復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)外成分分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

許雅婧，樂心逸，葛一蒙，沈龍海，吳 彤，李默影, 3*

復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)外成分分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

許雅婧1，樂心逸1，葛一蒙2，沈龍海1，吳 彤1，李默影1, 3*

1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200437 2.黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 虎林 158400 3.江南大學(xué)糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心，江蘇 無錫 214122

采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)方芩蘭口服液的主要化學(xué)成分及其進(jìn)入血液和組織中的成分進(jìn)行鑒定，并選擇主要的體內(nèi)成分開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，初步揭示其作用機(jī)制。采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合MSE技術(shù)進(jìn)行復(fù)方芩蘭口服液、血液和組織樣本分析，結(jié)合精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間、碎片離子、中性丟失等信息進(jìn)行復(fù)方芩蘭口服液的化學(xué)成分和體內(nèi)成分鑒定。利用Cytoscape軟件分別構(gòu)建復(fù)方芩蘭口服液主要體內(nèi)成分與其功能主治（感冒、發(fā)熱、咳嗽、咽痛）之間的“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)，開展核心靶點(diǎn)和作用通路分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)核心靶點(diǎn)中的3個(gè)熱休克蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8）進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。大鼠ig給藥后在血液樣本中檢測(cè)到3個(gè)原型成分和9個(gè)代謝產(chǎn)物，組織樣本中檢測(cè)到3個(gè)原型成分和5個(gè)代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物主要為葡萄糖醛酸結(jié)合物。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果提示復(fù)方芩蘭口服液的作用通路主要與炎癥和免疫相關(guān)，且生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明上呼吸道感染大鼠肺臟組織中HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8的mRNA表達(dá)在給予復(fù)方芩蘭口服液后顯著上調(diào)（＜0.01）。利用UPLC-Q-TOF-MS分析復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)外成分并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，初步明確了復(fù)方芩蘭口服液的作用靶點(diǎn)和通路，并選擇3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

復(fù)方芩蘭口服液；UPLC-Q-TOF-MS；體內(nèi)成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)

中藥復(fù)方是中醫(yī)藥臨床應(yīng)用的主要形式，集中體現(xiàn)了“辨證論治，輔以補(bǔ)中”的治療原則。由于復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)和協(xié)同效應(yīng)，為其作用機(jī)制的科學(xué)闡述帶來了較大困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為近年來研究中藥復(fù)方作用機(jī)制的新興學(xué)科，使用多種分析工具從大量數(shù)據(jù)庫(kù)中提取成分和靶點(diǎn)相關(guān)信息，通過建立復(fù)方中目標(biāo)成分對(duì)于相關(guān)疾病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而揭示復(fù)方的作用機(jī)制。復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根4味藥材制成，辛涼解表，清熱解毒，用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛[1-2]。雖然前期分析表明復(fù)方芩蘭口服液成分較為復(fù)雜，但只有經(jīng)消化道直接吸收入血或者經(jīng)消化道分解成為代謝產(chǎn)物吸收入血，到達(dá)靶器官或靶點(diǎn)才能發(fā)揮相應(yīng)的藥效。因此本研究首先采用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)復(fù)方芩蘭口服液進(jìn)入正常大鼠的血液和器官組織（肝、心、脾、肺、腎）中的成分進(jìn)行鑒定，以明確其潛在活性成分，再以此作為目標(biāo)成分分別構(gòu)建相對(duì)于感冒、發(fā)熱、咳嗽和咽痛的“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心靶點(diǎn)進(jìn)行通路分析及生物學(xué)驗(yàn)證，初步揭示復(fù)方芩蘭口服液的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters AcquityTM超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），配置二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器和PDA檢測(cè)器；Waters Xevo G2單四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀配置電噴霧電離源（美國(guó)Waters公司）；Merck Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；MS105DU型半微量天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；XH-D型旋渦混合器（上海汗諾儀器有限公司）；DC-12氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；SK250HP型超聲波清洗器（250 W、53 kHz，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；T 10 basic ULTRA- TURRAX組織勻漿器（德國(guó)IKA集團(tuán)）；ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 樣品與試劑

