曲、植株整體萎蔫現(xiàn)象嚴(yán)重，植株不能正常生長(zhǎng)，幼苗光合能力下降，生物膜系統(tǒng)受到損傷，結(jié)果也顯示，不同高溫脅迫時(shí)間下，葉片POD、CAT及脯氨酸均先升高后降低。

藥用蒲公英幼苗對(duì)高溫脅迫的各項(xiàng)生理指標(biāo)響應(yīng)表明，植株在脅迫下表現(xiàn)出一定的抵抗逆境能力，與崔慶梅等[9]黃瓜幼苗高溫脅迫研究結(jié)果一致。高溫可以通過影響植物體內(nèi)葉綠素含量間接影響植物光合作用[23]。隨著高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，植物體內(nèi)葉綠素被光解，含量逐漸減少，導(dǎo)致植物的光合作用減弱[24]。本研究中高溫脅迫下藥用蒲公英幼苗Fo上升，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo呈下降趨勢(shì)，這與高溫處理下番茄[25]熒光特性的研究結(jié)果基本一致。ΦPSⅡ用于估計(jì)PSⅡ反應(yīng)中心吸收光量子的比例，可反映光合作用的強(qiáng)弱，本研究中藥用蒲公英幼苗在高溫脅迫6 h，ΦPSⅡ下降，可能是藥用蒲公英持續(xù)6 h高溫后，為抵御高溫?fù)p傷，關(guān)閉部分PSⅡ反應(yīng)中心，致使葉片光合作用能力降低。6~24 h內(nèi)，ΦPSⅡ有輕微上升趨勢(shì)，此時(shí)藥用蒲公英已逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境，之后ΦPSⅡ急劇下降，說明24 h高溫脅迫后，PSⅡ反應(yīng)中心可能被嚴(yán)重破壞，有機(jī)物質(zhì)合成減少，藍(lán)莓[10]在高溫脅迫下也有類似變化。景天屬植物[26]遭受高溫脅迫后，ETR會(huì)下降，與本研究ETR的變化趨勢(shì)一致。

有研究表明[27]，ETR與ΦPSⅡ變化趨勢(shì)一致，但本研究二者沒有一定的關(guān)聯(lián)性，可能是由于藥用蒲公英不同脅迫時(shí)間的光量子通量密度（photon flux density，PPFD）不同導(dǎo)致的差異。植物遭受脅迫時(shí)，其自我保護(hù)機(jī)制會(huì)被激發(fā)[28]。本研究中藥用蒲公英的NPQ在高溫脅迫前期升高，是因?yàn)樗幱闷压⒖梢酝ㄟ^增加熱量散失，保護(hù)光合器官，提升光合能力；脅迫后期NPQ下降是由于藥用蒲公英葉片無法將光能轉(zhuǎn)化的熱能有效散失，使葉片細(xì)胞中細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到熱損傷，冬小麥[29]的NPQ在高溫脅迫中有相似的變化趨勢(shì)；在脅迫12~48 h中，NPQ有較小幅度升高，可能是因?yàn)榻?jīng)過一段時(shí)間的高溫脅迫，藥用蒲公英幼苗具有了一定的耐熱能力，猜測(cè)植物的這種保護(hù)機(jī)制與耐熱性相關(guān)，這與耐熱性杜鵑[30]研究結(jié)果相似。

高溫脅迫會(huì)增加藥用蒲公英脂質(zhì)過氧化程度和氧化損傷程度，積累MDA和增加電導(dǎo)率，藥用蒲公英可以通過提高抗氧化酶活性清除ROS，增強(qiáng)細(xì)胞膜保護(hù)系統(tǒng)，減弱膜脂過氧化；此外，藥用蒲公英會(huì)積累一些有機(jī)分子，如脯氨酸，以保持高滲透壓，并確保其仍能從土壤中吸收水分，提高藥用蒲公英的耐熱性[31]。植物受到非生物脅迫時(shí)，體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)會(huì)發(fā)生明顯變化[32]，體內(nèi)H2O2含量會(huì)不斷積累，本研究中高溫脅迫初期藥用蒲公英葉片POD和CAT活性不斷升高，可能是因?yàn)樗幱闷压Ⅲw內(nèi)H2O2含量不斷增加，出于保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)酶活性呈現(xiàn)出短暫的上升趨勢(shì)，與牧草[33]在高溫逆境和小麥[34]在高溫干旱脅迫下POD和CAT活性變化趨勢(shì)相同。脅迫后期酶活性下降可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的脅迫使藥用蒲公英細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，使得酶的合成途徑受阻[35]。植物體內(nèi)MDA含量的多少和相對(duì)電導(dǎo)率變化可以反映膜系統(tǒng)受損傷程度[36]，本研究MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率變化趨勢(shì)相同，說明二者可共同反映藥用蒲公英膜系統(tǒng)受損狀況。植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量直接反映植物的抗逆能力，脯氨酸可以作為氮源、蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)保護(hù)劑，防止植物水分散失和提高原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性，當(dāng)植物在遭受脅迫時(shí)會(huì)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸的積累來減緩自身所受到的危害，增強(qiáng)植株的抗逆性[37]。本研究中脯氨酸含量在脅迫初期升高，但在高溫脅迫后期，藥用蒲公英脯氨酸含量降低，可能是因?yàn)楦邷孛{迫時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)度大，使藥用蒲公英細(xì)胞被嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致脯氨酸不能正常合成，從而在植物體內(nèi)含量顯著下降，與枇杷果皮[38]高溫脅迫下脯氨酸變化趨勢(shì)一致。

本試驗(yàn)?zāi)壳斑M(jìn)行了藥用蒲公英幼苗高溫脅迫的表型及相關(guān)生理指標(biāo)的檢測(cè)分析，為后續(xù)植物抗性生長(zhǎng)代謝合成相關(guān)基因研究奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)開發(fā)藥用蒲公英抗性品種提供可能。