小麥啤酒上面啤酒酵母生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的條件優(yōu)化及其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

趙庭，姜琳，賈晶，付為，俞志敏

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034

0 引言

小麥啤酒是指以小麥芽(占麥芽總質(zhì)量40%以上)、大麥芽和水為主要原料，添加酒花后，經(jīng)上面啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵釀造而成的啤酒[1-2]，具有潔白細(xì)膩的泡沫、濃郁的香味、強(qiáng)烈的殺口力、適中的苦味、略酸的口感，備受廣大消費(fèi)者青睞[3]。小麥啤酒中富含酸類(lèi)、脂類(lèi)、酚類(lèi)、高級(jí)醇類(lèi)、醛類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)[4-5]，其中，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(4-VG)能夠賦予小麥啤酒特有的丁香味和草藥香[6-9]，是小麥啤酒中不可或缺的風(fēng)味物質(zhì)，也是影響小麥啤酒成品香氣形成的關(guān)鍵組分[10]。

阿魏酸主要存在于大麥芽和小麥芽的外層，特別是在富含阿拉伯木聚糖的糊粉層，其含量最為豐富。在小麥啤酒釀造過(guò)程中，麥芽中的阿魏酸從阿拉伯木聚糖聚合物中釋放出來(lái)[11]，酚類(lèi)異味(POF+)上面啤酒酵母菌株利用苯丙烯酸活性脫羧酶(PAD1)將其脫羧生成4-VG[12]。小麥啤酒中4-VG的含量受酵母菌種、原料組成、糖化工藝和發(fā)酵工藝的影響[13]。崔云前[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醪化液的溫度為37 ℃時(shí)，有利于肉桂酰酯酶溶出，進(jìn)而促進(jìn)阿魏酸釋放，使4-VG的合成量達(dá)到最大值；小麥啤酒中4-VG的最佳質(zhì)量濃度為2.0～3.0 mg/L，這既能突出小麥啤酒中特有的丁香味，也不至于使香味太過(guò)濃郁。張崇真[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在原料中添加10%的淺色焦香麥芽時(shí)，肉桂酰酯酶的活性最高，4-VG的含量最大。吳幼茹等[15]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)添加淺色焦香麥芽可以增加小麥啤酒的整體香味和品質(zhì)，但用量過(guò)多會(huì)掩蓋小麥啤酒的清涼感。成冬冬[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加芫荽籽和陳皮后，比利時(shí)小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度可達(dá)3.512 mg/L，德國(guó)小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度可達(dá)3.690 mg/L。

近年來(lái)，小麥啤酒日益受到消費(fèi)者喜愛(ài)，為了釀造口感更好的小麥啤酒，勢(shì)必要不斷優(yōu)化其釀造工藝。上面啤酒酵母WA-04(SaccharomycescerevisiaeWA-04)是一種優(yōu)良的小麥啤酒釀造酵母，與其他上面啤酒酵母相比，其發(fā)酵速度較快，釀造的小麥啤酒醇酯比適中，風(fēng)味更好，丁香香氣更為突出[4]。基于此，本文擬以大麥芽和小麥芽為原料，選用上面啤酒酵母WA-04為發(fā)酵菌種，采用單因素試驗(yàn)研究小麥芽添加量、酵母接種量、發(fā)酵溫度對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化釀造工藝條件；構(gòu)建上面啤酒酵母合成4-VG的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，研究上面啤酒酵母合成4-VG過(guò)程中菌體與產(chǎn)物之間的動(dòng)態(tài)定量關(guān)系，以期更有效地控制小麥啤酒的發(fā)酵過(guò)程，為適當(dāng)增強(qiáng)小麥啤酒中的丁香風(fēng)味提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，為小麥啤酒的工業(yè)化釀造提供一定的技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥芽，煙臺(tái)帝伯仕啤酒技術(shù)有限公司產(chǎn)；大麥芽，中糧麥芽(大連)有限公司產(chǎn)；上面啤酒酵母WA-04，保存于大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心；4-VG，色譜純，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ZXSD-1270型恒溫生化培養(yǎng)箱、ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司產(chǎn)；CR21 G型超速冷凍離心機(jī)，通用醫(yī)療集團(tuán)有限公司產(chǎn)；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)；FC104型電子天平，上海精科天平有限公司產(chǎn)；BGT-12A型全自動(dòng)糖化儀，香港賽維斯科技有限公司產(chǎn)；IX73型倒置顯微鏡，奧林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥汁的制備稱(chēng)取100 g麥芽粉(m(小麥芽)∶m(大麥芽)=9∶11)加入糖化杯，再加入400 mL去離子水后，將糖化杯放入糖化儀進(jìn)行糖化，于45 ℃保溫30 min，以1 ℃/min升溫至63 ℃并保溫1 h，以1 ℃/min升溫至72 ℃并保溫10 min，以1 ℃/min升溫至78 ℃并保溫10 min，糖化結(jié)束。過(guò)濾麥汁，并用80 ℃去離子水洗糟，收集澄清麥汁。將澄清麥汁于100 ℃條件下煮沸60 min，其間分3次添加體積分?jǐn)?shù)為0.2%的酒花顆粒，煮沸結(jié)束后再次過(guò)濾麥汁，收集澄清麥汁，并將此次麥汁定型為12oP，備用。