復(fù)方芩蘭口服液（批號(hào)B14200301）由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供。孟魯司特鈉咀嚼片（魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)16201201）購(gòu)自上海復(fù)美大藥房；大前門香煙購(gòu)自上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司；脂多糖（LPS）試劑（批號(hào)13F-4020）購(gòu)自Sigma公司；辣椒素（批號(hào)93CHRUYK）購(gòu)自安耐吉化學(xué)。對(duì)照品蔗糖（批號(hào)111507-201704）、綠原酸（批號(hào)110753-201716）、連翹苷（批號(hào)110821-201615）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號(hào)4245）、漢黃芩苷（批號(hào)5744）、連翹酯苷E（批號(hào)6982）、黃芩素（批號(hào)3634）、毛蕊花糖苷（批號(hào)3632）購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C均為實(shí)驗(yàn)室自制，所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。

RNA提取液（Servicebio，G3013）、熒光定量試劑盒（Roche，04913914001）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，#K1622）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；乙腈（LC-MS級(jí)）、甲酸（LC-MS級(jí)）均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠（SPF級(jí)，體質(zhì)量180～200 g）購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-2002，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2009-0068），飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d [濕度（50±10）%；溫度（25±2）℃；12 h晝夜循環(huán)]，可自由獲取食物和飲用水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理評(píng)價(jià)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（批件號(hào)FW2020-290）。

2 方法

2.1 體內(nèi)外成分分析

2.1.1 供試品溶液的制備 精密吸取復(fù)方芩蘭口服液2 mL，加水稀釋并定容至10 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取13種對(duì)照品適量，分別加入水或甲醇使溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 動(dòng)物試驗(yàn)分組、給藥及樣本處理 12只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和復(fù)方芩蘭口服液組，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。按31.5 mL/kg（5倍人用臨床劑量折算）ig 給藥，對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。給藥2 h分別于眼底靜脈叢取血后將動(dòng)物處死，迅速取出心、肝、脾、肺、腎。血漿于4000 r/min離心10 min，取上清液；組織樣本用生理鹽水沖洗表面，吸干水分，加入3倍量冰生理鹽水，用組織勻漿器勻漿，得組織勻漿液；樣本均于?80 ℃冰箱保存。

分別精密移取大鼠血清和各組織勻漿液500 μL，加入1 mol/L鹽酸50 μL，渦旋60 s，再精密加入1.5 mL甲醇-乙腈（1∶1）的混合液，渦旋60 s，12 000 r/min于4 ℃離心15 min，取上清液氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋60 s，12 000 r/min于4 ℃離心10 min，取上清液，備用。

2.1.4 液質(zhì)聯(lián)用條件

（1）色譜條件：Waters ACQUITY T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；柱溫為35 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫：0～3 min，100% A；3～8 min，100%→95% A；8～12 min，95%→85% A；12～18 min，85%→75% A；18～25 min，75%→50% A；25～27 min，50%→20% A；27～28 min，20%→100% A；28～30 min，100% A。

（2）質(zhì)譜條件：Xevo G2-XS Q-TOF-MS系統(tǒng)，ESI電離源，正、負(fù)離子模式。MS參數(shù)設(shè)置：質(zhì)量掃描范圍為50～1500；干燥氣（N2）體積流量為500 L/h，溫度400 ℃；電離源溫度120 ℃；錐孔氣體積流量為100 L/h，電壓為40 V；毛細(xì)管電壓為3.5 kV。在MSE模式下，低碰撞能為6 eV，高碰撞能為25～60 eV。亮氨酸腦啡肽溶液（0.2 ng/mL）作為外標(biāo)溶液對(duì)質(zhì)量進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，體積流量為5 μL/min，在負(fù)離子模式下/554.261 5 [M－H]?，正離子模式下/556.277 1 [M＋H]+。

2.1.5 數(shù)據(jù)采集及分析 采用Masslynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并提取各主要質(zhì)譜峰的信息，根據(jù)對(duì)照品比對(duì)或參考MassBank（http://www.massbank.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的質(zhì)譜圖，結(jié)合保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子、中性丟失等綜合分析，進(jìn)行復(fù)方芩蘭口服液的化學(xué)成分鑒定。對(duì)給藥組和對(duì)照組樣本進(jìn)行對(duì)比分析，提取兩組間差異性質(zhì)譜峰的信息，依據(jù)原型成分的裂解碎片及可能的代謝途徑，結(jié)合保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子等信息，進(jìn)行復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)成分鑒定。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.2.1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以復(fù)方芩蘭口服液體內(nèi)成分相關(guān)化合物黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酸、連翹酯苷E、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C作為目標(biāo)成分，利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/）、Swiss （http://www.swisstargetprediction.ch/）、STITCH（http://stitch.embl.de/）檢索相關(guān)靶點(diǎn)。以感冒、發(fā)熱、咳嗽、咽痛作為復(fù)方芩蘭口服液的主要適應(yīng)癥，應(yīng)用TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和OMIM（https://omim.org/）檢索相關(guān)靶點(diǎn)。分別去除各數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)靶點(diǎn)后在Uniprot（https://www.uniprot.org/）中逐一查詢各靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的基因名稱并匯總。

