不同穩(wěn)定劑修飾的槲皮素納米晶在大鼠體內(nèi)注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究

胡 菲，車(chē)智慧，王 哲，李方琴，閆 巧，沈成英，申寶德，袁海龍*

? 藥理與臨床?

不同穩(wěn)定劑修飾的槲皮素納米晶在大鼠體內(nèi)注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究

胡 菲1, 2，車(chē)智慧2，王 哲2，李方琴1, 2，閆 巧2，沈成英3，申寶德1*，袁海龍2*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2.空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部，北京 100142 3.江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，江西南昌 330004

以普朗尼克F68（F68）、普朗尼克F127（F127）、甘草酸（glycyrrhizinic acid，GL）、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）為穩(wěn)定劑制備槲皮素納米晶（quercetin nanocrystals，QT-NCs），探討不同穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)QT-NCs注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布的影響。采用HPLC法測(cè)定大鼠血漿和組織中的槲皮素質(zhì)量濃度，并用DAS 2.0軟件計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，進(jìn)行比較。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，AUC0～t呈如下順序：QT-NCs/GL[（464.87±100.51）mg·L/h]＞QT-NCs/TPGS[（339.82±73.82）mg·L/h]＞QT-NCs/F68[（293.00±44.72）mg·L/h]＞QT-NCs/F127[（245.01±28.72）mg·L/h]。組織分布研究結(jié)果顯示，不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs具有不同的組織分布行為，肝臟的AUC0～t順序與血漿AUC0～t一致。此外，QT-NCs/GL在肝、脾、肺的分布最高（＜0.01）。穩(wěn)定劑種類(lèi)可以影響QT-NCs的注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布。

槲皮素；納米晶；穩(wěn)定劑；藥動(dòng)學(xué)；組織分布

近年來(lái)，納米晶（nanocrystals，NCs）作為克服難溶性藥物及天然產(chǎn)物生物利用度低下問(wèn)題的主要方法之一受到廣泛關(guān)注。NCs是由少量穩(wěn)定劑（表面活性劑和/或聚合物）穩(wěn)定的純藥物結(jié)晶納米粒，平均粒徑小于1000 nm，通常為200～500 nm[1]。由于較小的粒徑與較大的比表面積，NCs在改善難溶性藥物溶出，提高生物利用度方面優(yōu)勢(shì)突出[2-4]，具有載藥量高、毒副作用小、制備工藝簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。NCs早期主要用于改善難溶性藥物的口服生物利用度[7]，目前已拓展至注射、經(jīng)皮、肺部、眼部等多種給藥途徑[8]，尤其注射給藥應(yīng)用廣泛[9-10]。

NCs處方中的穩(wěn)定劑用量雖然少，但對(duì)于維持NCs的物理穩(wěn)定至關(guān)重要。在NCs的制備過(guò)程中，穩(wěn)定劑可吸附在納米粒表面，通過(guò)靜電排斥和/或空間位阻作用防止納米粒的聚集與團(tuán)聚，從而維持NCs的穩(wěn)定[11-12]?；贜Cs的粒徑大小及物理穩(wěn)定性篩選合適的穩(wěn)定劑制備難溶性藥物納米晶一直是納米晶開(kāi)發(fā)與研究的熱點(diǎn)之一。然而，一些穩(wěn)定劑不僅能夠維持NCs的穩(wěn)定，還可以通過(guò)與細(xì)胞相互作用而影響藥物的吸收分布行為[13-16]。具有P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抑制作用的普朗尼克、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）和具有較好生物膜黏附作用的羥丙甲纖維素可通過(guò)抑制藥物的外排或增加藥物的腸道滯留而促進(jìn)藥物的吸收[12,17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，這些穩(wěn)定劑對(duì)難溶性藥物槲皮素納米晶（quercetin-nanocrystals，QT-NCs）的體外溶出和口服吸收也有影響[18]。

鑒于NCs在注射給藥方面的廣泛應(yīng)用，本研究在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)QT-NCs注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布的影響。分別以普朗尼克F68（F68）、普朗尼克F127（F127）、甘草酸（glycyrrhizinic acid，GL）、TPGS為穩(wěn)定劑制備相同粒徑的QT-NCs，SD大鼠尾iv給藥后測(cè)定血漿和各臟器組織（心、肝、脾、肺、腎）中QT的濃度，研究穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)QT-NCs注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布的影響。