1.3.2 酵母擴(kuò)培從斜面挑取適量上面啤酒酵母WA-04菌種，接種于50 mL麥汁培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h后，將其倒入500 mL麥汁培養(yǎng)基中，于20 ℃條件下二次擴(kuò)培48 h。二次擴(kuò)培結(jié)束后，于8000 r/min條件下離心10 min，收集酵母菌泥用于小麥啤酒的釀造。運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母菌泥的細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 小麥啤酒的釀造工藝量取1 L麥汁加入2 L三角瓶中，于121 ℃條件下滅菌15 min，冷卻至20 ℃，接種擴(kuò)培后的上面啤酒酵母WA-04，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h。

1.3.4 單因素試驗(yàn)研究小麥芽添加量(35%、40%、45%、50%和55%)、酵母接種量(0.5×107CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.5×107CFU/mL、2.0×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL)和發(fā)酵溫度(16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃和24 ℃)這3個(gè)主要影響因素對(duì)小麥啤酒(發(fā)酵120 h后)中4-VG質(zhì)量濃度的影響。當(dāng)單獨(dú)研究小麥芽添加量時(shí)，酵母接種量為1.5×107CFU/mL，發(fā)酵溫度為20 ℃；當(dāng)單獨(dú)研究酵母接種量時(shí)，小麥芽添加量為45%，發(fā)酵溫度為20 ℃；當(dāng)單獨(dú)研究發(fā)酵溫度時(shí)，小麥芽添加量為45%，酵母接種量為1.5×107CFU/mL。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用全因子中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究A(小麥芽添加量)、B(酵母接種量)和C(發(fā)酵溫度)的線性、交互作用和平方效應(yīng)，取Y(4-VG質(zhì)量濃度)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)優(yōu)化釀造工藝條件，表1為響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定1)生物量：采用干重法測(cè)定酵母生物量，小麥啤酒發(fā)酵過(guò)程中每24 h取樣一次，樣品于8000 r/min條件下離心10 min，用去離子水清洗1遍后收集菌體，并于105 ℃條件下烘干至恒重。

2)表觀濃度：采用密度法測(cè)定麥汁表觀濃度，樣品于8000 r/min條件下離心10 min，取上清液，利用密度瓶測(cè)定發(fā)酵液密度，換算后即得麥汁表觀濃度。

3)4-VG質(zhì)量濃度：采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度。色譜柱為C18柱(4.6 mm×15 cm×0.45 μm)，柱溫為20 ℃，進(jìn)樣量為5.0 μL，流速為0.6 mL/min，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm，流動(dòng)相為V(水)∶V(甲醇)∶V(磷酸)=64∶5∶1。

1.3.7 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建1)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型：采用Logistic方程描述酵母細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型[16]，即

Logistic方程能很好地反映發(fā)酵過(guò)程中酵母菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用，其圖像是一條典型的S曲線，可以用來(lái)擬合發(fā)酵過(guò)程中酵母的生長(zhǎng)。對(duì)Logistic方程積分的代數(shù)方程為

①

其中，μmax表示最大比生長(zhǎng)速率/ (h-1)，X表示生物量/(g·L-1)，X0表示初始生物量/(g·L-1)，Xmax表示最大生物量/(g·L-1)，t表示發(fā)酵時(shí)間/h。

2)4-VG生成動(dòng)力學(xué)模型：采用Luedeking-Piret方程描述小麥啤酒發(fā)酵過(guò)程中酵母生成4-VG的過(guò)程[17]，即