2.2.2 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將檢索結(jié)果按照格式要求整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，利用Bisogenet插件分別構(gòu)建各目標(biāo)成分相關(guān)靶點(diǎn)和各適應(yīng)癥相關(guān)靶點(diǎn)的PPI圖。由于該插件由多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成，可以在已知靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行廣泛的拓展。PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node）代表潛在靶點(diǎn)，邊（edge）則代表靶點(diǎn)間的相互作用。

2.2.3 核心靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別對(duì)各目標(biāo)成分PPI與各適應(yīng)癥PPI取交集，采用CytoNCA插件計(jì)算交集靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)連接度（degree）并以其中位數(shù)的2倍為卡值[3]，從中篩選出核心靶點(diǎn)，分別構(gòu)建復(fù)方芩蘭口服液各適應(yīng)癥的“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)。

2.2.4 通路富集 利用DAVID（https://david- d.ncifcrf.gov/home.jsp）分別對(duì)復(fù)方芩蘭口服液作用于各適應(yīng)證的主要靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析。

2.3 生物學(xué)驗(yàn)證

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，選擇與復(fù)方芩蘭口服液4種適應(yīng)證均密切相關(guān)的HSP系列蛋白（HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA8），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證。

2.3.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 30只大鼠隨機(jī)分組，其中對(duì)照組、模型組各7只，復(fù)方芩蘭口服液組、陽性藥組各8只。除對(duì)照組外，其余3組大鼠均置于煙熏室進(jìn)行煙熏造模，每次10只進(jìn)行煙熏20 min，每日2次，連續(xù)10 d。分別于第1、3、7、10天采用LPS誘導(dǎo)上呼吸道感染，方法為大鼠每次滴鼻吸入1 mg/mL LPS溶液，每只大鼠0.2 mL。之后于第11～14天采用辣椒素霧化對(duì)大鼠進(jìn)行呼吸道刺激，5 min/d。

造模后各組大鼠均正常飼養(yǎng)1周，于第8天開始，復(fù)方芩蘭口服液組和陽性藥組分別按照6 mL/kg和0.5 mg/kg（按照臨床人用劑量折算）ig給予復(fù)方芩蘭口服液和孟魯司特鈉，1次/d，連續(xù)7 d；同時(shí)對(duì)照組和模型組每日給予相同體積的生理鹽水。給藥結(jié)束次日將所有大鼠以7%水合氯醛麻醉并處死，取大鼠肺部組織樣本，處理同“2.1.3”項(xiàng)，于?80 ℃保存。

2.3.2 PCR檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)交由武漢塞維爾生物科技有限公司完成，以GADPH（5′-CTGGAGAAA- CCTGCCAAGTATG-3′，5′-GGTGGAAGAATGGGAG TTGCT-3′）作為內(nèi)參基因，目的序列分別為：HSP90AA1（5′-GCAAGACCGAACCCTCACTATT-3′，5′-CCATTGGTTCACCTGTGTCT-3′）；HSP90AB1（5′-TCAACTTCATCCGTGGTGTGG-3′，5′-GACTG- AGAGGTATGGTAGCGAAG-3′）；HSPA8（5′-AGG- ATTTGCTGCTCTTGGATGT-3′；5′-AAGCAGGTTG- TTGTCCTTGGTC-3′）。

取?80 ℃凍存的大鼠肺臟，每100毫克加入1 mL Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃、10 min 1個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40個(gè)循環(huán)，PCR儀采集熒光信號(hào)，熔解曲線為從60 ℃升至95 ℃時(shí)，每15秒升溫0.3 ℃。以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2???Ct方法對(duì)內(nèi)參基因t值與待檢基因t值進(jìn)行計(jì)算，得出樣本間表達(dá)量差異倍數(shù)關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)外成分鑒定結(jié)果