1 儀器與材料

LC-20AD型高效液相色譜儀（含LC-20AD二元梯度泵、DGU-20A3脫氣機(jī)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱）購(gòu)自日本島津公司；Winner 802型納米激光粒度儀購(gòu)自濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器購(gòu)自北京恒豐長(zhǎng)偉科技有限公司；BT-125D型電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；VORTEX-5型渦旋混合儀購(gòu)自其林貝爾儀器公司；高通量組織研磨儀購(gòu)自上海萬(wàn)柏生物科技有限公司。

槲皮素原料藥（批號(hào)CY160517，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)公司；對(duì)照品槲皮素（批號(hào)16111201）、山柰酚（批號(hào)17092102）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；甘草酸（批號(hào)190421，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%）購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；F127和F68購(gòu)自北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；TPGS（批號(hào)BCBW9938）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸購(gòu)自天津福晨試劑廠；色譜甲醇購(gòu)自Fisher Chemical公司。

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2018-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)空軍特色醫(yī)學(xué)中心批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為空特（科研）第2021-75-PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 NCs的制備

采用介質(zhì)研磨法制備QT-NCs[19-20]。稱(chēng)取槲皮素原料藥40 mg及穩(wěn)定劑（F68、F127、GL、TPGS）8 mg，置于10 mL西林瓶中，加入4 mL蒸餾水，加入攪拌子及4 mL氧化鋯珠子，將西林瓶置于磁力攪拌器上，1500 r/min攪拌研磨2 h，取出，濾過(guò)去除氧化鋯珠子，即得QT-NCs混懸液。

2.2 NCs的粒徑結(jié)果

按照“2.1”項(xiàng)制備3批樣品，取樣品適量，加蒸餾水稀釋到合適濃度，采用納米激光粒度儀測(cè)定平均粒徑及多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI），采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定Zeta電位，平行測(cè)定3次，取其平均值。結(jié)果見(jiàn)表1，顯示QT-NCs/F127、QT-NCs/GL、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS粒徑均為200 nm，PDI約為0.2。QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS的電位基本一致，QT-NCs/GL電位絕對(duì)值相對(duì)較高。

表1 QT-NCs的粒徑和PDI(, n = 3)

Table 1 Particle size and PDI of QT-NCs (, n = 3)

樣品粒徑/nmPDIZeta電位/mV QT-NCs/F127201±100.19±0.02?(14.27±0.15) QT-NCs/GL199±120.20±0.02?(25.17±0.45) QT-NCs/F68194±100.20±0.01?(14.43±0.55) QT-NCs/TPGS205±130.20±0.01?(12.23±0.31)

2.3 大鼠體內(nèi)注射藥動(dòng)學(xué)研究

2.3.1 色譜條件 InterSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（55∶45）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為375 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.3.2 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)定槲皮素對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL的槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。另取山柰酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為488.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取適量，用甲醇稀釋為質(zhì)量濃度為97.60 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.3.3 血漿樣品的處理[21]取大鼠血漿樣品200 μL，置1.5 mL離心管中，依次加入50 μL 97.60 μg/mL的山柰酚內(nèi)標(biāo)物溶液、25%鹽酸200 μL，渦旋90 s混勻，90 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冷卻后加無(wú)水乙醇350 μL，渦旋90 s混勻，8000 r/min離心10 min，取上清液20 μL按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.3.4 專(zhuān)屬性考察 將大鼠空白血漿、空白血漿加適量槲皮素對(duì)照品、大鼠給藥后血漿樣品，參照“2.3.3”項(xiàng)下方法處理（空白血漿內(nèi)標(biāo)溶液以同體積甲醇替代），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果顯示空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)槲皮素的測(cè)定無(wú)干擾，其色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取200 μL空白血漿，精密加入不同濃度的槲皮素對(duì)照品溶液適量，得到槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.25、1.25、12.50、25.00、50.00、100.00、150.00、300.00 μg/mL的血漿對(duì)照品系列溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以槲皮素質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)、槲皮素的峰面積與內(nèi)標(biāo)山柰酚的峰面積比值（）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為＝0.043 5－0.024 2（2＝0.999 8）。結(jié)果，表明槲皮素在0.25～300.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3.6 檢測(cè)限與定量限 取質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL的槲皮素血漿對(duì)照品溶液，梯度稀釋后，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，信噪比為10時(shí)所能檢測(cè)到的質(zhì)量濃度為定量限，信噪比為3時(shí)所能檢測(cè)到的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。結(jié)果表明，定量限為0.25 μg/mL，檢測(cè)限為0.12 μg/mL。

