超聲處理對(duì)藜麥分離蛋白功能特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響

尹麗莎,朱瑩瑩,2,3,董吉林,2,3,申瑞玲,2,3

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

0 引言

藜麥，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的中高海拔山區(qū)，作為印第安人的一種傳統(tǒng)主食，具有營(yíng)養(yǎng)素均衡、易熟、易消化等特點(diǎn)。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)認(rèn)定藜麥?zhǔn)强梢詽M足人類(lèi)所需全部營(yíng)養(yǎng)的單作物糧食，其蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸比例均衡，且包含人體所需的全部必需氨基酸[1]。與大多數(shù)谷物相比，藜麥蛋白的品質(zhì)更接近乳類(lèi)和肉類(lèi)，是一種優(yōu)質(zhì)可持續(xù)性的植物蛋白資源[2]，可作為食品工業(yè)的功能性成分原料，生產(chǎn)可食用的薄膜、飲料、醬汁、香腸等[3]。

藜麥蛋白的功能特性決定了其應(yīng)用前景。研究表明[4]，藜麥蛋白表現(xiàn)出良好的乳化穩(wěn)定性，但其乳化能力較差，且溶解性不佳。目前，有多種物理技術(shù)被用于改性植物蛋白，以改善其功能特性。其中，超聲處理是一種常用的食品大分子改性技術(shù)，具有高效、綠色、可持續(xù)等特點(diǎn)。孫燕婷等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理(功率為500 W)大豆蛋白5 min，能夠顯著提高其溶解性和乳化活性；徐珍霞等[6]利用超聲技術(shù)對(duì)亞麻籽蛋白進(jìn)行改性發(fā)現(xiàn)，超聲處理(功率為360 W)亞麻籽蛋白乳液30 min，可明顯提高其穩(wěn)定性及凝膠特性。此外，超聲處理對(duì)植物蛋白微觀結(jié)構(gòu)也有一定影響：望運(yùn)滔等[7]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲改性處理后的鷹嘴豆蛋白的α-螺旋含量升高、β-折疊含量降低；A.Vera等[8]使用超聲技術(shù)改性藜麥蛋白后發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度(功率>500 W)超聲處理雖能改變藜麥蛋白結(jié)構(gòu)，降低其平均粒徑，但卻容易形成較大蛋白聚集體顆粒，增加藜麥蛋白濁度。

鑒于此，本研究擬以藜麥為原料，采用傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取藜麥分離蛋白(QPI)，研究功率為500 W的中強(qiáng)度超聲處理對(duì)QPI功能特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為藜麥蛋白的加工和應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

藜麥(青藜2號(hào))，青海省農(nóng)科院提供；花生油，山東魯花集團(tuán)有限公司產(chǎn)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、HCl、NaOH等試劑，均為分析純，購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

D5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘怡實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)；K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司產(chǎn)；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)；SB-25-12D型超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)；Multiskan GO1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)；S3500型激光粒度儀，美國(guó)Microtrac公司產(chǎn)；JSM-76490LV型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本JEOL公司產(chǎn)。

1.3 QPI的提取和超聲處理

1.3.1QPI的提取將藜麥烘干、磨粉后過(guò)60目篩，備用。參考畢爽等[9]的傳統(tǒng)堿溶酸沉法，主要提取步驟是：將藜麥粉分散于水中(m(藜麥粉/g)∶V(水/mL)=1∶12)，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，于35 ℃條件下振蕩提取2.0 h后，靜置1.0 h，于4000 r/min條件下離心20 min，取上清液；用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)上清液pH值至4.5，靜置4.0 h，于4000 r/min條件下離心20 min，得到藜麥蛋白沉淀；將藜麥蛋白沉淀用蒸餾水反復(fù)水洗至中性，冷凍干燥后粉碎，即得QPI，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2QPI的超聲處理將提取的QPI粉末充分分散于蒸餾水中，制備QPI懸浮液(50 mg/mL)，于室溫下溫和攪拌過(guò)夜。對(duì)5組QPI懸浮液(100 mL)于室溫下用500 W超聲強(qiáng)度進(jìn)行超聲改性處理，將超聲處理時(shí)間分別設(shè)置為20 min、40 min、60 min、80 min和100 min。超聲處理后將樣品冷凍干燥，并于4 ℃冰箱保存，待用。