3.1.1 化學(xué)成分鑒定結(jié)果 復(fù)方芩蘭口服液在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖1所示。共鑒定出32個(gè)主要化合物，包括9個(gè)有機(jī)酸類（奎寧酸、檸檬酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）、5個(gè)環(huán)烯醚萜類（去乙酰車葉草苷酸、五?；ㄜ账?、山梔子苷B、梔子新苷、斷氧化馬錢苷）、6個(gè)黃酮類（山柰酚-3--蕓香糖苷、黃芩苷、千層紙素-7--β--葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）、2個(gè)苯乙醇苷類（3,4-二羥基苯乙醇苷、連翹酯苷E）、2個(gè)環(huán)己醇苷類（連翹環(huán)己醇苷B、連翹酸-1′--β-葡萄糖苷）、2個(gè)苯丙素類（毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）、1個(gè)木脂素類（連翹苷）和5個(gè)其他類（精氨酸、蔗糖、氧化脯氨酸、腺苷、鳥苷）。具體見表1。

3.1.2 入血成分鑒定 對(duì)照組和給藥組大鼠血清在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖2，共鑒定12個(gè)入血成分（表2），包括3個(gè)原型成分：連翹酯苷E（M2）、黃芩苷（M8）、漢黃芩苷（M11）和9個(gè)代謝產(chǎn)物。推測(cè)連翹酸-1′--β-葡萄糖苷在大鼠體內(nèi)經(jīng)過I相反應(yīng)中的水解代謝成為苷元連翹酸（M1）。咖啡?？鼘幩犷惢衔铮ňG原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）經(jīng)I相反應(yīng)中的水解代謝成為咖啡酸，再經(jīng)過II相反應(yīng)中的葡糖醛酸化形成咖啡酸葡萄糖醛酸結(jié)合物。結(jié)合參考文獻(xiàn)中的保留時(shí)間，鑒定M3和M4分別為咖啡酸-4--β--葡萄糖醛酸和咖啡酸- 3--β--葡萄糖醛酸[4]。黃芩苷經(jīng)I相反應(yīng)中的水解形成黃芩素，其5-OH、6-OH和7-OH為代謝活性位點(diǎn)，再經(jīng)II相反應(yīng)中的葡糖醛酸化形成單葡萄糖醛酸和雙葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物。結(jié)合參考文獻(xiàn)，鑒定黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷（M5）、黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷（M6）、黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷（M7）、黃芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M9）和黃芩素-6--β--葡萄糖醛酸苷（M12）5個(gè)代謝產(chǎn)物[5]。漢黃芩苷與黃芩苷代謝途徑類似，結(jié)合參考文獻(xiàn)，鑒定其代謝產(chǎn)物漢黃芩素-5--β--葡萄糖醛酸苷（M10）[5]。黃芩素和漢黃芩素也可以直接發(fā)生相應(yīng)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)。

