MS培養(yǎng)基配方研究

蔡祖國 李桂榮 姜立娜 陳學進 周俊國

（河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

組織培養(yǎng)是植物生物技術(shù)的重要組成部分，一方面離體快繁、無病毒苗木生產(chǎn)、花藥和花粉培養(yǎng)等應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)帶來了較大的經(jīng)濟效益，另一方面組織培養(yǎng)也為植物細胞工程、基因工程、體細胞無性系變異篩選等技術(shù)操作搭建了平臺。MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最多的培養(yǎng)基種類之一，但此經(jīng)典配方在相關(guān)教材及文獻中經(jīng)常出現(xiàn)不同版本，甚至被誤引。究其原因：一是國內(nèi)相關(guān)文獻中培養(yǎng)基配方大多以化合物的質(zhì)量濃度進行標注，化合物種類及結(jié)晶水不同導致配方表中質(zhì)量濃度有差異；二是引用者無法獲得或沒有仔細閱讀MS培養(yǎng)基配方原文，沒有深入了解MS培養(yǎng)基的成分組成及濃度設(shè)置的基本內(nèi)涵，在轉(zhuǎn)載中誤引。本文對MS培養(yǎng)基這一經(jīng)典配方給予考證和解讀，以期為深入學習該經(jīng)典配方提供參考。

1 MS培養(yǎng)基配方考證

自1937年White建立第一個植物組織培養(yǎng)專用培養(yǎng)基以來，適用于不同研究目的和培養(yǎng)對象的培養(yǎng)基不斷出現(xiàn)，目前已經(jīng)有數(shù)十種組分各異的培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)基命名一般采用“命名人+發(fā)表年份”或“培養(yǎng)基代號+發(fā)表年份”的形式，例如White（1943年）培養(yǎng)基、Nitsch（1969 年）培養(yǎng)基[1]、B5（1968 年）培養(yǎng)基[2]、N6（1975 年）培養(yǎng)基等。 1962 年，Murashige和Skoog在Physiologia Plantarum上發(fā)表了文章，于是就有了MS培養(yǎng)基[3]。其礦物質(zhì)鹽基本配方如表1所示，其有機成分及配方為30 g/L蔗糖、10 g/L瓊脂、1 g/L乙二胺、2.00 mg/L甘氨酸、1～30 mg/L吲哚乙酸、0.04～10.00mg/L 激動素、100.00mg/L 肌醇、0.50mg/L煙酸、0.50mg/L鹽酸吡哆醇、0.10mg/L鹽酸硫胺素。

表1 礦物質(zhì)鹽配方

MS培養(yǎng)基源于對White培養(yǎng)基的改良，最初用于煙草愈傷組織培養(yǎng)。與低鹽的White培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基中的礦質(zhì)營養(yǎng)濃度顯著提高，特別是N、K含量的提高，促進了煙草愈傷組織細胞快速生長。

2 MS培養(yǎng)基配方解讀

2.1 MS培養(yǎng)基基本成分

MS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分可分為礦質(zhì)營養(yǎng)和有機營養(yǎng)兩大類。其中礦質(zhì)營養(yǎng)（表1）來源于14種化合物，種類豐富。礦質(zhì)營養(yǎng)中濃度＞0.5mmol/L的元素為大量元素，濃度＜0.5mmol/L的元素為微量元素。MS 培養(yǎng)基中大量元素包括 N、P、K、Ca、Mg、S 等，微量元素包括 B、Mn、Zn、I、Mo、Cu 等。 MS 培養(yǎng)基中有機組分包括蔗糖、維生素、甘氨酸和肌醇等植物離體培養(yǎng)基礎(chǔ)物質(zhì)，而瓊脂和植物生長調(diào)節(jié)劑等可根據(jù)培養(yǎng)方式和培養(yǎng)目的適當選用。從培養(yǎng)基基本成分可看出，MS培養(yǎng)基是一種營養(yǎng)全面、豐富的培養(yǎng)基。

2.2 MS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的濃度

從前人研究可以看出，MS培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的濃度可用質(zhì)量濃度或物質(zhì)的量濃度表示，而使用物質(zhì)的量濃度的好處是配制培養(yǎng)基時無須考慮無機鹽試劑中結(jié)晶水數(shù)量。一般情況下，在植物組織培養(yǎng)中使用mmol/L表示大量元素和有機物質(zhì)的濃度，而使用μmol/L表示微量元素、激素、維生素以及其他有機組分的濃度。在MS培養(yǎng)基礦質(zhì)營養(yǎng)中，N來源于NH4NO3和 KNO3，濃度為 60mmol/L；K 來源于 KNO3、KH2PO4和 KI，濃度約為 20 mmol/L；Ca、Mg、S、P 濃度范圍為1～3mmol/L；微量元素需求量少，過多易產(chǎn)生毒害，濃度范圍為0.1～100.0μmol/L。在MS培養(yǎng)基中，礦質(zhì)營養(yǎng)累計質(zhì)量濃度為4 633.33mg/L。因此，MS培養(yǎng)基是一種高鹽培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基配方中無機化合物的質(zhì)量濃度看似隨機，其實與營養(yǎng)元素的供應(yīng)及其物質(zhì)的量濃度存在一定關(guān)系，且各種元素物質(zhì)的量濃度多數(shù)為整數(shù)，體現(xiàn)了配方設(shè)計者獨具匠心。MS培養(yǎng)基中的有機營養(yǎng)組分均以質(zhì)量濃度標注，多數(shù)亦取整數(shù)，便于實際稱量，濃度范圍從以mg/L計量的維生素到以g/L計量的糖類不等。