1.4 QPI的品質(zhì)分析

1.4.1QPI的純度測(cè)定根據(jù)GB 5009.5—2016[10]測(cè)定QPI的純度。

1.4.2QPI的蛋白組分測(cè)定參考田旭靜等[11]的方法測(cè)定QPI的蛋白組分。

1)清蛋白含量的測(cè)定。稱取1.0 g QPI，加入20 mL蒸餾水，于45 ℃條件下攪拌1.0 h后，于4000 r/min條件下離心20 min，取上清液，于25 mL容量瓶中定容，采用凱氏定氮法測(cè)定清蛋白含量；沉淀用蒸餾水洗滌后，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原料。

2)球蛋白含量的測(cè)定。向清蛋白提取后的沉淀中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的NaCl溶液20 mL，于45 ℃條件下攪拌1.0 h，后續(xù)操作同上，測(cè)得球蛋白含量；沉淀用蒸餾水洗滌后，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原料。

3)醇溶蛋白含量的測(cè)定。向球蛋白提取后的沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液20 mL，于50 ℃條件下攪拌30 min，后續(xù)操作同上，測(cè)得醇溶蛋白含量；沉淀用蒸餾水洗滌后，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原料。

4)谷蛋白含量的測(cè)定。向醇溶蛋白提取后的沉淀中加入0.05 mol/L 的NaOH溶液20 mL，于50 ℃條件下攪拌1.0 h，后續(xù)操作同上，測(cè)得谷蛋白含量；剩余蛋白即為不可溶蛋白。

1.5 QPI功能特性的測(cè)定

1.5.1 溶解度將各組樣品與去離子水(m(樣品/g)∶V(去離子水/mL)=1∶100)混合得到QPI懸浮液，并于室溫下攪拌1.0 h后，于3500 r/min條件下離心20 min，測(cè)定上清液蛋白含量。溶解度[12]計(jì)算公式如下：

溶解度=(W1×m1)/(W2×m2)×100%

其中，W1是上清液蛋白含量/%；m1是上清液質(zhì)量/g；W2是分離蛋白含量/%；m2是分離蛋白質(zhì)量/g。

1.5.2 持水性和持油性稱取0.5 g樣品置于10 mL離心管中，稱重，加入4 mL蒸餾水/花生油，漩渦振動(dòng)5 min使其混合均勻，室溫下靜置1.0 h后，于4000 r/min條件下離心20 min，將上清液移除。測(cè)樣品持水性時(shí)，用濾紙吸干離心管壁殘留水分，再稱重；測(cè)樣品持油性時(shí)，用濾紙吸干離心管壁殘留油滴，再稱重。持水性[13]和持油性[14]的計(jì)算公式均如下：

參數(shù)值=(W2-W1)/W0

其中，W0是蛋白質(zhì)量/g；W1是離心管和蛋白質(zhì)量/g；W2是去掉上清液后離心管和蛋白質(zhì)量/g。

1.5.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性取5 mL花生油和15 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的分離蛋白溶液，混勻，用均質(zhì)機(jī)于10 000 r/min條件下分散2 min；分散結(jié)束后，立即(0 min)從得到的溶液底部取50 μL乳濁液，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液，混勻，在波長(zhǎng)為500 nm處測(cè)其吸光度；10 min后，重復(fù)上述操作。乳化性和乳化穩(wěn)定性[15]的計(jì)算公式如下：

乳化穩(wěn)定性=A10/A0×100%

其中，A0是0 min時(shí)的吸光度；A10是10 min時(shí)的吸光度；θ是油相體積分?jǐn)?shù)，為0.25；C是蛋白樣品質(zhì)量濃度/(g·mL-1)。