1-槲皮素 2-山柰酚，圖3～7同

2.3.7 精密度試驗(yàn) 配制0.75、110.00、225.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果表明日內(nèi)精密度RSD分別為4.12%、1.19%、1.07%；日間精密度RSD分別為6.88%、1.01%、0.70%。表明精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制0.75、110.00、225.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，在?20 ℃反復(fù)凍融3次，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察其凍融穩(wěn)定性；將處理后的樣品室溫放置24 h，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察其室溫放置穩(wěn)定性。結(jié)果顯示低、中、高質(zhì)量濃度的槲皮素血漿樣品反復(fù)凍融后的RSD分別為3.69%、1.53%、0.95%；低、中、高質(zhì)量濃度的槲皮素血漿樣品處理后室溫放置24 h后的RSD分別為5.75%、1.45%、1.87%，表明血漿樣品在反復(fù)凍融3次及處理后的生物樣品室溫放置24 h均穩(wěn)定。

2.3.9 提取回收率試驗(yàn) 配制0.75、110.00、225.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。取與3種質(zhì)量濃度相同的槲皮素對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以槲皮素對(duì)照品溶液的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算槲皮素在相應(yīng)質(zhì)量濃度的血漿樣品中的提取回收率。結(jié)果表明低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中槲皮素的平均提取回收率分別為99.49%、95.67%、99.41%，且RSD符合要求。

2.3.10 藥動(dòng)學(xué)研究 取雄性SD大鼠24只，分為QT-NCs/F127組、QT-NCs/F68組、QT-NCs/GL組和QT-NCs/TPGS組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。測(cè)定載藥量[QT-NCs/F127：（86.81±1.02）%；QT-NCs/F68：（93.06±0.30）%；QT-NCs/GL：（91.89±0.60）%；QT-NCs/TPGS：（87.93±0.33）%]后，按照載藥量計(jì)算給藥劑量（100 mg/kg），分別尾椎iv QT-NCs/F127、QT-NCs/F68、QT-NCs/GL和QT-NCs/TPGS，然后分別于給藥后0.083、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000、12.000、24.000 h眼眶取血0.5 mL，置于1.5 mL肝素鈉浸潤(rùn)過(guò)的離心管內(nèi)，5000 r/min離心10 min分離血漿，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算槲皮素的血藥濃度，繪制藥-時(shí)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2；采用DAS 2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。與QT-NCs/F127組比較，QT-NCs/GL、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS的AUC0～均顯著增加（＜0.05、0.01），并呈現(xiàn)如下順序：QT-NCs/GL＞QT-NCs/TPGS＞QT-NCs/F68＞QT-NCs/F127。此外，QT-NCs/TPGS的AUC0～t、1/2z及max約為QT-NCs/F127的1.39、1.24和1.33倍（＜0.05、0.01）。

圖2 QT-NCs/F127、QT-NCs/GL、QT-NCs/TPGS和QT-NCs/F68的藥-時(shí)曲線(, n = 6)

表2 QT-NCs/F127、QT-NCs/GL、QT-NCs/TPGS和QT-NCs/F68的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 6)

Table 2 Main pharmacokinetic parameters of QT-NCs/F127, QT-NCs/GL, QT-NCs/TPGS and QT-NCs/F68 (, n = 6)

