北方春糜子區(qū)糜子種質(zhì)分子身份證的創(chuàng)建

王宇卓，王 柳，陳 凌，王海崗，王瑞云，，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）屬禾本科黍?qū)伲歉珊岛桶敫珊档鹊貐^(qū)的重要的糧食作物之一，也是我國種植歷史悠久的栽培作物之一[1-4]。在禾谷類作物中，粟類作物是除水稻、小麥、玉米、大麥、高粱外的第六大作物，養(yǎng)育著全世界1/3以上的人口[5]。全球糜子種質(zhì)資源有20 000余份，我國有9 885份[6]。連帥等[7]對糜子的起源地相關(guān)研究表明，我國的蒙古高原地區(qū)、東北地區(qū)和黃土高原地區(qū)的糜子遺傳相關(guān)性大，遺傳多樣性最豐富，闡明了我國是糜子作物的起源中心。我國也是糜子的主產(chǎn)國，目前主要種植在我國東北、華北、西北等干旱少雨地區(qū)[8]。糜子利用其發(fā)達(dá)的根系從深層土壤中吸收水分，通過莖和葉片上的絨毛和蠟質(zhì)層減少水分的蒸發(fā)，充分運(yùn)用有限的水熱資源，避開旱季，短時間內(nèi)完成并獲得一定的產(chǎn)量。它能夠適應(yīng)各種不同的土壤，對貧瘠的土壤也有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，且耐干旱、耐鹽堿，是荒漠地區(qū)的有力栽培作物之一[9-12]。由于其生育期短，也是重大災(zāi)后生態(tài)恢復(fù)的補(bǔ)救作物之一[13]。糜子營養(yǎng)豐富，籽粒中富含鈣、鐵、磷、鉀、鎂、鋅以及人體必需氨基酸等，有明目安神、益陰利肺的功效。糜子在藥用和食用領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，可以加強(qiáng)腦細(xì)胞新陳代謝、恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞功能、促進(jìn)人體纖維再生、減緩人體衰老，也對脾胃虛弱、胃痛腹瀉、肥胖癥和心血管病等有一定的預(yù)防及治療作用，可以有效避免老年性疾病的發(fā)生[14-16]。

我國糜子種質(zhì)資源庫9 885份資源中有8 515份收集于1957—2003年（98%來自我國，2%來自其他14個國家）。此外，地方品種和育成品種分別占99.4%和0.6%，擁有這些種質(zhì)資源，對于深入研究糜子具有十分重要的意義[6]。但由于新資源的不斷收集和引進(jìn)，種質(zhì)交流日趨頻繁，農(nóng)作物新品種的誕生也在日益發(fā)展，導(dǎo)致農(nóng)家種、育成品種、地方品種及野生品種間同名異物和同物異名現(xiàn)象大量出現(xiàn)，影響了資源的收集整理效率，因此，尋找便捷分類記名的方法成為亟待解決的問題[17]。迄今，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，條形碼和二維碼成為大數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)時代標(biāo)記商品的便捷方式。相較于傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法，DNA條形碼不受表型和發(fā)育時期的影響，通用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，操作標(biāo)準(zhǔn)化[18]。二維碼技術(shù)有效容納數(shù)字、字母、文字、圖片等信息，可以被手機(jī)、電腦等電子設(shè)備全方位快速識別，使用范圍廣[19]。將條形碼及二維碼引入糜子資源管理，編輯糜子資源信息，使其擁有特定的數(shù)字代碼，有助于保護(hù)種質(zhì)資源知識產(chǎn)權(quán)[20-21]。2014年，吳勁松等[22]利用3條候選序列對白及屬藥用植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序以及序列分析，最終確定2種候選條形碼可以作為鑒定白及屬的DNA條形碼。2015年，莫文娟[23]選取8個DNA片段提取泡桐屬51份材料的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物直接測序，結(jié)果表明，有4個序列變異位點(diǎn)較多，可用于泡桐屬的分類研究。2021年，李井干等[24]以龍樹科的21份植物為材料，選用3條DNA條形碼片段對其進(jìn)行親緣關(guān)系分析和分類鑒定，可將其進(jìn)行明確的系統(tǒng)分類。2014年，陸徐忠等[25]以127份安徽水稻品種為試驗(yàn)材料，基于12對SSR熒光核心引物，結(jié)合品種商品信息構(gòu)建了分子身份證。2020年，侯麗媛等[26]以蘋果新品種赤霞為試驗(yàn)材料，從16對熒光SSR引物中篩選出7對，構(gòu)建了20個栽培品種的分子身份證。2021年，樊曉靜等[27]以103份茶樹品種為供試材料，篩選出24個SNP位點(diǎn)，結(jié)合品種信息構(gòu)建了分子身份證。糜子資源豐富，迄今分子身份證構(gòu)建方面的報道極少。

