一株豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及其對(duì)不同動(dòng)物的致病性

林 鷙,趙本進(jìn),何錫忠,朱永軍,彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106)

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一種急性傳染病,又稱Aujeszky氏病、傳染性球麻痹或狂瘙癢癥。該病的主要臨床癥狀為發(fā)熱、奇癢、急性腦脊髓炎和繁殖障礙等[1-2]。豬是PRV唯一的自然宿主和儲(chǔ)存宿主,生長(zhǎng)在不同時(shí)期的豬均可感染PRV。新生仔豬與保育豬感染PRV可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂,表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、腹瀉及共濟(jì)失調(diào)等,死亡率高;育肥豬感染PRV呈現(xiàn)呼吸道癥狀等,表現(xiàn)為發(fā)熱、精神沉郁、嘔吐、咳嗽等;懷孕母豬感染PRV可造成妊娠母豬流產(chǎn),產(chǎn)死胎或木乃伊胎,給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

TK和gE基因是PRV最主要的毒力決定因子,TK基因編碼蛋白對(duì)PRV毒力的影響最大;gE基因與其他基因通過形成一個(gè)統(tǒng)一體,發(fā)揮其毒力作用;gI基因編碼蛋白既可在細(xì)胞水平發(fā)揮其毒力作用,又可促進(jìn)PRV在神經(jīng)系統(tǒng)中的增殖,從而影響其神經(jīng)嗜性[4-8];gD基因則是PRV吸附細(xì)胞的關(guān)鍵性基因[9-11]。

本研究從某疑似偽狂犬病發(fā)病豬場(chǎng)采集病料進(jìn)行PRV變異毒株的分離及鑒定,對(duì)分離毒株的gG、gE和TK基因進(jìn)行克隆測(cè)序,并對(duì)小鼠、兔子及仔豬進(jìn)行致病性試驗(yàn),以期為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豬睪丸(STHN)細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。體重1.5—2.0 kg的成年健康家兔及20 g左右的小鼠購自上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。PRV gB和gE抗體陰性仔豬來源于江蘇某豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

DMEM、胰酶均購于美國GIBCO公司;新生犢牛血清購自上海賽達(dá)生物藥業(yè)股份有限公司;DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中PRV序列(KP257591.1),設(shè)計(jì)針對(duì)PRV gE、gG和TK基因的引物。gE-F:5’-GCCTGCCACCCGGACCTGGT-3’,gE-R:5’-CACGTACAGCCCCGACTCGTCC-3’;gG-F:5’-TTTGATCCCGTCCGCCGCCCTTC-3’,gG-R:5’-CCCGGTAAGCAAGGCCGTAC-3’;TK-F:5’-GGAAGCGCGCCGGGATGCG-3’,TK-R:5’-CGGGTGGGAGGGGCGAGGGT-3’。

1.4 病料來源與預(yù)處理

可疑病料來自山西某發(fā)病豬場(chǎng)病豬。采用無菌方式取病豬腦部組織,將其與PBS(0.1 mol/L,pH 7.2)以體積比1∶5制成勻漿;反復(fù)凍融3次,5 000 r/min離心15 min,取上清液加雙抗作用,經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的分離與純化

1.5.1 病毒的分離

將處理好的豬腦病料濾液接種于長(zhǎng)成單層的STHN細(xì)胞,接種3瓶,同時(shí)設(shè)PBS作為陰性對(duì)照,37℃吸附30 min后加細(xì)胞維持液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變,待80%的細(xì)胞病變后,將細(xì)胞凍融3次,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 蝕斑純化

將凍融好的病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋,取1∶1×105、1∶1×106、1∶1×107病毒稀釋液分別接種于長(zhǎng)成單層的12孔STHN細(xì)胞板,37℃吸附30 min,將高壓滅菌好的低熔點(diǎn)瓊脂糖和2×DMEM以體積比1∶1混合后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中并覆蓋在細(xì)胞表面,凝固后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),每日觀察,待出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)用中性紅染色挑取蝕斑于DMEM培養(yǎng)液中,凍融3次,再次接種STHN細(xì)胞板中,反復(fù)操作4次后,獲得純化的病毒。將經(jīng)4次純化后獲得的第5代病毒記為T0代。

1.5.3 病毒的傳代

將純化好的病毒(T0代)接種于長(zhǎng)成單層的STHN細(xì)胞瓶(25 cm2)中,每瓶接種1 mL,同時(shí)設(shè)DMEM作為陰性對(duì)照,37℃吸附30 min后加細(xì)胞維持液9 mL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變,待80%的細(xì)胞病變后,將細(xì)胞凍融3次,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR鑒定