組別AUC0～t/(mg·h·L?1)MRT0～t/ht1/2z/hCmax/(mg·L?1) QT-NCs/F127245.01±28.725.89±0.487.73±1.40125.54±19.91 QT-NCs/GL464.87±100.51**6.01±0.696.36±3.4791.59±11.08 QT-NCs/F68293.00±44.72*##6.01±0.9810.70±3.42246.42±55.07**## QT-NCs/TPGS339.82±73.82*#6.04±0.519.55±1.00*197.62±41.29**##

與QT-NCs/F127組比較：*＜0.05**＜0.01；與QT-NCs/GL組比較：#＜0.05##＜0.01

*<0.05**<0.01QT-NCs/F127 group;#<0.05##<0.01QT-NCs/GL group

2.4 大鼠體內(nèi)注射組織分布研究

2.4.1 色譜條件 InterSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（56∶44）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為375 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2.4.2 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱(chēng)定槲皮素對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為1.34 mg/mL的槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。另取山柰酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為488.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取適量，用甲醇稀釋為質(zhì)量濃度為48.80 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.4.3 組織勻漿液的處理[21]取大鼠組織勻漿液200 μL，置1.5 mL離心管中，依次加入50 μL 48.80 μg/mL的山柰酚內(nèi)標(biāo)物溶液、25%鹽酸200 μL，渦旋90 s混勻，90 ℃水浴中反應(yīng)15 min，冷卻后加無(wú)水乙醇350 μL，渦旋90 s混勻，8000 r/min離心10 min，取上清液20 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.4.4 專(zhuān)屬性考察 將大鼠空白組織勻漿、空白組織勻漿適量槲皮素對(duì)照品、大鼠給藥后勻漿樣品，參照“2.4.3”項(xiàng)下方法處理（空白血漿內(nèi)標(biāo)溶液以同體積甲醇替代），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果顯示空白勻漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)槲皮素的測(cè)定無(wú)干擾，其色譜圖見(jiàn)圖3～7。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取200 μL空白組織勻漿，加入不同濃度的槲皮素對(duì)照品溶液適量，得到質(zhì)量濃度為0.33、1.67、16.70、33.40、66.80、133.60 μg/mL的心、肺、腎組織樣品標(biāo)準(zhǔn)液以及質(zhì)量濃度為0.33、1.67、16.70、33.40、66.80、133.60、334.00 μg/mL的肝、脾組織樣品標(biāo)準(zhǔn)液，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以槲皮素質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)、槲皮素的峰面積與內(nèi)標(biāo)山柰酚的峰面積比值（）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程。各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見(jiàn)表3。取質(zhì)量濃度為1.67 μg/mL的槲皮素組織樣品標(biāo)準(zhǔn)品溶液，梯度稀釋后，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 空白心臟(A)、空白心臟＋槲皮素對(duì)照品 (B) 和含藥心臟 (C) 的HPLC色譜圖

圖4 空白肝臟(A)、空白肝臟＋槲皮素對(duì)照品 (B) 和含藥肝臟 (C)的HPLC色譜圖

圖5 空白脾臟(A)、空白脾臟＋槲皮素對(duì)照品 (B) 和含藥脾臟 (C)的HPLC色譜圖

圖6 空白肺臟(A)、空白肺臟＋槲皮素對(duì)照品 (B) 和含藥肺臟 (C)的考察HPLC色譜圖

圖7 空白腎臟(A)、空白腎臟＋槲皮素對(duì)照品 (B) 和含藥腎臟 (C)的HPLC色譜圖

2.4.6 精密度試驗(yàn) 配制含1.00、50.00、100.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的心、肺、腎組織勻漿樣品以及含1.00、125.00、250.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的肝、脾組織勻漿樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。日內(nèi)精密度RSD為0.83%～3.63%，日間RSD為0.92%～4.69%，表明精密度良好。

表3 各組織中槲皮素的回歸方程及線性范圍

Table 3 Regression equation and linear range of quercetin in each tissue

樣品回歸方程R2線性范圍/(μg·mL?1)定量限/(μg·mL?1)檢測(cè)限/(μg·mL?1) 心Y＝0.088 7 X＋0.073 70.999 40.33～133.600.330.16 肝Y＝0.084 9 X＋0.119 10.999 90.33～334.000.330.16 脾Y＝0.076 5 X＋0.070 50.999 20.33～334.000.330.16 肺Y＝0.082 3 X＋0.084 50.999 40.33～133.600.330.16 腎Y＝0.083 3 X－0.009 50.999 90.33～133.600.330.16