圖1 復(fù)方芩蘭口服液在正離子模式(A) 和負(fù)離子模式(B)下的總離子流圖

表1 復(fù)方芩蘭口服液中鑒定的化學(xué)成分

Table 1 Identification of the chemical constituents in Fufang Qinlan Oral Liquid

峰號(hào)tR/min分子式準(zhǔn)分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結(jié)果實(shí)測(cè)值理論值 10.87C6H14N4O2[M＋H]+175.120 1 175.119 53.43158 [M＋H－OH]+精氨酸 21.28C12H22O11[M－H]?341.108 6341.108 40.59387 [M＋COOH]–蔗糖* 31.92C6H8O7[M－H]?191.018 9191.019 2?1.57173 [M－H－H2O]–, 111 [M－COOH－2H2O]–檸檬酸 42.15C5H7NO3[M＋H]+130.050 1 130.050 4?2.3884 [M－COOH]+氧化脯氨酸 56.41C7H12O6[M－H]?191.055 4191.055 6?1.0585 [M－H－CO－2H2O－C2H2O]–奎寧酸 67.52C14H20O8[M－H]?315.107 6315.108 0?1.27361 [M＋COOH]–, 135 [M－H－Glc－H2O]–3,4-二羥基苯乙醇苷 77.92C10H13N5O4[M＋H]+268.103 9268.104 6?2.61136 [M＋H－Rib]+腺苷 87.95C10H13N5O5[M＋H]+284.099 7 284.099 40.74152 [M＋H－Rib]+鳥苷 98.24C14H24O8[M＋COOH]?365.144 6365.144 8?0.47319 [M－H]?, 161 [M－C8H15O3]?連翹環(huán)己醇苷B 108.74C14H24O9[M－H]?335.134 3335.134 20.30155 [M－H－Glc－H2O]?連翹酸-1′-O-β-D-葡萄糖苷 119.82C16H22O11[M－H]?389.108 5389.108 40.26227 [M－H－Glc]?, 191 [M－H－Glc－2H2O]–去乙酰車葉草苷酸 1210.93C16H24O10[M－H]?375.129 2375.129 10.21213 [M－H－Glc]?, 151 [M－H－Glc－H2O－COO]–五?；ㄜ账?1311.13C16H18O9[M－H]?353.087 5353.087 30.57191 [M－H－C9H6O3]–新綠原酸* 1411.73C20H30O12[M－H]?461.166 3461.165 90.87315 [M－H－Rha]–, 205 [M－H－C6H6O2－Rha]–, 163 [M－H－C8H8O2－Glc]–, 135 [M－H－Glc－Rha－H2O]–連翹酯苷E* 1512.59C16H18O9[M－H]?353.086 4353.087 3?2.55191 [M－H－C9H6O3]–綠原酸* 1612.79C16H22O10[M－H]?373.113 7373.113 50.62193 [M－H－Glc－H2O]–梔子新苷 1712.89C16H18O9[M－H]?353.087 7353.087 31.27173 [M－H－C9H6O3－H2O]–隱綠原酸* 1813.23C9H8O4[M－H]?179.033 4179.034 4?5.59135 [M－H－COO]–咖啡酸 1913.73C17H24O11[M－H]?403.122 9403.124 0?2.73241 [M－H－Glc]–斷氧化馬錢子苷 2014.61C17H24O11[M－H]?403.124 0403.124 00223 [M－H－Glc－H2O]–山梔子苷B 2115.76C29H36O15[M－H]?623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–異毛蕊花糖苷 2216.23C29H36O15[M－H]?623.198 2623.197 60.98477 [M－H－Rha]–, 461 [M－H－C9H6O3]–, 443 [M－H－C9H6O3－H2O]–毛蕊花糖苷* 2316.60C27H30O15[M－H]?593.151 3593.150 61.11447 [M－H－Rha]–, 285 [M－H－Rha－Glc]–山柰酚-3-O-蕓香糖苷 2417.36C25H24O12[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸B* 2517.95C25H24O13[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸A* 2618.49C25H24O14[M－H]?515.119 5515.119 01.07353 [M－H－C9H6O3]–, 173 [M－H－2C9H6O3－H2O]–異綠原酸C* 2719.75C21H18O11[M－H]?445.077 4445.077 10.72269 [M－H－GluA]–黃芩苷* 2820.35C27H34O11[M＋COOH]?579.208 2579.207 80.76371 [M－H－Glc]–連翹苷* 2920.63C27H34O12[M＋COOH]?579.209 7579.207 83.35371 [M－H－Glc]–, 356 [M－H－Glc－CH3]–千層紙素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 3021.07C22H20O11[M－H]?459.093 1459.092 70.81283 [M－H－GluA]–, 268 [M－H－GluA－CH3]–漢黃芩苷* 3123.36C15H10O5[M－H]?269.045 1269.045 00.41251 [M－H－H2O]–黃芩素* 3224.96C16H12O5[M－H]?283.059 5283.060 6?3.89268 [M－H－CH3]–漢黃芩素

*由對(duì)照品確定；Glc-葡萄糖取代基 Rib-核糖取代基 Rha-鼠李糖取代基 GluA-葡萄糖醛酸取代基

*The identification was confirmed with standards; Glc-glucoside Rib-ribosyl Rha-rhamnoside GluA-glucuronic acid