將病毒接種于STHN細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收集細(xì)胞,用常規(guī)方法提取病毒DNA,用TE溶液溶解沉淀,分裝備用-70℃凍存。使用寶生物工程(大連)有限公司的PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL):Prime STAR?HSDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25μL;5×Prime STAR Buffer(Mg2+plus)5μL;dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2μL;上游引物(10μmol/L)0.5μL;下游引物(10μmol/L)0.5μL;DNA模板1μL;雙蒸水15.75μL。

不同的基因片段按照不同的反應(yīng)程序進(jìn)行,擴(kuò)增gG基因的反應(yīng)條件:98℃,8 min;98℃,20 s,64℃,20 s,72℃,2 min,30個(gè)循環(huán);72℃,7 min。擴(kuò)增gE基因的反應(yīng)條件:98℃,5 min;98℃,30 s,57℃,20 s,72℃,2 min,30個(gè)循環(huán);72℃,10 min。擴(kuò)增TK基因的反應(yīng)條件:98℃,8 min;98℃,20 s,60℃,20 s,72℃,1 min,30個(gè)循環(huán);72℃,7 min。取PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳鑒定,PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并與國內(nèi)外毒株進(jìn)行序列比對(duì)。

1.7 病毒的電鏡鑒定

將毒株反復(fù)凍融3次,3 000 r/min離心30 min,加入PRV陽性血清,置于37℃作用30 min,10 000 r/min離心60 min,棄上清液,將沉淀用三蒸水稀釋到原來的濃度。反復(fù)3次離心,最后一次的沉淀用1滴蒸餾水稀釋,制備銅網(wǎng),用pH 6.2的2%磷鎢酸負(fù)染,于電鏡下觀察。

1.8 毒價(jià)的測(cè)定

將STHN細(xì)胞培養(yǎng)于96孔細(xì)胞板上,待細(xì)胞生長(zhǎng)成單層。第5代病毒作10倍系列稀釋(10-1—10-10),每個(gè)稀釋度接種8孔,每孔0.1 mL,對(duì)照細(xì)胞添加0.1 mL維持液。記錄各個(gè)梯度的病變數(shù),連續(xù)觀察7 d,計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.9 對(duì)不同動(dòng)物的致病性

1.9.1 對(duì)家兔的致病性

用105.0TCID50/mL病毒液于腹部皮下注射成年健康家兔5只,劑量1 mL/只;以腹部皮下注射DMEM維持液的家兔2只作為對(duì)照,劑量1 mL/只,每天觀察動(dòng)物的臨床反應(yīng)。

1.9.2 對(duì)小鼠的致病性

用105.0TCID50/mL病毒液于皮下多點(diǎn)位注射小鼠10只,劑量1 mL/只,以皮下多點(diǎn)接種PBS的10只小鼠作為對(duì)照,每天觀察動(dòng)物的臨床反應(yīng)。

1.9.3 對(duì)仔豬的致病性

用104.0TCID50/mL病毒液滴鼻5頭仔豬,劑量1 mL/頭,以滴鼻1 mL PBS的5頭仔豬作為對(duì)照,每天觀察動(dòng)物的臨床反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

病料濾液接種STHN細(xì)胞后,細(xì)胞于20—24 h逐漸收縮變圓,折光性增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)形成空泡、脫落,有的細(xì)胞發(fā)生融合,形成巨細(xì)胞(圖1)。

圖1 感染PRV的ST細(xì)胞病理變化Fig.1 Pathological changes of ST cells infected PRV

2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分別可見約1 700 bp(A)、1 750 bp(B)以及1 000 bp(C)的條帶,與預(yù)期的PRV gG基因、gE基因、TK基因片段大小相符(圖2)。

圖2 PRV gG、gE、TK基因的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.2 PCR amplification and identification results of PRV gG,gE and TK

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)后顯示,gE基因全長(zhǎng)1 740 bp,與國內(nèi)流行的變異毒株HeN1株、JS2012株、TJ株、GD株的同源性為99.7%—99.9%,與國內(nèi)經(jīng)典毒株Ea株的同源性為99.3%,與國外毒株Kaplan株、Becker株以及Kolchis株的同源性為97.2%—97.4%。gG基因包含1 500 bp的編碼區(qū),與國內(nèi)流行的變異毒株的同源性為99.9%—100%,與經(jīng)典毒株Ea株的同源性為99.9%,與國外毒株的同源性為99%—99.9%。TK基因序列包含963 bp的編碼區(qū),與國內(nèi)流行強(qiáng)毒株的同源性為100%,與國內(nèi)外其他經(jīng)典毒株的同源性為99.4%—99.7%。同源性比對(duì)結(jié)果表明,分離得到的毒株為國內(nèi)流行的變異毒株。

