響應(yīng)面法優(yōu)化甜椒中維生素C的提取工藝

納紅菱 黃 榮

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/功能分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化與應(yīng)用四川省高校重點實驗室，四川成都 611130）

維生素 C（vitamin C，VC）又名 L-抗壞血酸（ascorbic acid），是一種己糖醛酸[1]，能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原代謝并保持正常生理功能[2]，具有防治缺鐵性貧血、心血管疾病，預(yù)防白內(nèi)障，抗癌[3]等功效。維生素C根據(jù)來源分為天然和合成兩大類，其中天然維生素C除保持合成維生素C的基本功效外，還含有黃酮、維生素P、類黃酮等多種活性成分，具有較高的抗氧化、提高免疫力、抗慢性疾病等功效[4]，其生物利用度比合成維生素C高35%。天然維生素C主要來源于水果蔬菜。

甜椒含有大量的多酚、黃酮類胡蘿卜素以及維生素類的抗氧化成分，可以預(yù)防癌癥、動脈粥樣硬化和其他與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病。甜椒中維生素C含量較高，被譽(yù)為“蔬菜之冠”[5]。目前對于果蔬中維生素C的研究并不多，缺乏果蔬中提取維生素C的方法，未見從甜椒中提取維生素C的方法。

維生素C的測量方法主要有化學(xué)發(fā)光法[6]、熒光法[7-8]、高效液相色譜法[9]、2，4－二硝基苯肼法[10]、碘量法[11]、紫外分光光度法[12]等，其中熒光法具有較高的靈敏度、穩(wěn)定性，且操作簡單。本研究采用單因素結(jié)合響應(yīng)曲面法優(yōu)化甜椒中維生素C的提取工藝，采用熒光法測量其含量，為天然維生素C的開發(fā)和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。甜椒于60℃烘干，粉碎過60目篩。

1.1.2 試劑。維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，由中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；偏磷酸、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、草酸、硼酸、鄰苯二胺、活性炭，均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備。主要包括熒光分光光度計（F-380型，天津港東科技股份有限公司）、數(shù)字酸度計（PHS-3CW型，上海般特儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（W5-100SP型，上海申生科技有限公司）、分析天平（FA2201N型，上海菁華科技儀器有限公司）、電熱恒溫干燥箱（202-1A型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取劑選擇。精密稱取4份5 g甜椒粉，依次加入20mL 0.03 g/mL偏磷酸-乙酸溶液（15 g偏磷酸+40mL冰乙酸）、10%鹽酸溶液、2%草酸溶液、10%鹽酸+2%草酸（體積比為2∶8），調(diào)節(jié) pH值為2，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

1.2.2 偏磷酸-乙酸提取甜椒中維生素C的單因素試驗。分別考察偏磷酸-乙酸溶液濃度、pH值、提取溫度、提取時間等4個因素對甜椒中維生素C提取量的影響。

精密稱取5份5 g甜椒粉，依次加入20mL濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 的偏磷酸-乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為2，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5 g甜椒粉，加入20 mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為1、2、3、4、5，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5g甜椒粉，加入20 mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為2，分別在溫度 20、25、30、35、40 ℃下水浴加熱 30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5 g甜椒粉，加入20mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調(diào)節(jié)pH值為2，分別在 25 ℃下水浴加熱 10、20、30、40、50min，分別測量提取量。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以偏磷酸-乙酸溶液濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，設(shè)計了三因素三水平響應(yīng)面試驗。試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化甜椒中維生素C提取工藝試驗因素與水平

1.2.3 維生素C提取量測定。維生素C本身不具有熒光，但在活性炭的作用下可將還原型維生素C氧化為氧化型維生素C，氧化型維生素C再和鄰苯二胺反應(yīng)可生成一種熒光化合物。若試樣中存在丙酮酸，丙酮酸和鄰苯二胺反應(yīng)也可產(chǎn)生熒光物質(zhì)，干擾維生素C的測定，因而在試驗中可加入硼酸和維生素C反應(yīng)形成絡(luò)合物測出空白值，以減少干擾。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備：精密稱取0.05 g維生素C，用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀釋到50mL。吸出10mL置于100mL容量瓶中，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋到100mL。再吸出50mL于100mL帶塞錐形瓶中，向錐形瓶中加入2 g活性炭，搖振2min，抽濾，濾液為標(biāo)準(zhǔn)氧化液。分別吸取20mL于2個50mL容量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)液和標(biāo)準(zhǔn)空白液。向標(biāo)準(zhǔn)空白液中加入5mL偏硼酸-乙酸鈉溶液，用水定容至50mL，放置于4℃冰箱，待測；向標(biāo)準(zhǔn)液中加入5mL 500 g/L乙酸鈉溶液，用水定容至50mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：準(zhǔn)確分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0mL置于10mL帶塞刻度試管中，用水定容至2.0mL。另外準(zhǔn)確吸取2.0mL標(biāo)準(zhǔn)空白液于10mL試管中。在暗室里迅速向各試管中加入5mL鄰苯二胺溶液，在25℃下反應(yīng)20min，在激發(fā)波長338 nm、發(fā)射波長420 nm處測其相對熒光強(qiáng)度值ΔF。得到回歸方程為：y=62.443x-144.51（R2=0.999 3）。維生素C標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度在2.8～11.5μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