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制1.00、50.00、100.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的心、肺、腎組織勻漿樣品以及含1.00、125.00、250.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的肝、脾組織勻漿樣品，在?20 ℃反復(fù)凍融3次，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察其凍融穩(wěn)定性；將處理后的樣品室溫放置24 h，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察其室溫放置穩(wěn)定性。結(jié)果顯示組織勻漿樣品反復(fù)凍融后的RSD為0.91%～3.78%；處理后室溫放置24 h后的RSD為0.88%～5.33%，表明組織樣品在反復(fù)凍融3次及處理后的生物樣品室溫放置24 h均穩(wěn)定。

2.4.8 回收率試驗(yàn) 配制1.00、50.00、100.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的心、肺、腎組織勻漿樣品以及含1.00、125.00、250.00 μg/mL的低、中、高質(zhì)量濃度的肝、脾組織勻漿樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備3份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析。取與上述3種質(zhì)量濃度相同的槲皮素對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以槲皮素對(duì)照品溶液的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算槲皮素在相應(yīng)濃度的組織樣品中的提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。各組織中槲皮素的提取回收率為85%～105%，RSD為1.31%～3.48%，符合要求。

2.4.9 組織分布研究 取雄性SD大鼠192只，分為QT-NCs/F127組、QT-NCs/F68組、QT-NCs/GL組和QT-NCs/TPGS組，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。按照載藥量計(jì)算給藥劑量（100 mg/kg），分別尾椎iv QT-NCs/F127、QT-NCs/F68、QT-NCs/GL和QT-NCs/TPGS，然后分別于給藥后0.083、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、12.000、24.000 h時(shí)間點(diǎn)麻醉，依次取心、肝、脾、肺、腎組織置于生理鹽水中，洗凈，濾紙吸干。放入?20 ℃冰箱中進(jìn)行冷凍保存，備用。分別稱(chēng)取各組織約0.5 g（不足者取全部組織），按2.0 mL/g加入生理鹽水，制成組織勻漿。按照“2.4.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算槲皮素的組織質(zhì)量濃度，繪制藥-時(shí)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖8；采用DAS 2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表5。由圖8可知，尾iv QT-NCs/GL、QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS后，QT-NCs/GL在肝、肺中的質(zhì)量濃度高于QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS。由表5可知，在肝、脾中，與QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS 3組相比，QT-NCs/GL的AUC0～和MRT0～均存在顯著差異（＜0.01）；尤其在肝臟中，4組QT-NCs的AUC0～呈現(xiàn)如下順序：QT-NCs/GL＞QT-NCs/TPGS＞QT-NCs/F68＞QT-NCs/F127。在腎臟中，與QT-NCs/F127相比，QT-NCs/GL、QT-NCs/TPGS和QT-NCs/F68的AUC0～分別增加1.72、1.34和1.59倍（＜0.05）。在肺中，與QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS 3組相比，QT-NCs/GL的AUC0～顯著升高（＜0.01）。在心臟中，QT-NCs/GL與QT-NCs/F127、QT-NCs/F68、QT-NCs/TPGS的MRT0～均存在顯著差異（＜0.01）。

表4 各組織中槲皮素的提取回收率

Table 4 Extraction recovery of quercetin in various tissues

樣品理論質(zhì)量濃度/(μg·mL?1)提取回收率/%RSD/% 心1.0096.58±3.113.22 50.0096.86±2.082.14 100.0094.77±1.611.69 肝1.0098.63±2.512.55 125.0095.59±2.913.05 250.0094.92±1.661.75 脾1.0097.61±1.281.31 125.0087.85±1.321.50 250.0089.08±1.391.56 肺1.0095.95±2.742.86 50.0094.68±2.042.15 100.0087.34±1.591.82 腎1.0089.87±1.501.67 50.0088.45±2.022.28 100.0090.95±3.163.48

