基于微衛(wèi)星標(biāo)記的山西糜子資源DNA二維碼創(chuàng)建

楊 哲，陳 凌，王海崗，王瑞云，，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）屬禾本科黍?qū)賉1]1年生禾谷類作物，耐瘠薄、早熟和抗旱，原產(chǎn)于我國(guó)，為北方旱地可持續(xù)農(nóng)業(yè)主栽作物[2]。糜子作為最古老的作物之一，已有1萬(wàn)年的耕作歷史[3]。全世界糜子種植面積約600萬(wàn)hm2，在非洲、亞洲中部、東歐和北美等地都有分布[4]。糜子具有很高的能量和蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，與小麥、玉米和水稻相比，富有大量的鐵、鉀、鎂、鈣、鋅、磷、多肽類和人體必需氨基酸，同時(shí)還是黃酒的制作原料，對(duì)糜子研究的深度和廣度日益加強(qiáng)[5]。糜子具有豐厚的抗旱基因，運(yùn)用基因工程手段發(fā)掘和克隆其抗旱基因，可用于改進(jìn)其他農(nóng)作物的遺傳性狀。糜子在干旱脅迫下會(huì)在形態(tài)、生理等方面形成適應(yīng)機(jī)制,抗旱基因在干旱脅迫下表達(dá)受阻，復(fù)水之后表達(dá)量明顯提高[5]。糜子富含對(duì)健康有益的化合物，如卵磷脂對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)起保健作用，可以緩解人體衰老，預(yù)防老齡化疾病的發(fā)生[6]。

全球糜子種質(zhì)資源有20 000多份，我國(guó)目前保存有8 800多份，從分子水平準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其遺傳多樣性，有利于合理開(kāi)發(fā)利用，提高糜子作物的品質(zhì)，促進(jìn)育種工作方面的研究[7]。隨著種質(zhì)資源的不斷采集與引進(jìn)，2003年DNA條形碼首次提出，對(duì)種質(zhì)資源區(qū)別鑒定技術(shù)日趨完善，對(duì)大量的種質(zhì)資源數(shù)字化和網(wǎng)絡(luò)化管理及種質(zhì)間資源的親緣關(guān)系對(duì)比更加快捷方便。陳昌文等[8]篩選來(lái)自桃8條染色體的16對(duì)微衛(wèi)星引物，最終構(gòu)建了237份桃品種資源的分子身份證；趙艷杰等[9]利用40對(duì)微衛(wèi)星引物構(gòu)建了182份東北地區(qū)大豆品種的DNA指紋庫(kù)；高運(yùn)來(lái)等[10]篩選獲得9對(duì)引物，構(gòu)建了黑龍江省83份大豆品種的分子身份證；楊陽(yáng)等[11]用17對(duì)微衛(wèi)星引物構(gòu)建了36個(gè)茶樹(shù)品種的分子身份證；李紅琴等[12]逐級(jí)篩選，最終確定23對(duì)微衛(wèi)星引物，構(gòu)建了青海省66份小麥品種的分子身份證。馬琳等[13]通過(guò)篩選確定7對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記，構(gòu)建了130份甘藍(lán)型油菜品種的分子身份證。

糜子的研究多為糜子育種栽培，基于微衛(wèi)星標(biāo)記的分子身份證少有研究。本研究利用微衛(wèi)星引物篩選技術(shù)對(duì)21份山西糜子種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，構(gòu)建糜子種質(zhì)資源的DNA二維碼，利用糜子種質(zhì)資源的遺傳多樣性與地理環(huán)境分布特征，為優(yōu)異種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)提供技術(shù)支撐，為糜子起源演化和傳播提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試21份糜子種質(zhì)資源（表1），來(lái)源于山西不同糜子生態(tài)栽培區(qū)。

表1 21份糜子試驗(yàn)材料Tab.1 21 broomcorn millet materials tested

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 使用改進(jìn)的CTAB法提取糜子基因組DNA，檢測(cè)其純度、質(zhì)量和濃度后，稀釋10倍。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用BIO-GENER基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：1.6μL dNTPs、7.4μL dd H2O、0.8μL引物（最終濃度為0.4μmol/L）、10μL 2×MasterMix和1μL DNA模板。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增過(guò)程為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，50 s退火，72℃延伸60 s，進(jìn)行36次循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，使用濃度0.1%硝酸銀銀染。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)對(duì)PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取基因組數(shù)據(jù)，有條帶的讀取“1”，無(wú)條帶的讀取“0”，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成不同格式，以適應(yīng)不同軟件計(jì)算試驗(yàn)參數(shù)，利用PowerMarker 3.25和MEGA 5.0等軟件分別計(jì)算引物的PIC及遺傳多樣性參數(shù)。使用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)分析軟件ID Analysis 4.0構(gòu)建DNA分子身份證。輸入相應(yīng)的字符串并使用網(wǎng)絡(luò)中的在線條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）即可生成DNA條形碼分子身份證；將糜子種質(zhì)材料的基本信息與身份證輸入在線二維碼技術(shù)（https://cli.im/）生成DNA二維碼分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