A-空白血清正離子模式 B-含藥血清正離子模式 C-空白血清負(fù)離子模式 D-含藥血清負(fù)離子模式

表2 復(fù)方芩蘭口服液在大鼠體內(nèi)的入血成分鑒定結(jié)果

Table 2 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat plasma

峰號(hào)tR/min分子式準(zhǔn)分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結(jié)果實(shí)測(cè)值理論值 M1 7.04C8H14O4[M－H]?173.080 1173.081 4?7.51 連翹酸 M211.37C20H30O12[M－H]?461.164 5461.165 9?3.04443, 163, 135連翹酯苷E M311.98C15H16O10[M－H]?355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-4-O-β-D-葡萄糖醛酸 M412.65C15H16O10[M－H]?355.067 5355.066 52.81179咖啡酸-3-O-β-D-葡萄糖醛酸 M515.25C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷 M617.47C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷 M717.65C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷 M819.09C21H18O11[M－H]?445.078 4445.077 12.92269, 891黃芩苷 M919.68C21H18O11[M－H]?445.074 1445.077 1?6.74269黃芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1020.19C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4?0.22285漢黃芩素-5-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 M1120.86C22H20O11[M＋H]+461.108 3461.108 4?0.22285漢黃芩苷 M1220.94C21H18O11[M－H]?445.078 4445.077 12.92269, 891黃芩素-6-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

3.1.3 組織分布成分鑒定 對(duì)照組和給藥組大鼠各組織樣本在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖3，共鑒定3個(gè)原型成分和3個(gè)代謝產(chǎn)物（表3）。發(fā)現(xiàn)肝臟、肺臟、腎臟是復(fù)方芩蘭口服液的主要作用器官，其中的代謝成分主要經(jīng)I相代謝反應(yīng)中的水解和II相代謝反應(yīng)中的葡萄糖醛酸化形成。通過對(duì)復(fù)方芩蘭口服液的化學(xué)成分和體內(nèi)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中的多種咖啡?？鼘幩犷惓煞郑S芩苷、漢黃芩苷及其相應(yīng)的苷元、連翹酯苷E和連翹酸-1′-- β-葡萄糖苷是其進(jìn)入大鼠血液和組織的主要成分，可能是復(fù)方芩蘭口服液的潛在活性成分。

A-空白組織正離子模式 B-含藥組織正離子模式 C-空白組織負(fù)離子模式 D-含藥組織負(fù)離子模式

表3 復(fù)方芩蘭口服液于大鼠各器官組織中吸收成分鑒定結(jié)果

Table 3 Analysis of absorbed components of Fufang Qinlan Oral Liquid in rat organ tissue

峰號(hào)tR/min分子式準(zhǔn)分子離子m/z誤差(×10?6)碎片離子鑒定結(jié)果分布器官實(shí)測(cè)值理論值 M′111.37C20H30O12[M－H]?461.166 2461.165 90.65315, 205連翹脂苷E心、肺 M′212.35C16H18O9[M－H]?353.084 7353.087 3?7.37191, 179綠原酸肺 M′317.16C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-5,6-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′417.42C27H26O17[M－H]?621.109 0621.109 2?0.32445, 269黃芩素-6,7-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′519.45C28H28O17[M－H]?635.122 1635.124 8?4.25459漢黃芩素-5,7-二葡萄糖醛酸苷肝、腎 M′620.92C22H20O11[M＋H]+459.093 5459.092 71.74445, 268漢黃芩苷心、肺、腎

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.2.1 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以檢索得到的已知靶點(diǎn)為基礎(chǔ)分別構(gòu)建各目標(biāo)成分和各適應(yīng)證的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見表4。由于綠原酸和新綠原酸，異綠原酸B和異綠原酸C分別為對(duì)映異構(gòu)體，檢索結(jié)果和所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)均相同。連翹酸-1′--β-葡萄糖苷在數(shù)據(jù)庫(kù)中無法檢索到相關(guān)靶點(diǎn)，因此選擇其在體內(nèi)代謝得到的苷元進(jìn)行靶點(diǎn)檢索。

分別對(duì)各目標(biāo)成分PPI與各適應(yīng)證PPI取交集，以degree值中位數(shù)的2倍為卡值得到的單一化合物與適應(yīng)證之間的核心靶點(diǎn)。由于核心靶點(diǎn)仍然數(shù)量眾多，所構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)過于復(fù)雜，進(jìn)行通路分析缺乏針對(duì)性。因此選擇degree值排名前10%的靶點(diǎn)分別構(gòu)建復(fù)方芩蘭口服液各適應(yīng)證的“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)。具體見圖4。外圈藍(lán)色靶點(diǎn)僅與少數(shù)化合物相關(guān)（≤3），而內(nèi)圈黃色靶點(diǎn)均受到多個(gè)目標(biāo)成分調(diào)控（＞3），為復(fù)方芩蘭口服液的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