3 討論

本課題組前期已經(jīng)研究了不同穩(wěn)定劑對(duì)QT-NCs體外溶出及口服吸收的影響[18]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs在大鼠體內(nèi)注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布的影響。結(jié)果顯示，不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs藥動(dòng)學(xué)及組織分布存在顯著差異，血漿及肝臟中的AUC0～t呈現(xiàn)如下順序：QT-NCs/GL＞QT-NCs/TPGS＞QT-NCs/F68＞QT-NCs/F127，表明穩(wěn)定劑種類(lèi)會(huì)影響QT-NCs的注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布。各給藥組均以肝臟中藥物分布最高，表明QT-NCs具有一定的被動(dòng)肝靶向能力，而不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs在同一臟器中的分布不一致，則主要是因?yàn)镼T-NCs注射后能以整體粒子形式分布至各個(gè)臟器[21]，而納米粒表面修飾的不同穩(wěn)定劑具有不同的生理活性[12]，可能會(huì)影響臟器細(xì)胞對(duì)槲皮素的攝取及外排，進(jìn)而影響槲皮素的分布。

圖8 QT-NCs/GL、QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS在肝、脾、心、肺、腎的藥-時(shí)曲線(, n = 6)

表5 QT-NCs/GL、QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS在各組織的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(, n = 6)

Table 5 Main pharmacokinetic parameters of QT-NCs/GL, QT-NCs/F127, QT-NCs/F68 and QT-NCs/TPGS in each organization (, n = 6)

組織組別AUC0～t/(mg·h·L?1)MRT0～t/ht1/2z/hCmax/(mg·L?1) 肝QT-NCs/GL1 400.10±70.837.93±0.189.51±3.25273.08±24.69 QT-NCs/F127519.21±55.00**3.41±0.45**3.48±0.70*277.89±21.40 QT-NCs/F68559.67±30.25**4.42±0.33**6.55±3.01231.84±17.96*▲ QT-NCs/TPGS627.16±43.83**▲★4.93±0.08**▲▲★5.19±0.79*▲243.70±25.68 脾QT-NCs/GL286.45±11.384.06±0.365.02±0.65202.70±34.58 QT-NCs/F127154.37±26.75**0.86±0.07**2.23±0.69**239.80±43.81 QT-NCs/F68127.69±16.62**0.64±0.07**▲▲0.58±0.06**▲▲166.19±22.79▲ QT-NCs/TPGS164.44±15.94**★0.99±0.04**▲★★1.69±0.60**★217.39±41.18 腎QT-NCs/GL82.26±13.723.61±0.955.31±2.2259.73±3.83 QT-NCs/F12753.16±5.77*1.97±0.08*2.56±1.1255.88±9.42 QT-NCs/F6870.43±8.68▲2.55±0.875.60±2.4259.99±4.07 QT-NCs/TPGS61.59±6.93*2.00±0.25**3.95±0.7352.06±5.53 肺QT-NCs/GL173.73±15.885.10±0.596.31±0.6296.49±12.17 QT-NCs/F12752.03±7.18**3.57±0.49**9.94±7.5872.39±16.90 QT-NCs/F6857.67±15.21**1.36±0.34**▲▲4.00±0.98**100.13±17.28 QT-NCs/TPGS38.72±6.29**▲2.08±0.25**▲▲★3.76±1.79**50.52±11.85**★★ 心QT-NCs/GL10.97±3.622.12±0.535.59±3.8114.51±10.61 QT-NCs/F12712.85±3.960.88±0.40**3.38±2.6030.53±7.30* QT-NCs/F689.28±1.500.59±0.07**1.36±0.6322.52±4.19 QT-NCs/TPGS13.48±2.85★0.88±0.48**2.29±1.8728.61±6.65

與QT-NCs/GL組比較：P＜0.05 P＜0.01；與QT-NCs/F127組比較：P＜0.05 P＜0.01；與QT-NCs/F68組比較：★＜0.05★★＜0.01

*< 0.05**< 0.01QT-NCs/GL group;P< 0.05 P< 0.01QT-NCs/F127 group;★< 0.05★★< 0.01QT-NCs/F68 group