利用21份糜子資源對(duì)四、五、六堿基引物共12對(duì)進(jìn)行篩選，確定多態(tài)性高的引物用于分子身份證的構(gòu)建。表2表明，四堿基重復(fù)多態(tài)性引物重復(fù)系列為：CTAG（6個(gè)）、CGAG（5個(gè)）、GGCC（5個(gè)）、TTGG（6個(gè)）、AGGA（6個(gè)）、CAGC（6個(gè)）、GATG（6個(gè)）共7種，其中，CGAG與GGCC最少。五堿基多態(tài)性引物堿基重復(fù)類型有CCTTT（5個(gè)）、ACACC（5個(gè)）、CGCGC（5個(gè)）、AATAG（5個(gè)），一共有4種（各占25%）。六堿基重復(fù)基序?yàn)門CATCT（6個(gè)），只有1種。有3對(duì)引物與其他引物相似系數(shù)過(guò)高，被剔除，剩余9對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果清晰、穩(wěn)定性好的引物，可作為候選核心引物用于構(gòu)建糜子資源分子身份證。

從表3可以看出，21份材料在9個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出等位變異27個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到3個(gè)；有效等位基因數(shù)介于2.541 2~2.995 9，平均為2.841 2；多樣性指數(shù)介于0.995 8～1.097 9，平均為1.066 1；觀測(cè)雜合度介于0.529 4~0.888 9，平均為0.705 8；期望雜合度介于0.623 8~0.684 2，平均為0.664 6；Nei's期望雜合度（PIC）介于0.606 5~0.666 2，平均為0.646 9；多態(tài)性信息含量介于0.601 0~0.772 0，平均為0.707 6。綜上所述，9個(gè)引物的PIC值都大于0.5，可用于構(gòu)建DNA二維碼。

表2 多態(tài)性微衛(wèi)星引物堿基重復(fù)基序Tab.2 Base repeat motifs of polymorphic microsatellite primers

表3 核苷酸重復(fù)性遺傳參數(shù)Tab.3 Genetic parameters of nucleotide repeatability

2.2 糜子資源DNA條形碼與二維碼構(gòu)建

將21份糜子種質(zhì)的字符串導(dǎo)入到條形碼生成器中，得到DNA條形碼。將糜子種質(zhì)的名稱、統(tǒng)一編號(hào)、來(lái)源和身份證號(hào)信息輸入在線二維碼生成器得到DNA二維碼（圖1）。

3 結(jié)論與討論

3.1 分子標(biāo)記的選擇

隨著糜子作物全基因組測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展，構(gòu)建覆蓋全基因組的高通量、易操作、高精度的DNA分子身份證已成為迫切需要解決的問(wèn)題。DNA分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重現(xiàn)性好、共顯性且覆蓋整個(gè)基因組等特點(diǎn)[14]。分子標(biāo)記經(jīng)歷了3個(gè)階段：（1）基于雜交的標(biāo)記（RFLP）；（2）基于PCR的標(biāo)記（RAPD、ISSR和微衛(wèi)星等）；（3）基于單核苷酸的標(biāo)記（SNP）[15]。近年來(lái)，分子輔助標(biāo)記在物種鑒定上廣泛應(yīng)用。在BMT測(cè)試指南草案中，國(guó)際植物種類保護(hù)聯(lián)盟把構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記確定為微衛(wèi)星和SNP[15]。苑克俊等[16]利用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建杏系的分子身份證，對(duì)杏種質(zhì)的保護(hù)提供參考。樊曉靜等[17]利用SNP標(biāo)記建立茶樹(shù)品種的分子數(shù)據(jù)庫(kù)，為茶樹(shù)品種資源保護(hù)鑒定提供思路。本試驗(yàn)基于糜子全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，分子標(biāo)記方法同王瑞云等[18]和苑克俊等[16]，利用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建糜子品種資源的DNA二維碼。相比較RFLP標(biāo)記需要同位素標(biāo)記、一定數(shù)量的探針；RAPD等標(biāo)記對(duì)試驗(yàn)條件的嚴(yán)格要求；SNP高額的昂貴的試驗(yàn)器材與試劑費(fèi)用，微衛(wèi)星標(biāo)記只需預(yù)先設(shè)計(jì)引物，且檢測(cè)效果好，合成成本低。本研究基于9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建21份糜子資源DNA二維碼，有利于品種資源的有效鑒別、區(qū)分。