表4 各PPI網(wǎng)絡(luò)所得靶點(diǎn)及相互作用數(shù)量

Table 4 Number of targets and interactions of each PPI network

PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)數(shù)量靶點(diǎn)間相互作用數(shù)量PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)數(shù)量靶點(diǎn)間相互作用數(shù)量 黃芩苷176527 112隱綠原酸297935 094 黃芩素6386136 250異綠原酸A372553 688 漢黃芩苷7567473異綠原酸B（異綠原酸C）333642 575 漢黃芩素6942147 508咳嗽114818 440 連翹酸119917 259發(fā)熱314369 304 連翹酯苷E7606546感冒279664 997 綠原酸（新綠原酸）309239 169咽痛200637 058

A-感冒 B-發(fā)熱 C-咳嗽 D-咽痛，代表化合物 代表靶點(diǎn)

3.2.2 通路富集及分析 對(duì)復(fù)方芩蘭口服液調(diào)控感冒、發(fā)熱、咳嗽、咽痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別進(jìn)行通路富集，并對(duì)4種適應(yīng)證均相關(guān)的作用通路進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見表5。提示復(fù)方芩蘭口服液的作用通路主要與炎癥和免疫密切相關(guān)[6-10]。

3.2.3 生物學(xué)驗(yàn)證 各組大鼠肺臟中3個(gè)HSP系列蛋白的表達(dá)水平見表6。結(jié)果表明模型大鼠肺臟中HSPA8和HSP90AB1的mRNA表達(dá)水平較正常大鼠顯著上升（＜0.05），HSP90AA1也有一定的上升趨勢(shì)，提示了大鼠肺部出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，咳嗽和炎癥的復(fù)合模型造模成功。給予復(fù)方芩蘭口服液后，以上3個(gè)指標(biāo)均出現(xiàn)了極顯著上調(diào)（＜0.01），且程度均優(yōu)于臨床常用止咳藥孟魯司特鈉咀嚼片。說明HSP系列蛋白可能是復(fù)方芩蘭口服液發(fā)揮消炎止咳作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表5 復(fù)方芩蘭口服液主要作用靶點(diǎn)和通路

Table 5 Primary targets and pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid

主要作用通路主要作用靶點(diǎn) estrogen signaling pathwayHSPA8, HSP90AA1, HSP90AB1, ESR1, EGFR, AKT1, GRB2 prostate cancerHSP90AA1, HSP90AB1, EP300, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, EGFR PI3K-Akt signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, CDK2, MDM2, AKT1, GRB2, IKBKG, YWHAZ, EGFR, FN1, BRCA1 pathways in cancerNTRK1, HSP90AA1, HSP90AB1, HDAC1, EGFR, CASP3, TRAF6, CDK2, MDM2, AKT1, EP300, GRB2, IKBKG cell cycleHDAC1, CDK2, MDM2, CUL1, EP300, YWHAZ, MCM2 NOD-like receptor signaling pathwayHSP90AA1, HSP90AB1, TRAF6, IKBKG

表6 各組大鼠肺臟中HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1的mRNA表達(dá)水平

Table 6 mRNA Expression of HSPA8, HSP90AA1 and HSP90AB1 levels in rats lung of each group

組別相對(duì)表達(dá)量 HSPA8HSP90AA1HSP90AB1 對(duì)照1.11±0.261.49±0.451.04±0.41 模型1.19±0.18#1.58±0.411.13±0.38# 復(fù)方芩蘭口服液1.50±0.35**2.20±0.50***1.34±0.25*** 陽性對(duì)照1.43±0.53*1.61±0.631.13±0.38*

與對(duì)照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

#< 0.05control group；P < 0.05**< 0.01***< 0.001model group

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)外成分進(jìn)行研究。取樣時(shí)間點(diǎn)上考察了0.5、1、2、4、6 h多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)給藥后2 h在大鼠的血清和組織樣本中可檢測(cè)到的移行成分最多，故將其作為最佳的采樣時(shí)間點(diǎn)。樣本處理方法比較了甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白及沉淀蛋白后采用醋酸乙酯進(jìn)行萃取等處理方式，結(jié)果均不理想，最終采用本實(shí)驗(yàn)的處理方法。樣本分析所采用的UPLC-Q- TOF-MS結(jié)合MSE技術(shù)能夠通過一次數(shù)據(jù)采集獲得高精確度和高分辨率的全部母離子與碎片離子信息，從而較為全面、真實(shí)、快速的定性大鼠血液和組織樣本中的移行成分。