不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs中，以QT-NCs/GL組肝臟的藥物濃度最高，提示GL修飾的NCs具有一定的主動(dòng)肝靶向能力，可用于開(kāi)發(fā)肝靶向納米晶；這主要是因?yàn)楦闻K細(xì)胞表面有GL的特異性結(jié)合位點(diǎn)[22]，能夠增強(qiáng)肝臟細(xì)胞對(duì)QT-NCs/GL的攝取。此外，GL能夠增強(qiáng)P-gp活性，QT-NCs被肝臟攝取后由于P-gp活性的增強(qiáng)而增加槲皮素的外排入血，導(dǎo)致其較高的血藥濃度。文獻(xiàn)報(bào)道[12,17]，TPGS、F68、F127均能夠抑制P-gp活性，3種穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs表現(xiàn)出不同的藥動(dòng)學(xué)及組織分布行為，可能是因?yàn)樗鼈儗?duì)P-gp抑制作用不同，且F68修飾的NCs具有一定的長(zhǎng)循環(huán)作用[23]。

綜上所述，本研究對(duì)QT-NCs/GL、QT-NCs/F127、QT-NCs/F68和QT-NCs/TPGS 4種QT-NCs進(jìn)行了大鼠體內(nèi)注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究，結(jié)果表明，不同穩(wěn)定劑對(duì)于靶向組織分布能產(chǎn)生影響，表明穩(wěn)定劑種類(lèi)能影響QT-NCs注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布。后續(xù)可進(jìn)一步研究不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs與臟器細(xì)胞的相互作用，以闡明導(dǎo)致其注射藥動(dòng)學(xué)及組織分布差異的原因。同時(shí)，根據(jù)不同穩(wěn)定劑修飾的QT-NCs的組織分布特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)靶向制劑。此外，未來(lái)還可以研究更多穩(wěn)定劑對(duì)不同難溶性藥物NCs體內(nèi)行為的影響，以探索穩(wěn)定劑種類(lèi)對(duì)難溶性藥物NCs體內(nèi)行為影響的規(guī)律，為NCs靶向制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacokinetics and tissue distribution of quercetin nanocrystals modified with different stabilizers following intravenous delivery in rats

HU Fei1, 2, CHE Zhi-hui2, WANG Zhe2, LI Fang-qin1, 2, YAN Qiao2, SHEN Cheng-ying3, SHEN Bao-de1, YUAN Hai-long2

1.Key Laboratory of Modern Chinese Medicine Preparation of Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2.Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, PLA, Beijing 100142, China 3.Department of Pharmacy, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330004, China

To prepare quercetin nanocrystals (QT-NCs) with pluronic F68 (F68), pluronic F127 (F127), glycyrrhizic acid (GL), vitamin E polyethylene glycol succinate (TPGS) as stabilizers and explore the effects of stabilizers on pharmacokinetics and tissue distribution following intravenous delivery.High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the concentration of quercetin in plasma and tissues of rats, and DAS 2.0 software was used to calculate its pharmacokinetic parameters for comparison.The pharmacokinetic results showed that AUC0～tof QT-NCs was in the following order: QT-NCs/GL [(464.87 ± 100.51) mg·L/h] > QT-NCs/TPGS [(339.82 ± 73.82) mg·L/h] > QT-NCs/F68 [293.00 ± 44.72] mg·L/h] > QT-NCs/F127 [(245.01 ± 28.72) mg·L/h).AUC0～tof QT-NCs in liver showed similar order to that of plasma.Furthermore, the distribution of QT-NCs/GL in liver, spleen and lung were the highest (< 0.01).The stabilizers’ types can influence the pharmacokinetics and tissue distribution of QT-NCs following intravenous delivery.

quercetin; nanocrystals; stabilizers; pharmacokinetics; tissue distribution

R285.61

A

0253 - 2670(2022)09 - 2697 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.012

2021-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803741）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873092）；江西中醫(yī)藥大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2021BSZR025）

胡 菲（1997—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)研究。Tel: 17779140130 E-mail: 1256719791@qq.com

通信作者：申寶德，博士，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬录夹g(shù)與新劑型研究。E-mail: shenbaode@163.com

袁海龍，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)研究。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]