2.3 MS培養(yǎng)基配方明細

為了更加清楚地呈現(xiàn)MS培養(yǎng)基的營養(yǎng)種類、營養(yǎng)成分提供形式及用量，在此充實了化合物名稱、分子量及物質(zhì)的量濃度等信息。MS培養(yǎng)基基本營養(yǎng)組分配方如表2、3、4所示。

表2 MS培養(yǎng)基中的大量元素配方

表3 MS培養(yǎng)基中的微量元素配方

在MS培養(yǎng)基配方中，營養(yǎng)元素分為大量元素、微量元素和有機成分三類。在配制MS培養(yǎng)基母液時，為了防止大量元素中的Ca2+和PO43-/SO42-混溶沉淀以及微量元素Fe2+被氧化成堿式硫酸鐵而沉淀，一般將鈣鹽單獨溶解，將鐵鹽配制成EDTA螯合鐵。因此，實際應(yīng)用中一般將MS培養(yǎng)基母液配制成大量元素（不含鈣鹽）、鈣鹽、微量元素（不含鐵鹽）、鐵鹽、有機營養(yǎng)5種，稱之為五液式，分開保存。

表4 MS培養(yǎng)基中的有機成分配方

3 結(jié)論與討論

MS培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中使用較多的培養(yǎng)基種類之一，至今已發(fā)展了許多改良版本。MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog在進行煙草組織培養(yǎng)時設(shè)計的，具有較高濃度的銨鹽和硝酸鹽，能為培養(yǎng)物快速生長提供充足營養(yǎng)，但對生長緩慢、無機鹽濃度要求低的植物材料生長不利，甚至造成銨鹽毒害。目前已有許多MS培養(yǎng)基改良配方，如為維持MS培養(yǎng)基的微量元素濃度，將MS培養(yǎng)基中大量元素濃度減半或減少到原來的3/4，出現(xiàn)1/2MS或3/4MS；或僅將大量元素中的硝酸銨和硝酸鉀濃度減半，或不添加硝酸銨，或用硝酸鈉替換硝酸銨，或用1.6倍濃度的硝酸鉀和0.5倍濃度的硝酸銨；或用FeEDDHA代替FeNaEDTA，以便于植物體吸收。此外，有時還根據(jù)植物對維生素濃度的需求，將MS培養(yǎng)基的維生素用LS、B5或Nitsch培養(yǎng)基中的維生素替代，或僅添加部分種類的維生素，以致MS培養(yǎng)基各種新版本不斷出現(xiàn)。近年來，隨著培養(yǎng)基制作工藝便捷化的需要，市場上推出了MS干粉培養(yǎng)基，就是將MS培養(yǎng)基各種組分進行脫水處理，便于保存和銷售，使用時按比例加水溶解即可。MS干粉培養(yǎng)基可以是全營養(yǎng)培養(yǎng)基，也可以是不添加蔗糖、瓊脂或維生素的改良版。

培養(yǎng)基制作環(huán)節(jié)多，操作不當有可能引起培養(yǎng)基組分在數(shù)量或質(zhì)量上發(fā)生改變，最終影響培養(yǎng)基配方忠實性。在培養(yǎng)基母液配制過程中，不同礦質(zhì)元素高濃度下混存容易出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，同時低價態(tài)鐵在光照和非密封狀態(tài)下容易氧化變質(zhì)。因此，常將大量元素母液濃度控制在10～20倍，將鈣鹽母液單獨配制，將鐵鹽溶解在EDTA溶液中避光保存。在培養(yǎng)基高溫滅菌、培養(yǎng)過程中，也容易引起MS培養(yǎng)基配方中有效營養(yǎng)成分的改變。汪良駒等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高溫滅菌降低了MS培養(yǎng)基的pH值，這可能與高溫滅菌下糖類物質(zhì)分解有關(guān)。陳永勤[5]研究認為，高溫滅菌后的MS培養(yǎng)基pH值降低，這與鐵鹽和其他微量元素發(fā)生了相互作用有關(guān)。Papathanasiou等[6]發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基光照下可溶性鐵濃度會發(fā)生較大變化。這些研究為保證MS培養(yǎng)基配方忠實性提供了參考。

MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的經(jīng)典配方，是初學者掌握培養(yǎng)基有關(guān)知識的典范，也是許多教科書收錄的重要內(nèi)容。在文獻參考中，初學者雖然發(fā)現(xiàn)不同參考資料中MS培養(yǎng)基配方表存在一定差異，但也無法辨別版本真?zhèn)危K因早期原始文獻難以查閱而不了了之。本文基于原始文獻，還原了MS培養(yǎng)基真實配方，對MS培養(yǎng)基配方中營養(yǎng)元素類別、供給形式及濃度設(shè)計進行了解讀，并對現(xiàn)存MS培養(yǎng)基的改良版及實踐操作中配方忠實性進行了探討，以期為初學者深入學習該經(jīng)典配方提供參考。同時，隨著信息獲取途徑的不斷拓展，許多經(jīng)典文獻也常被轉(zhuǎn)載成不同版本，廣大初學者一定要查閱經(jīng)典文獻的原著、原文，才能挖掘到其中內(nèi)涵，做到悟原理、獲真知。