當(dāng)t=0，P0=0時(shí)，Luedeking-Piret方程可積分為代數(shù)方程：

②

其中，P表示4-VG質(zhì)量濃度/(mg·L-1)，α表示與菌體生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)物生成參數(shù)，β表示與非伴隨菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù)。當(dāng)α≠0，β=0時(shí)，為Ⅰ型偶聯(lián)關(guān)系；當(dāng)α≠0，β≠0時(shí)，為Ⅱ型偶聯(lián)關(guān)系；當(dāng)α=0，β≠0時(shí)，為Ⅲ型偶聯(lián)關(guān)系。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析；采用軟件Design-Expert 8.0 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析；采用軟件Origin 9.0進(jìn)行發(fā)酵動(dòng)力學(xué)非線性擬合與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 小麥芽添加量小麥芽添加量對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)小麥芽添加量為35%～45%時(shí)，隨著小麥芽添加量的增加，小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度逐漸增加，當(dāng)小麥芽添加量為45%時(shí)，4-VG質(zhì)量濃度最高，達(dá)到2.13 mg/L。這是因?yàn)樾←溠恐械乃苄园⒗揪厶呛扛哂诖篼溠?，在麥汁糖化和發(fā)酵過(guò)程中，可與水溶性阿拉伯木聚糖結(jié)合的阿魏酸被大量釋放合成4-VG。然而，當(dāng)小麥芽添加量繼續(xù)增加時(shí)，4-VG的質(zhì)量濃度開(kāi)始下降。較高水平的阿魏酸不一定會(huì)產(chǎn)生更高水平的4-VG，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的小麥芽水溶性成分(如酚酸、花青素、單寧等)會(huì)抑制酵母脫羧酶的活性，從而降低小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度。因此，選擇小麥芽添加量為45%作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖1 小麥芽添加量對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of wheat malt addition amount on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.1.2 酵母接種量酵母接種量對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，酵母接種量為0.5×107～1.5×107CFU/mL時(shí)，隨著酵母接種量的增加，小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度逐漸增加，當(dāng)接種量為1.5×107CFU/mL時(shí)，4-VG質(zhì)量濃度最高，達(dá)到2.15 mg/L。然而，可能是因?yàn)榘⑽核岷坑邢?，即使接種量進(jìn)一步增加，小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度也不會(huì)隨之再增加。因此，選擇酵母接種量為1.5×107CFU/mL作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖2 酵母接種量對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculation amount on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.1.3 發(fā)酵溫度發(fā)酵溫度對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為16～20 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，4-VG質(zhì)量濃度逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時(shí)，4-VG質(zhì)量濃度最高，達(dá)到2.16 mg/L。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度的升高導(dǎo)致苯基丙烯酸脫羧酶、酚酸脫羧酶和阿魏酰酯酶在上面啤酒酵母中的活性增加[12]。隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)升高，4-VG質(zhì)量濃度略有下降。因此，選擇發(fā)酵溫度為20 ℃作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸擬合，得到如下4-VG質(zhì)量濃度(Y)的回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

Y=2.25+0.049A-0.039B+0.010C+

0.012AB-0.040AC-0.005BC-0.29A2-

0.14B2-0.13C2

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析圖4所示響應(yīng)曲面圖直觀地反映了小麥芽添加量、酵母接種量和發(fā)酵溫度兩兩交互作用對(duì)4-VG質(zhì)量濃度的影響，曲面圖的曲面坡度越陡峭，等高線越趨近于橢圓，兩因素的交互作用越明顯[18-19]。由圖4可知，各響應(yīng)曲面圖均開(kāi)口向下，說(shuō)明在試驗(yàn)選擇的取值范圍內(nèi)，存在最佳點(diǎn)可使4-VG質(zhì)量濃度達(dá)到最大值。由圖4b)可知，交互項(xiàng)AC響應(yīng)曲面圖呈現(xiàn)規(guī)則的山丘狀，曲面傾斜程度最大，且等高線呈橢圓形，說(shuō)明小麥芽添加量和發(fā)酵溫度交互作用顯著，對(duì)4-VG質(zhì)量濃度影響最大。由響應(yīng)曲面圖的曲面坡度可知，AC和AB對(duì)4-VG質(zhì)量濃度的影響均大于BC，A對(duì)4-VG質(zhì)量濃度的影響大于B和C，這與方差分析結(jié)果基本一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)小麥啤酒中4-VG質(zhì)量濃度影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plots of the influence of the interaction of various factors on 4-VG mass concentration in wheat beer