1.6 QPI平均粒徑與分布的測(cè)定

參照C.M.Liu等[16]的方法，使用激光粒度儀對(duì)樣品的粒徑與分布進(jìn)行測(cè)定。

1.7 QPI微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用導(dǎo)電膠將超聲處理前后的QPI樣品(已凍干)粘附于金屬銅座上，置于真空噴鍍儀器內(nèi)，將樣品表面噴金使其導(dǎo)電[17]。采用SEM在低真空模式、20 kV電壓下對(duì)QPI樣品進(jìn)行掃描。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著差異分析(P<0.05)，采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 QPI的組成分析

QPI的近似組成如表1所示。實(shí)驗(yàn)所得QPI的純度為87.78%,高于王棐等[18]對(duì)QPI的提取純度78.30%，這可能與QPI提取工藝方法有關(guān)。QPI的組成分析結(jié)果顯示，總蛋白由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和不可溶蛋白組成，其中清蛋白和球蛋白含量較高，兩者含量之和高達(dá)60%以上，而醇溶蛋白和谷蛋白的含量較低，這與王棐[19]的研究結(jié)果一致。

表1 QPI的近似組成(濕重)Table 1 Approximate composition of QPI (wet weight) %

2.2 超聲處理對(duì)QPI功能特性的影響分析

2.2.1 超聲處理對(duì)溶解度的影響不同超聲處理時(shí)間對(duì)溶解度的影響如圖1所示。由圖1可以看出，超聲處理時(shí)間為20～60 min時(shí)，QPI的溶解度隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增高；超聲處理時(shí)間為60 min時(shí)，溶解度最高，達(dá)78.25%，這與謝為峰等[20]的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的構(gòu)象在超聲波的作用下發(fā)生改變，親水基團(tuán)暴露在外，與水分子結(jié)合能力增強(qiáng)，提高了蛋白質(zhì)的溶解度。但隨著超聲處理時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)(>60 min)，蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)破壞程度較大，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，溶解度降低[21]。

圖1 不同超聲處理時(shí)間對(duì)溶解度的影響Fig.1 The effect of different ultrasonic treatment time on solubility

2.2.2 超聲處理對(duì)持水性和持油性的影響持水性和持油性是食品加工中的重要特征和品控指標(biāo)。不同超聲處理時(shí)間對(duì)持水性和持油性的影響如圖2所示。由圖2可以看出，不同超聲處理時(shí)間對(duì)QPI的持水性和持油性的影響趨勢(shì)幾乎相同。QPI的持水性和持油性均隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，在超聲處理時(shí)間為20～60 min時(shí)增長(zhǎng)速率較快，在超聲處理時(shí)間為60～100 min時(shí)增長(zhǎng)速率緩慢但未停止，如果繼續(xù)延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間，QPI的持水性和持油性很有可能會(huì)超過(guò)未進(jìn)行超聲處理的QPI，這與張洪新[22]改性面筋蛋白的研究結(jié)果相似。這是因?yàn)樵诔暡ㄌ幚硐?，蛋白質(zhì)顆粒變小，組織疏松，比表面積增大；同時(shí)，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，埋藏在分子內(nèi)部的二硫基、疏水基等功能基團(tuán)暴露出來(lái)，使樣品吸附和結(jié)合脂類(lèi)物質(zhì)的能力更強(qiáng)，從而增強(qiáng)了QPI的持水性和持油性。

圖2 不同超聲處理時(shí)間對(duì)持水性和持油性的影響Fig.2 The effect of different ultrasonic treatment time on water holding capacity and oil absorbency capability