3.2 DNA指紋圖譜與分子身份證編碼區(qū)別

DNA指紋圖譜是構(gòu)建種質(zhì)資源身份證的基礎(chǔ)，分子身份證與DNA圖譜功能相同。DNA圖譜可以區(qū)分作物個(gè)體間差異，而分子身份證可以實(shí)現(xiàn)DNA指紋數(shù)字化，使種質(zhì)資源的檢索容易快捷[19]。與DNA圖譜相比較，分子身份證檢測(cè)更靈敏。目前，用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建分子身份證的編碼采用3種措施：（1）根據(jù)微衛(wèi)星指紋圖譜，用0和1表示某個(gè)等位基因擴(kuò)增DNA條帶的存在有無(wú)，并將微衛(wèi)星指紋圖譜轉(zhuǎn)換為由0和1組成的字符串，即種質(zhì)資源的分子身份證[20]。（2）等位基因賦值編碼類型，每對(duì)引物擴(kuò)增的基因從小到大依次編碼，當(dāng)有2個(gè)等位基因時(shí)，選擇堿基數(shù)較少的一個(gè)[20]。（3）基因型賦值編碼類型，將獲得的一系列帶型用單個(gè)數(shù)字進(jìn)行編碼，依照固定引物串聯(lián)各帶型編碼，形成一組數(shù)據(jù)，即種質(zhì)資源的分子身份證[21]。本研究采用的第1類措施編碼，該措施統(tǒng)計(jì)方便，書寫簡(jiǎn)潔和字符串長(zhǎng)短適中且易于檢索。

3.3 遺傳多樣性分析

隨著微衛(wèi)星分子標(biāo)記的深入研究，其廣泛應(yīng)用為作物的遺傳多樣性評(píng)估提供了重要的分子檢測(cè)工具。劉笑瑜等[22]利用6對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)我國(guó)糜子種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行研究，多樣性指數(shù)（I）值為0.542 6和PIC值為0.340 3。董俊麗等[23]對(duì)國(guó)內(nèi)外的96份糜子資源進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記評(píng)估，共檢測(cè)出128個(gè)等位基因數(shù)，平均每個(gè)位點(diǎn)5.82個(gè)，I值為0.409 7，PIC值為0.392 0。王瑞云等[18]利用15個(gè)特異性微衛(wèi)星對(duì)不同生態(tài)區(qū)的132份糜子資源進(jìn)行遺傳多樣性的評(píng)價(jià)，共檢測(cè)到107個(gè)等位變異基因，平均各位點(diǎn)7個(gè)，I值和PIC值分別為0.529 8和0.486 4；寇淑君等[24]用22對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)131份糜子材料進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)，共檢測(cè)到128個(gè)等位變異基因，平均每個(gè)位點(diǎn)5.82個(gè)，檢測(cè)到I值為0.628 4，PIC值為0.587 4。本試驗(yàn)采用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均遺傳多樣性指數(shù)和PIC值分別為1.066 1和0.707 6，期望雜合度平均值為0.664 6，觀測(cè)雜合度平均值為0.705 8，說(shuō)明糜子遺傳多樣性較高，均高于以往研究結(jié)果[18，22-24]，這與試驗(yàn)材料的來(lái)源有關(guān)或與高基元引物較低、基元引物檢測(cè)精度高有關(guān)，與試驗(yàn)材料的來(lái)源有關(guān)。雜合度反映的是群體內(nèi)遺傳變異程度，觀測(cè)雜合度與陳小紅等[25]、王舒婷等[26]觀測(cè)雜合度相差不大，說(shuō)明育種后代的親緣關(guān)系密切。等位基因數(shù)范圍無(wú)較大差異，但與王瑞云等[18]、董俊麗等[23]和寇淑君等[24]的觀測(cè)等位基因數(shù)相差較大，說(shuō)明等位基因數(shù)的多少與引物多態(tài)性和樣品地理位置有關(guān)。