2.3 電鏡鑒定

病毒培養(yǎng)物在電鏡中可見到在胞漿內(nèi)有直徑為155 nm左右的圓形帶囊膜的較大病毒;而在細(xì)胞核內(nèi)無囊膜的病毒粒子直徑約為120 nm左右(圖3)。

圖3 病毒粒子的電鏡觀察Fig.3 Electron microscopic observation of virus

2.4 毒價(jià)測(cè)定

將病毒倍比稀釋后接種至96孔細(xì)胞板中,觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞病變數(shù)量,按照Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)為108.0TCID50/mL。

2.5 對(duì)不同動(dòng)物的致病性試驗(yàn)

2.5.1 家兔致病性試驗(yàn)結(jié)果

用105.0TCID50/mL病毒液接種家兔5只,接種兔子于24 h后體溫升高,最高可達(dá)43℃,并開始腹瀉,注射后36 h開始表現(xiàn)不安,接種部位出現(xiàn)典型的奇癢癥狀,頻頻用嘴啃咬或用后爪抓注射部位,接種部位被毛脫落,皮膚撕破并出血,呈現(xiàn)血性炎癥癥狀,隨后角弓反張,于52 h左右死亡。對(duì)照組兔子無任何癥狀,觀察7 d后仍健活。死亡兔剖檢可見肺淤血,氣管環(huán)充血、出血,肝淤血腫大,胃黏膜脫落,有的胃底穿孔,腦膜充血、出血,腎臟點(diǎn)狀出血。

2.5.2 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

用105.0TCID50/mL病毒液接種10只小鼠,接種后24 h小鼠接種部位開始出現(xiàn)典型的奇癢癥狀,用嘴啃咬或者用后爪抓注射部位,接種部位被毛脫落,皮膚出血,隨后四肢麻痹,于72 h左右全部死亡。對(duì)照組小鼠無任何癥狀,觀察10 d后仍健活。

2.5.3 仔豬致病性試驗(yàn)結(jié)果

用104.0TCID50/mL病毒液接種5頭仔豬后,接種后5頭仔豬體溫均升高至41℃以上,食欲減退、消瘦,其中2頭出現(xiàn)拉稀及打顫或轉(zhuǎn)圈等不良神經(jīng)癥狀,最后死亡;其他3頭出現(xiàn)拉稀等臨床癥狀,觀察至14 d無死亡。對(duì)照仔豬觀察14 d體溫正常,無食欲減退、消瘦及不良神經(jīng)癥狀。

3 討論

趙勝杰等[12]研究表明:2017—2019年河南省PRV gE抗體個(gè)體陽性率為27.89%,場(chǎng)群陽性率為53.51%;其中2018年感染率較高;冬季和春季感染率較高。寧慧波等[13]研究表明:2014—2019年華北地區(qū)豬場(chǎng)gE抗體陽性率呈先上升后下降趨勢(shì),其中2016年gE抗體陽性率高達(dá)85.48%;2019年gE抗體陽性率最低,為62.96%。張曉陽[14]對(duì)2018年山東省各地區(qū)不同豬群PRV的gE抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果顯示gE抗體陽性率為45%,并從疑似病例中分離到變異強(qiáng)毒株?？梢?目前我國各地PRV野毒感染比較普遍,豬偽狂犬病流行形式依然嚴(yán)峻。

本研究取臨床疑似豬偽狂犬病發(fā)病仔豬的腦組織,用豬睪丸細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)、蝕斑純化后獲得純病毒,并對(duì)其進(jìn)行鑒定,PCR結(jié)果顯示:可擴(kuò)增出PRV gG基因、gE基因、TK基因片段,大小與預(yù)期結(jié)果相符。分離毒的毒價(jià)高,在制備疫苗時(shí)可以提高疫苗的免疫效果。病毒可被PRV陽性血清中和,而不被其他血清中和,說明分離毒具有較高的特異性。本研究分離的病毒致病性強(qiáng),接種后家兔于52 h左右全部死亡,72 h左右小鼠全部死亡,28日齡仔豬發(fā)病或死亡。

PRV在長(zhǎng)期流行過程中毒株通過缺失、突變及重組等多種機(jī)制發(fā)生變異,基因組序列發(fā)生改變形成新的毒株。變異后的毒株其免疫原性及致病性等均可能發(fā)生變化,有的可能毒力增強(qiáng),有的可能毒力減弱,通過對(duì)致病性的研究可為PRV的防控提供依據(jù)。