2.2.3 超聲處理對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響乳化性與通過(guò)蛋白質(zhì)分散體的最大油量有關(guān)，而乳化穩(wěn)定性則是指乳液抵抗變化并保持穩(wěn)定的能力。不同超聲處理時(shí)間對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，超聲處理時(shí)間為20～40 min時(shí)，QPI的乳化性低于未進(jìn)行超聲處理的QPI(4.938 m2/g)；超聲處理時(shí)間為60～100 min時(shí)，QPI的乳化性高于未進(jìn)行超聲處理的QPI，并隨著超聲處理時(shí)間的增加逐漸提高至5.773 m2/g；QPI的乳化性隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)顯著提高(P<0.05)，是未經(jīng)超聲處理組的1.2倍。QPI的乳化穩(wěn)定性在20 min時(shí)與未超聲處理組的穩(wěn)定性基本相同，沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，隨著超聲處理時(shí)間的增加(40～100 min)，QPI的乳化穩(wěn)定性都低于未經(jīng)超聲處理的QPI，但沒(méi)有明顯的變化規(guī)律。上述結(jié)果與孫筱[23]的高強(qiáng)度超聲處理對(duì)蕓豆蛋白理化和功能特性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。乳化體系的形成是疏水、親水基團(tuán)與油、水相互作用產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，隨超聲處理的持續(xù)進(jìn)行，蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白分子表面的疏水區(qū)暴露，增加了疏水基團(tuán)與油相的相互作用，故而可提高蛋白質(zhì)的乳化性。本研究顯示了較高的乳化性和良好的乳化穩(wěn)定性，這可能與藜麥品種和QPI提取方法有關(guān)。

圖3 不同超聲處理時(shí)間對(duì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of different ultrasonic treatment time on emulsification and emulsification stability

2.3 超聲處理對(duì)QPI平均粒徑與分布的影響

不同超聲處理時(shí)間下QPI的平均粒徑與分布如表2所示。由表2可知，未進(jìn)行超聲處理的QPI的平均粒徑為190.40 μm，而超聲處理能顯著降低QPI的平均粒徑：超聲處理僅20 min時(shí)，QPI的平均粒徑即顯著降低(P<0.05)，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，平均粒徑持續(xù)降低，但降幅較小，變化不明顯(P>0.05)。該結(jié)果與李弓中等[24]在研究超聲波處理蛋清蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。這可能是由于超聲波的空穴效應(yīng)使溶液形成湍流，湍流產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將蛋白顆粒打散[25]，從而使蛋白粒徑變小。

表2 不同超聲處理時(shí)間下QPI的平均粒徑與分布Table 2 Average particle size distribution of QPI under different ultrasonic treatment time

2.4 超聲處理對(duì)QPI結(jié)構(gòu)特征的影響分析

綜上所述，超聲強(qiáng)度為500 W，超聲處理時(shí)間為60 min時(shí)，QPI的性能最佳，也最節(jié)約能源。超聲處理前后QPI的SEM圖如圖4所示。由圖4可以看出，未進(jìn)行超聲處理的QPI的大小和形狀均不同，且表面較為平整。超聲處理60 min的QPI的微觀結(jié)構(gòu)變化顯著，蛋白質(zhì)小分子顆粒增多，蛋白質(zhì)分子發(fā)生一定的聚集，表面出現(xiàn)一定的褶皺，這可與平均粒徑分析結(jié)果互相印證。

圖4 超聲處理前后QPI的SEM圖Fig.4 SEM of QPI before and after ultrasound treatment

3 結(jié)論

本文以藜麥為原料，采用傳統(tǒng)堿溶酸沉法提取QPI，研究中強(qiáng)度超聲處理(功率為500 W)對(duì)其功能特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：中強(qiáng)度超聲處理60 min可獲得性能最佳的QPI，改善其溶解度，增強(qiáng)其持水性、持油性和乳化性，降低其平均粒徑，改變其結(jié)構(gòu)特征，使其結(jié)構(gòu)更致密均勻，表面出現(xiàn)不同程度的褶皺。本研究表明中強(qiáng)度超聲處理是改善QPI功能特性的有效方法，為藜麥蛋白在食品加工行業(yè)的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。