給藥后在大鼠的血清中共鑒定3個(gè)原型成分和9個(gè)代謝產(chǎn)物，組織樣本中共鑒定3個(gè)原型成分和3個(gè)代謝產(chǎn)物。通過與單味藥材圖譜進(jìn)行對(duì)比，其中咖啡酸葡萄糖醛酸由多種咖啡?？鼘幩犷惓煞执x得到，和綠原酸一起主要來自金銀花。連翹酸和連翹酯苷E來自連翹。黃芩苷、漢黃芩苷及其苷元的多種葡萄糖醛酸產(chǎn)物來自黃芩。多項(xiàng)藥理研究表明這些成分具有廣泛的抗炎、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[11-18]，可能是復(fù)方芩蘭口服液辛涼解表、清熱解毒的潛在活性成分。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明復(fù)方芩蘭口服液可以通過多通路多靶點(diǎn)發(fā)揮療效，通過富集分析發(fā)現(xiàn)主要的作用通路多包含HSP系列蛋白。在熱休克蛋白家族中，HSP90具有特殊的分子伴侶功能。其廣泛參與了眾多細(xì)胞增殖和調(diào)亡的信號(hào)調(diào)控，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。HSP90可以和受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIP）相互作用并使其穩(wěn)定。RIP在腫瘤壞死因子α的刺激下結(jié)合到腫瘤壞死因子受體上，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子[19]。因此推測(cè)HSPA8、HSP90AA1和HSP90AB1可能是復(fù)方芩蘭口服液發(fā)揮抗炎作用的重要靶點(diǎn)，并且在大鼠咳嗽和炎癥的復(fù)合模型中得到證實(shí)。

本研究首次對(duì)復(fù)方芩蘭口服液的體內(nèi)外成分進(jìn)行分析，并在明確潛在活性成分的基礎(chǔ)上首次構(gòu)建了相關(guān)適應(yīng)證的“化合物-靶點(diǎn)”作用網(wǎng)絡(luò)，初步揭示其主要作用靶點(diǎn)及通路。研究結(jié)果為揭示復(fù)方芩蘭口服液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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andcomponent analysis and network pharmacology study of Fufang Qinlan Oral Liquid

XU Ya-jing1, YUE Xin-yi1, GE Yi-meng2, SHEN Long-hai1, WU Tong1, LI Mo-ying1, 3

1.State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of PharmaceuticalIndustry, Shanghai 200437, China 2.Heilongjiang Zhenbaodao Pharmaceutical Co., Ltd., Hulin 158400, China 3.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Chiina

Liquid mass spectrometry was used to identify the chemical constituents of Fufang Qinlan Oral Liquid (復(fù)方芩蘭口服液) and its metabolites in rat.The maincomponents were selected for network pharmacological and the mechanism was initially revealed.Fufang Qinlan Oral Liquid, serum and tissue samples were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS combined with MSEtechnique, and the identification ofandcomponents were carried out with the information of precise molecular weight, retention time, fragment ions and neutral loss.Cytoscape software was used to construct the “compound-target” network between the maincomponents and the main clinical indications (cold, fever, cough and sore throat).Core targets and pathway analysis were also conducted, in which HSP90AA1, HSP90AB1 and HSPA8 were measured by realtime PCR.Three prototype components and nine metabolites were characterized in rat serum after ig administration, so as three prototype components and five metabolites in rat tissues.The metabolites were mainly glucuronide conjugates.The results of network pharmacology indicated that the pathways of Fufang Qinlan Oral Liquid were mainly related to inflammation and immunity.Compared with model rats, the expression of HSP90AA1, HSP90AB1, and HSPA8 was significantly increased after intragastric administration of Fufang Qinlan Oral Liquid (＜0.01).Thecomponents were preliminarily analyzed after oral administration of Fufang Qinlan Oral Liquid by UPLC-Q-TOF-MS and the network pharmacology study was then carried out, which initially clarified the targets and pathways.The studies provided scientific basis for pharmacodynamic material basis and mechanism of Fufang Qinlan Oral Liquid.

Fufang Qinlan Oral Liquid; UPLC-Q-TOF-MS;metabolite; network pharmacology; “compound-target” network

R284.1

A

0253 - 2670(2022)09 - 2623 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.004

2021-11-12

許雅婧，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯帉W(xué)專業(yè)。E-mail:1796958002@qq.com

通信作者：李默影，女，博士，從事天然藥物活性成分及作用機(jī)制研究。E-mail: wuweisong2009@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]