本研究選取北方春糜子區(qū)的糜子種質(zhì)共21份為材料，擬利用14對高基元引物構(gòu)建21份資源的分子身份證，為糜子資源的高效管理和合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料共21份糜子資源，均來源于北方糜子區(qū)，包括山西大同（15份）、忻州（2份）和朔州（4份）（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和檢測 剪取三葉期糜子葉片，采用改良CTAB法[28]提取基因組DNA。利用Nano-drop ND-1000核酸濃度檢測儀檢測DNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性[5]。

表1 21份糜子試驗(yàn)材料Tab.1 21 broomcorn millet accessions

1.2.2 引物篩選、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 用14對高基元引物（表2）擴(kuò)增地理來源差異較大的21份糜子資源，篩選條帶清晰、擴(kuò)增穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物用于構(gòu)建分子身份證。20μL PCR體系含10μL 2×MasterMix（中科瑞泰2×Taq PCR Mas-terMix含染料）、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物、7.4μL dd H2O和1μL DNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4 min；94℃40 s，退火40 s，72℃1 min，36個循環(huán)；72℃8 min[17]。用14對引物擴(kuò)增糜子試驗(yàn)材料，如表2所示，14對引物的四堿基重復(fù)基元為：GGCC（1個）、CGGA（1個）、GGAA（1個）、AGGA（1個）、GCAG（1個）、TTTC（1個）、AGCG（1個）、TCCT（1個）、CAGC（1個）、GATG（1個）、GGAG（2個）、GCCT（1個）、TATC（1個）共13種，其中，GGAG數(shù)量較多。

表2 SSR引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of SSR primers and annealing temperature

1.3 分子身份證構(gòu)建

根據(jù)電泳圖片所示，將同一位置有擴(kuò)增條帶的記為1，否則記為0。利用PowerMarker 3.25和PopGen 1.32軟件計算多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC），利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)的資源特征分析軟件ID Analysis 4.0建立字符串分子身份證。利用在線條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）將對應(yīng)字符串生成可掃描的條形碼DNA分子身份證，再利用在線二維碼生成器（https://cli.im/）生成二維碼DNA分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

對14對高基元引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中有6對引物與其他引物相似系數(shù)過高，被剔除，剩余8對引物擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物（表3），可作為候選核心引物用于構(gòu)建糜子資源分子身份證。

表3 8個SSR的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of the 8 SSR markers

2.2 引物多態(tài)性及遺傳參數(shù)分析

利用8對引物對21份糜子資源進(jìn)行擴(kuò)增，由表3可知，21份材料在8個位點(diǎn)共檢測出24個觀測等位變異，每一個位點(diǎn)均檢出3個（平均3.000 0）；檢出有效等位變異（Ne）為2.484 5~2.971 2，均值為2.596 2；Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.987 7~1.093 7，均值為1.000 1；觀測雜合度（Ho）為0.526 3~0.833 3，均值為0.759 2；期望觀測雜合度（He）為0.612 1~0.681 4，均值為0.625 8；Nei's基因多樣性指數(shù)（Nei）為0.597 5~0.663 4，均值為0.609 5；多態(tài)性信息含量（PIC）為0.593 3~0.760 8，均值為0.620 3。8對引物均具有高度多態(tài)性（PIC＞0.5），可用于后續(xù)分子條形碼及二維碼的構(gòu)建。

2.3 糜子種質(zhì)的分子ID（條形碼與二維碼）的構(gòu)建

21份糜子資源的字符串分子身份證如表4所示。

表4 21份糜子資源的字符串分子身份證Tab.4 Character string molecular ID cards of 21 broomcorn millet accessions

利用ID Analysis 4.0軟件檢測14對引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其他引物相似系數(shù)過高的引物有6對（RYW2、RYW3、RYW4、RYW7、RYW13和RYW14），因此將其剔除。利用剩余的8對引物組合（RYW9、RYW10、RYW8、RYW12、RYW6、RYW5、RYW11和RYW1）可將全部糜子材料區(qū)分，進(jìn)而構(gòu)建了21份材料的字符串DNA分子身份證（表4）。

根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的數(shù)據(jù)，有條帶讀“1”，無條帶讀“0”。以表4中材料1為例，其字符串DNA分子身份證為11101011，表示在上述引物順序下，材料1在引物RYW9、RYW10、RYW8下均顯示有條帶，在引物RYW12下顯示無條帶，依次類推，到引物RYW1顯示有條帶。將各糜子字符串DNA分子身份證輸入條形碼生成器中，生成條形碼DNA分子身份證，將各糜子的名稱、統(tǒng)一編號、生態(tài)區(qū)、來源、身份證號、備注等信息輸入在線二維碼生成器中可得到21份糜子材料的二維碼身份證（圖1）。