2.3 最佳發(fā)酵工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

綜合考慮各因素的交互作用，根據(jù)二次多項(xiàng)回歸模型優(yōu)化得到最佳發(fā)酵工藝條件為：小麥芽添加量45.91%，酵母接種量1.38×107CFU/mL，發(fā)酵溫度20.05 ℃，此時(shí)，4-VG質(zhì)量濃度的理論值為2.25 mg/L。為了便于試驗(yàn)操作，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為小麥芽添加量45.9%，接種量1.4×107CFU/mL，發(fā)酵溫度20.1 ℃。在該工藝條件下進(jìn)行小麥啤酒發(fā)酵的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終得到4-VG質(zhì)量濃度的實(shí)際值為2.30 mg/L，該結(jié)果與預(yù)測(cè)理論值接近，比崔云前[14]在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵中得到的4-VG質(zhì)量濃度(2.22 mg/L)略高。該發(fā)酵工藝釀造的小麥啤酒酯香濃郁，丁香味突出，具有典型的小麥啤酒香氣。

2.4 小麥啤酒發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)指標(biāo)變化分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下，小麥啤酒發(fā)酵過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)變化見(jiàn)圖5。由圖5可知，發(fā)酵過(guò)程中，酵母生物量逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵到96 h時(shí)，生物量達(dá)到最大值3.76 g/L，此后酵母生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，4-VG即同時(shí)開(kāi)始合成，且在72 h內(nèi)快速合成并在啤酒中大量積累。小麥啤酒一般發(fā)酵120 h左右，麥汁中的可發(fā)酵性糖即已消耗殆盡，酵母生物量不再增加，啤酒發(fā)酵結(jié)束；此時(shí)4-VG仍有少量合成，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵結(jié)束時(shí)啤酒酵母中仍具有一定量的活性脫羧酶。

圖5 小麥啤酒發(fā)酵過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)變化Fig.5 Related index in the fermentation process of wheat beer

2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型分析

2.5.1 酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型采用Origin 9.0軟件對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)值按公式①進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖6。酵母細(xì)胞干重(X)隨時(shí)間變化的函數(shù)為

由圖6可知，該方程的擬合值與試驗(yàn)值能較好地吻合，模型的R2=0.989，說(shuō)明Logistic方程可以很好地描述上面啤酒酵母WA-04的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

圖6 酵母細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型中試驗(yàn)值與擬合值Fig.6 The experimental value and predicted value of yeast growth kinetic model

2.5.24-VG的生成動(dòng)力學(xué)模型式①中，X0=0.89 g/L、Xmax=3.98 g/L、μmax=0.065 1/h，對(duì)產(chǎn)物4-VG生成曲線試驗(yàn)值按公式②采用Origin 9.0軟件進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 4-VG生成動(dòng)力學(xué)模型中試驗(yàn)值與擬合值Fig.7 The experimental value and predicted value of 4-VG production kinetic model

4-VG質(zhì)量濃度(P)隨時(shí)間的變化函數(shù)為

0.16ln[1-0.24(1-e0.065t)]

式中，α=1.22，β=0.002 8。由圖7可知，此方程的擬合值與試驗(yàn)值能較好地吻合，模型的R2=0.962，說(shuō)明Luedeking-Piret方程可以很好地描述小麥啤酒釀造過(guò)程中4-VG的生成動(dòng)力學(xué)，可以預(yù)測(cè)釀造過(guò)程中的4-VG產(chǎn)量。但β值遠(yuǎn)小于α值，幾乎等于0，因此，上面啤酒酵母WA-04生成4-VG的動(dòng)力學(xué)模型屬于Ⅰ型偶聯(lián)關(guān)系。

3 結(jié)論

本文通過(guò)小麥啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)可能影響4-VG質(zhì)量濃度的因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室小試研究，得到的小麥啤酒最佳釀造工藝條件為小麥芽添加量45.9%，酵母接種量1.4×107CFU/mL，發(fā)酵溫度20.1 ℃。在此條件下，釀造的小麥啤酒中4-VG的質(zhì)量濃度最高，為2.30 mg/L。構(gòu)建的上面啤酒酵母WA-04的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型及4-VG的生成動(dòng)力學(xué)模型表明，上面啤酒酵母WA-04生成4-VG的動(dòng)力學(xué)模型屬于Ⅰ型偶聯(lián)關(guān)系。后續(xù)還需對(duì)小麥啤酒進(jìn)行深入研究，在實(shí)驗(yàn)室小試釀造良好的基礎(chǔ)上，通過(guò)中試試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行放大驗(yàn)證，并對(duì)小試釀造確定的工藝條件進(jìn)行二次檢驗(yàn)，為口感醇厚、丁香味適度的高品質(zhì)小麥啤酒的工業(yè)化釀造提供一定的技術(shù)參考。