樣品測定：量取一定體積的待測液，按上述方法測定樣品液的相對熒光強(qiáng)度值ΔF。根據(jù)樣品液熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線、回歸方程計算待測液中維生素C提取量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑確定

提取劑為0.03 g/mL偏磷酸-乙酸溶液（15 g偏磷酸+40mL冰乙酸）、10%鹽酸溶液、2%草酸溶液、10%鹽酸+2%草酸（體積比2∶8），甜椒中維生素C提取量分別為 96.263、95.061、93.701、92.325mg/100 g。可以看出，以偏磷酸-乙酸溶液作為提取劑，維生素C提取量最高，故選擇偏磷酸-乙酸溶液作為提取劑。

2.2 單因素試驗

2.2.1 偏磷酸-乙酸溶液濃度對甜椒中維生素C提取的影響。偏磷酸-乙酸溶液濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL時，甜椒中維生素C提取量分別為93.263、95.325、94.061、91.701、90.745mg/100g。 可以看出，甜椒中維生素C提取量隨著偏磷酸-乙酸溶液濃度的增大呈先增大后減小趨勢，濃度為0.02 g/mL時提取效果最佳。

2.2.2 pH值對甜椒中維生素C提取量的影響。pH值為 1、2、3、4、5 時，甜椒中維生素 C 提取量分別為86.825、96.488、94.347、93.316、87.032mg/100 g。可以看出，甜椒中維生素C提取量隨著pH值的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，pH值為2時提取效果最佳。

2.2.3 提取溫度對甜椒中維生素C提取量的影響。當(dāng)提取溫度為 20、25、30、35、40 ℃時，甜椒中維生素C 的 提 取 量 分 別 為 94.552、96.987、93.056、92.925、92.656mg/100 g?？梢钥闯?，甜椒中維生素C的提取量隨著溫度的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，提取溫度為25℃時提取效果最佳。

2.2.4 提取時間對甜椒中維生素C提取的影響。水浴加熱時間為 10、20、30、40、50min 時，甜椒中維生素 C 提取量分別為 89.813、95.704、96.166、92.945、90.522mg/100 g。可以看出，甜椒中維生素C的提取量隨著水浴加熱時間的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，提取時間為30min時提取效果最佳。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

利用軟件Design Expert10.0.7.b對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多項式回歸方程：維生素C提取量=95.09-1.01A+0.17B-0.12C+3.50AB-0.86AC+2.80BC-0.44A2-0.21B2-0.22C2。對回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化甜椒中維生素C提取工藝試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面法優(yōu)化甜椒中維生素C提取工藝的回歸模型方差分析結(jié)果

由表3可知，該回歸模型P=0.004 1＜0.05，說明回歸模型差異顯著；失擬項P=0.000 6＜0.05，說明失擬項也差異顯著。其方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.921 4，則表明模擬和實際值的擬合度較高，具有可信度；R2Adj為0.820 3，說明能夠較好地反映真實測定值。AB、BC的P值均小于0.05，說明其對甜椒中維生素C的提取含量影響顯著。 AC、A2、B2、C2的 P 值大于 0.05，說明其對甜椒中維生素C的提取含量沒有顯著影響。由表3中F值可知，各因素對甜椒中維生素C提取含量的影響程度依次為A＞C＞B。

響應(yīng)面能直接反應(yīng)各因子對響應(yīng)值影響的大小，從等高線圖中能看出最佳提取條件下各因子取值范圍。響應(yīng)面坡度反映了各因素對響應(yīng)值維生素C提取量的影響。如果坡度較為平緩，則說明處理條件變化不影響響應(yīng)值大小；反之，則響應(yīng)值對處理條件的改變非常明顯。從圖1～3可以看出，偏磷酸-乙酸溶液濃度和提取溫度的交互作用對維生素C提取量的影響最大，偏磷酸-乙酸溶液濃度和提取時間的交互作用對維生素C提取量的影響最小。

反應(yīng)條件優(yōu)化及模型驗證結(jié)果：用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化甜椒中維生素C的提取條件，結(jié)果表明從甜椒中提取維生素C的最優(yōu)條件為偏磷酸-乙酸溶液濃度0.02 g/mL、提取溫度25℃、提取時間30min，在此條件下甜椒中維生素C的提取量預(yù)測值為95.20mg/100 g。

3 結(jié)論

本文以甜椒為原料，采用單因素試驗和響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取甜椒中維生素C的工藝條件，得出甜椒中維生素C的最佳提取條件為：提取液為偏磷酸-乙酸、提取液濃度為0.02 g/mL、pH值為2、提取溫度為25℃、提取時間為30min，在此條件下維生素C提取量為97.34mg/100 g。該方法工藝簡單、經(jīng)濟(jì)、提取率較高，可為甜椒等果蔬中維生素C的開發(fā)利用提供參考。