3 結(jié)論與討論

近年來，對糜子的遺傳多樣性研究較多。連帥等[7]對不同地區(qū)的糜子地方品種和野生資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。劉敏軒等[29]研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)野生資源的遺傳多樣性高于國外。王璐琳等[30]利用6份地域差異顯著的糜子對70個SSR標(biāo)記進(jìn)行多樣性篩選，共篩選出17個具有多態(tài)性的位點(diǎn)，為進(jìn)行遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。2017年，王瑞云等[31]利用85個高基元SSR檢測96份糜子資源，其基因多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量分別為0.770 8和0.472 3，均低于本研究結(jié)果，這與研究材料以及樣本數(shù)量差異有關(guān)。張梟等[32]對沈陽山楂圃內(nèi)保存的48份國家種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，其中多樣性指數(shù)為0.582，多態(tài)性信息含量為0.447，均低于本研究，這與試驗(yàn)SSR和作物有關(guān)。

DNA指紋圖譜存在譜帶多、人工對比費(fèi)時費(fèi)力、統(tǒng)計分析繁瑣等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)批量鑒定[33-34]。而DNA分子身份證是在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，采用不同的編碼方式對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理獲得字符串，再將字符串轉(zhuǎn)換成條形碼對內(nèi)容進(jìn)行表述，此方法高效準(zhǔn)確，已廣泛用于種質(zhì)資源鑒定[35]。高源等[36]對部分蘋果種質(zhì)資源進(jìn)行了分子身份證的構(gòu)建。目前利用SSR標(biāo)記構(gòu)建品種分子身份證有3種編碼方法：第1種是0/1代碼類型，此方法是根據(jù)電泳條帶的有無賦值1或0，形成0/1字符串[37]；第2種是等位基因賦值編碼類型，編碼擴(kuò)增的等位基因[38]；第3種是基因型賦值編碼類型，編碼擴(kuò)增帶型[39]。本試驗(yàn)采用第1種方法，獲得的字符串長度適中，方便檢索。

目前SSR標(biāo)記的檢測方法有2種，分別是PAGE銀染法和熒光毛細(xì)管電泳法，楊文娟等[40]用上述2種方法檢測了131份應(yīng)用核心種質(zhì)，比較分析后發(fā)現(xiàn)對于多態(tài)性帶較少、條帶間分子量差異大及擴(kuò)增帶型清晰的引物，PAGE銀染法獲得的數(shù)據(jù)和毛細(xì)管電泳結(jié)果基本吻合。此外，還有許多研究人員對此進(jìn)行了研究，試驗(yàn)結(jié)果均對PAGE法表示肯定。此外，常規(guī)的變性PAGE銀染檢測法不需要昂貴的試驗(yàn)儀器且試劑成本低廉，適用于分析少量材料。普通引物能夠保存3~5 a，而熒光標(biāo)記的引物只能保存1~2 a，因此，后者的合成成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。因此，在擁有可靠的引物質(zhì)量、較少試驗(yàn)材料以及經(jīng)濟(jì)條件有限等前提下，采用PAGE銀染法來構(gòu)建DNA分子身份證是可行的。本試驗(yàn)采用的SSR分子標(biāo)記技術(shù)，重復(fù)基因短，對DNA要求不高，有豐富的多態(tài)性，且重復(fù)性優(yōu)良，被廣泛應(yīng)用于對群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的分析和遺傳圖譜的構(gòu)建[41]。此外，在基因定位[42]、檢測種子純度[43]、品種鑒定[44]、研究親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[45]等方面也有廣泛的應(yīng)用。

以往研究多使用低基元SSR構(gòu)建資源的分子身份證。2016年，張嘉等[46]從111對引物中篩選出了29對（二、三堿基分別為28、1對）SSR核心引物，最終利用4對二堿基引物構(gòu)建了66個我國芍藥的分子身份證。2021年，郭艷春等[19]把高、低基元引物相結(jié)合構(gòu)建分子身份證，利用12對熒光SSR引物組合（單、二、三、四、五堿基分別為1、4、4、1、2對）構(gòu)建了61份黃麻（Corchorus capsularisL.）核心種質(zhì)的分子身份證。同年，張梟等[32]利用14對分子標(biāo)記，在SSR指紋圖譜的基礎(chǔ)上形成每份山楂資源的條形碼即分子身份證，以區(qū)分48份山楂材料。

本試驗(yàn)對21份來源于北方春糜子生態(tài)區(qū)的糜子材料用14對高基元SSR引物擴(kuò)增，從中篩選出8對核心引物，可以擴(kuò)增出凝膠電泳條帶，在基于DNA指紋圖譜的基因型上構(gòu)建分子身份證號，能被機(jī)器準(zhǔn)確快速識別的21份DNA條形碼和二維碼，實(shí)現(xiàn)糜子資源管理的科學(xué)化和規(guī)范化。